Name: Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Leer paraffine-insluiting en dunne secties van microbiële biofilms voor genexpressie-analyse. Deze methode behoudt de oorspronkelijke morfologie en maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de NSF carrière AWARD 1553023 en NIH/NIAID award R01AI103369.

1. de groei van Pseudomonas aeruginosa kolonie Biofilms
<ol><li>Bereiding van Medium-dubbelgelaagde platen<ol>
<li>Bereiden van een 10 g/L trypton, 10 g/L agar (Zie Tabel van materialen) oplossing in gedeïoniseerd water.</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 20 minuten afkoelen tot 50-60 ° C in een waterbad.</li>
		<li>45 mL van de oplossing van de agar-trypton giet in een vierkante schotel van 100 x 100 mm (Zie Tabel van materialen) met behulp van een conische buis van 50 mL. De agar te stollen toestaan (~ 20-30 min). Giet een tweede, 15 mL laag bovenop de eerste laag. Laat 's nachts stollen, verwijderen van condensatie van eventueel door te vegen met een stofvrije tissue deksels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kolonie Biofilms spotten<ol>
<li>Strijk de stammen van belang uit diepvries voorraden op LB agar platen13 en broeden in het donker gedurende 12-16 uur bij 37 ° C en 80-100% relatieve vochtigheid.</li>
		<li>Voor elke stam of repliceren, kunt een één kolonie LB 2 mL beënten en incuberen in het donker gedurende 12-16 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.</li>
		<li>Sub cultuur door verdunning van 1:100 in frisse LB en broeden in het donker gedurende 2,5-3 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.</li>
		<li>Optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer meten en aanpassen met steriele pond te bereiken een celsuspensie met een OD500 nm van ~ 0,5.</li>
		<li>Afhankelijk van de gewenste kolonie grootte, Pipetteer 2.5-10 µL celsuspensie op een bord van de middellange-dubbelgelaagde (bereid in stap 1.1) en laat de vlek drogen voor ~ 20 min. verlaten het deksel petri ajar in de buurt van een open vuur drogen vergemakkelijken kan.</li>
		<li>Incubeer plek kolonies bij 25 ° C en 80-100% relatieve vochtigheid, in het donker voor tot 4 dagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van de kleefpoeders oplossing
<ol><li>Bereid de kleefpoeders oplossing op de dag van het oogsten van de steekproef. 37% formaldehyde (FA) in 1 x PBS om een eindconcentratie van 4% verdund FA. Let op: FA is vluchtig en giftig. Dragen van beschermende uitrusting en werken in een goed geventileerde zuurkast.</li>
	<li>Onmiddellijk vóór gebruik, ontbinden L-lysine hydrochloride in 4% FA (bereid in stap 2.1) bij kamertemperatuur tot een eindconcentratie van 50 mM L-lysine HCl.</li>
</ol>3. directe toepassing van fixeerspray op de kolonie Biofilm [Optional]
Opmerking: We hebben gevonden dat biofilm morfologie best behouden blijft wanneer de topagar wordt toegevoegd vóór de fixatie. Deze stap vormt echter ook een verandering in de omgevingscondities die de genexpressie kunnen beïnvloeden. Fluorescerende verslaggever expressiepatronen moeten daarom worden geverifieerd met behulp van een afzonderlijk protocol waarin de fixatie stap wordt uitgevoerd vóór de toevoeging van de topagar, zoals hier is beschreven.
<ol><li>Op de dag van fixatie, en werken in een goed geventileerde zuurkast, Pipetteer de fixeerspray bereid in stap 2 direct op het oppervlak van de agar rond de kolonie rand, zodat het bereiken van de kolonie periferie zonder het dompelen. Toepassing alleen als veel fixeerspray als nodig is om volledig omringen de kolonie, ongeveer 500 µL. laat de fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar.</li>
	<li>Zodra de fixeer volledig opgenomen in de kolonie en de omliggende media, ongeveer 20-30 min is, en resterende FA niet meer zichtbaar op de plaat is, herhaal stap 3.1. Laat deze fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar.</li>
	<li>Zodra de fixeer volledig opgenomen in de kolonie is en omliggende media Herhaal stap 3.1, ditmaal fixeerspray op het oppervlak van de kolonie direct toe te passen. Toestaan dat deze fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar, gaan naar stap 4 slechts immers kleefpoeders is geabsorbeerd en is niet meer zichtbaar op de plaat.</li>
</ol>4. overlay kolonies met Agar
<ol><li>Op de dag van fixatie, bereid een 10 g/L agar oplossing in gedeïoniseerd water en autoclaaf gedurende 10-20 minuten te ontbinden. Cool in een waterbad tot 50 ˚C.</li>
	<li>Giet voorzichtig 15 mL van de oplossing van de agar over het groeimedium en kolonie. Laat de agar een gel te vormen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten (figuur 1B).</li>
	<li>Gebruik een scherp scheermesje te snijden een vierkante, 3-laags chuck met de kolonie gelamineerd tussen de bovenste twee lagen. Als voorbereiding van meerdere monsters, ervoor zorgen dat elke chuck is teruggebracht tot een vergelijkbare grootte.</li>
	<li>Zachtjes verwijderen overtollige agar uit de kolonie-bevattende chuck.</li>
	<li>Te heffen de twee bovenste lagen van agar (met de kolonie) uit de buurt van de onderste laag van de chuck (Figuur 1 c), de vlakke kop van een spatel in 1 x PBS of water nat en zacht invoegen tussen de bovenste en onderste lagen. De gelaagde kolonie moet scheiden van de onderste laag. Wees voorzichtig niet te verstoren of de gelaagd kolonie buigen wanneer tillen vanuit zijn basis.</li>
</ol>5. fixatie
<ol><li>Werken in een goed geventileerde-zuurkast, onmiddellijk overdracht de gelaagd kolonie (dat wil zeggen, 2-laags chuck) in een insluiten cassette (Zie Tabel of Materials), aangeduid met een chemisch bestendige markering pen. Plaats de cassette insluiten in een glas dia mailer (zie tabel van materialen) met de fixeerspray bereid in stappen 2.1-2.2. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen in de insluiten cassette.</li>
	<li>Incubeer het monster in fixeerspray 's nachts in het donker bij kamertemperatuur.</li>
</ol>6. voorbeeld Processing: Buffer Wash, uitdroging, Clearing en infiltratie
<ol><li>Na overnachting fixatie, het monster twee keer in 1 x PBS voor elke 1 h te wassen. Voor de beste resultaten, automatiseren reagens homogenisering met behulp van de spin functie van een automatische weefsel-processor (zie tabel van materialen) ingesteld op een lage instelling. Als geen processor beschikbaar is, kan de verwerking handmatig worden uitgevoerd.</li>
	<li>Volg de buffer wassen door uitdroging door middel van een gesorteerde reeks van ethanol (EtOH) verdunningen in 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Dehydrateren in drie wasbeurten van 100% EtOH gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Schakel het gedehydrateerde monster in drie wast voor 100% oranje olie gebaseerde clearing agent (zie tabel van materialen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Infiltreren het gewiste monster tweemaal met gesmolten paraffine wax (Zie Tabel of Materials), verwarmd tot 55˚C, voor elke 2 h.</li>
</ol>7. steekproef inbedding
<ol><li>Vul een wassen mal met gesmolten paraffine opgewarmd tot 55 ˚C. Gebruik een verwarmde, platte spatel snel overbrengen van de geïnfiltreerde chuck van de insluiten cassette in de wax mal, ervoor te zorgen dat de chuck parallel aan de basis van de schimmel ligt. Vermijd overmatige druk op de chuck toe te passen. Wax mallen aangepaste 3-D afgedrukt kunnen worden, of zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Toestaan was te stollen 's nachts op 4 ˚C. Gegoten in de stevige wax monsters kunnen bij 4 ˚C voor onbepaalde tijd worden bewaard.</li>
	<li>Zodra de wax heeft verhard, accijnzen het monster uit de mal en trim de overtollige wax van rond het monster met een scheermesje. Laat de overtollige wax die zich uitstrekt van het ene uiteinde van het monster, parallel met het deurvlak afdelen, die kan worden gebruikt om de klem in de microtoom (Zie Tabel van materialen). Ook laat een omhulsel van was, ongeveer 1 mm dik, rond het monster en glad haar gezichten.</li>
</ol>8. segmenteren
<ol><li>Verwarm een waterbad tot 42 ˚C. Klem het monster in de microtoom met het oppervlak van de kolonie georiënteerde loodrecht op de rand van het blad (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Het monster op 50-µm intervallen inkorten tot de gewenste vliegtuig van de kolonie is bereikt, waaruit secties zullen worden verzameld.</li>
	<li>Snijd een lint van het gewenste aantal 10-µm dik secties gebruikend microtome ingesteld op een vectorafbeeldingsbestanden snelheid van 75-80 rpm en een hoek van de klaring van 6-10˚. Gebruik een boete-tipped verfkwast om het lint van het blad los te maken.</li>
	<li>Met behulp van een druppel water op het puntje van een pipet van Pasteur (bij voorkeur) of pincet, zachtjes overbrengen in het lint het waterbad. Wees voorzichtig om te voorkomen dat overlapping luchtbellen onder de sectie.</li>
	<li>Onmiddellijk een dia in het waterbad invoegt en plaats deze onder het lint onder een hoek van 45˚.</li>
	<li>Raak de smalle rand van het lint aan de dia, net onder de berijpte label. Het lint moet voldoen.</li>
	<li>Trek de dia uit het waterbad, aanpassen van de hoek tot loodrecht op het oppervlak van het water, en het toestaan van het lint te leggen plat tegen de dia over haar lengte. Vermijd overlapping van overtollig water onder het lint.</li>
	<li>Zachtjes staan de dia op een absorberende pluisvrije weefsel, wicking overtollig water uit de sectie.</li>
	<li>Leg de dia op een papieren handdoek en laat ze drogen bij kamertemperatuur 's nachts in het donker. Dia's kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ˚C in het donker.</li>
</ol>9. warmte-vaststelling rehydratie en montage
<ol><li>Verwarm een geëgaliseerd warmhoudplaat aan 45 ˚C. Verwarm de dia voor 30-60 min. De wax zal worden semi-gesmolten en plat tegen de dia.</li>
	<li>Voorzichtig opheffen van de dia uit de hete plaat en leg het plat op een gladde, geëgaliseerd, kamertemperatuur oppervlak, met behulp van zorg om ervoor te zorgen dat de gesmolten wax niet trekken aan weerszijden van de dia totdat de wax stolt (~ 1 min).</li>
	<li>Met behulp van een glas dia mailer,-wax dia's in vier wasbeurten van clearing agent voor 5 minuten elk, met behulp van een aspirator Büchner oplossing tussen de wasbeurten te verwijderen.</li>
	<li>De dia's drie keer wassen in 100% EtOH voor elke 1 min.</li>
	<li>De dia's in een gesorteerde reeks van ethanol in de omgekeerde volgorde van verwerking (95%, 70%, 50% en 25%) voor 1 min die elk gevolgd door twee 1-min wast in 1 x PBS hydrateren.</li>
	<li>Onmiddellijk het monteren van de secties in een medium Tris-gebufferd montage (Zie Tabel van materialen) en breng een dekglaasje aan, de invoering van luchtbellen vermijden. Toestaan montage middellange tot polymeriseren 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zodra polymeervorm, zegel het dekglaasje aan naar de dia met behulp van duidelijke nagellak. Verzegelde dia's kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd in het donker bij 4 ˚C.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li>
<li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li>
<li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).</li>
<li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-53833-9_3">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li>
<li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li>
<li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538(2017).</li>
<li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysogeny+at+mid-twentieth+century%3A+P1%2C+P2%2C+and+other+experimental+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li>
<li>Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li>
<li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments%3A+fixation+of+pure+actin+filament+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li>
<li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Paraffine-insluiting en dun-afdelen weefselsteekproeven is een klassieke histologische techniek die toelaat beeldvorming van micro-morfologische structuren en wordt vaak gebruikt op eukaryotische weefsels, en met enig succes is vereffend met microbiële monsters8 ,9. Terwijl cryoembedding voor sterke eigendomsvoorbehoud endogene en immunefluorescentie signaal zorgt, is het insluiten van paraffine over het algemeen beter als het biedt beter behoud van morfologie<s...

Meeste microben hebben de capaciteit om formulier biofilms, samengehouden gemeenschappen van cellen door zelf geproduceerde matrices. Biofilms kunnen worden gekweekt in vele soorten van fysieke setups, met verschillende regimes van nutriënten en substraat bepaling. Specifieke tests voor biofilm vorming neiging om opbrengst reproduceerbare meercellige structuren, en gemeenschappelijke platforms voor fylogenetisch divers soort de Gemeenschap of de macroscopische niveau in acht worden genomen. Wanneer microben zijn gegroeid als kolonies op solide medium onder een atmosfeer, macroscopische morfologie brengt informatie over de capaciteit voor de productie van de matrix en vaak correleert met andere eigenschappen 1,2,3. De interne architectuur van microbiële kolonies bieden ook aanwijzingen met betrekking tot de biofilm-specifieke chemie en fysiologie, maar moeizaam te karakteriseren. Recente toepassingen van cryoembedding en cryosectioning technieken aan bacteriële kolonies hebben ingeschakeld beeldvorming en visualisatie van specifieke kenmerken op ongekende resolutie 4,5,6. Studies met dierlijk weefsel hebben echter aangetoond dat paraffine insluiten biedt superieure behoud van morfologie in vergelijking met cryoembedding 7 en is gebruikt voor het visualiseren van bacteriën in weefsels 8,9. Daarom hebben we een protocol voor fixatie, paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie biofilms ontwikkeld. Hier beschrijven we de voorbereiding van Pseudomonas aeruginosa PA14 kolonie-biofilm dunne secties 10,11, maar we hebben ook met succes deze techniek toegepast om biofilms gevormd door de bacteriën Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, en Vibrio cholerae12.
Het proces van paraffine-insluiting en dun-afdelen biofilms volgt een eenvoudige logica. Ten eerste, de biofilms zijn ingekapseld in een laagje agar morfologie behouden tijdens de verwerking. Ten tweede, de ingekapseld-biofilms zijn ondergedompeld in een hechtmiddel aan dwarslijn macromoleculen en micromorfologie behouden. Deze zijn vervolgens gedehydrateerde met alcohol, gewist met een meer niet-polair oplosmiddel en vervolgens geïnfiltreerd met vloeibare paraffine. Zodra het geïnfiltreerd, worden de monsters ingebed in de wax blokken voor het segmenteren. Secties zijn gesneden, gemonteerd op dia's en vervolgens gerehydrateerd om hen terug te keren naar een meer oorspronkelijke staat. Vanaf dit punt, kunnen zij worden gekleurd of bedekt met montage medium voor microscopische analyse.
Dit protocol produceert dunne secties van microbiële biofilms geschikt voor histologisch analyse. Kolonie biofilm substructuren worden weergegeven als dunne secties opgesteld op basis van deze methode zijn beeld door de lichte microscopie. Biofilms kunnen ook worden gekweekt op media met fluorescerende vlekken specifiek voor afzonderlijke functies of gekleurd bij de rehydratie stap, onmiddellijk voorafgaand aan de montage (stappen 9.5-9.6). Ten slotte kunnen microben worden ontworpen om te produceren van fluorescente proteïnen in een constitutief of gereglementeerde mode waardoor in situ rapportage van de cel distributie of gen expressie binnen deze Gemeenschappen. We hebben deze methoden gebruikt om te bepalen van de kolonie biofilm diepte, cel distributie, verdeling van de matrix, groeipatronen en Spatio genexpressie.

<table><tbody><tr><td>5 3/4" Pasteur pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Koop bij universiteits biostores&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td>Koop bij universiteits biostores&nbsp;</td></tr><tr><td>Chemisch-bestendige markeerstift</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>Fabrikant: Leica</td></tr><tr><td>Klare nagellak&nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>Koop in de winkel</td></tr><tr><td>Congo Red Indicator Grade</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>Fabrikant: Alfa Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>Fabrikant: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered Mounting Medium (met DAPI)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 247 04</td><td>Fabrikant: Electron Microscopy Sciences</td></tr><tr><td>Inbeddingsvorm&nbsp;</td><td>********</td><td>********</td><td>3D geprint in huis</td></tr><tr><td>Inbeddingsvorm (commercieel)&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>Koop bij universiteits biostores&nbsp;</td></tr><tr><td>Fijn gepunte penseel</td><td>********</td><td>********</td><td>Koop in de winkel, schilderspenseel</td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes 60x22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>Glazen rehydratatie mailer&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>21043</td><td>20 dia mailer&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, op oranje olie gebaseerde clearing agent&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50 899 90150</td><td>Fabrikant: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, Inbedding Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>Microtoommessen met laag profiel</td><td>Fisher Scientific</td><td>22 210 048</td><td>Fabrikant: Sturkey&nbsp;</td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>Promo-pack</td></tr><tr><td>Micropipet tips&nbsp;</td><td>Zie opmerkingen sectie</td><td>Zie opmerkingen sectie</td><td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td></tr><tr><td>Microtoom&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>905200U/00016050</td><td>Model: HM355S, Fabrikant: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td><td>Ricca Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (paraffinewas)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>Fabrikant: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>Petri schotels vierkant 100x100x15mm</td><td>Laboratory Disposable Products&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride&nbsp;</td><td>EMD Chemicals&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>Onderdeel van fosfaat gebufferde zoutoplossing, bereid in huis&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P380-500</td><td>Onderdeel van fosfaat gebufferde zoutoplossing, bereid in huis&nbsp;</td></tr><tr><td>Mesjes&nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Koop bij universiteits biostores&nbsp;</td></tr><tr><td>Dia's warmer&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0865259</td><td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td></tr><tr><td>Natriumchloride&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>Onderdeel van fosfaat gebufferde zoutoplossing, bereid in huis&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>, Onderdeel van fosfaat gebufferde zoutoplossing, bereid in huis&nbsp;</td></tr><tr><td>Suprafrost histologie dia's&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel vlot waterbad&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0815797</td><td>Fabrikant: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td></tr><tr><td>Automatische weefselprocessor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>Model: STP120 weefselprocessor</td></tr><tr><td>Tryptone&nbsp;</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>T9012</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie biofilms voor microscopische analyse

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Afdelen via het insluiten van paraffine is een grotendeels gevestigde techniek in eukaryotische systemen. Wij bieden hier een methode voor de fixatie, insluiten, en segmenteren van intact microbiële kolonie biofilms gebruik van paraffine geperfundeerd. Aan te passen deze methode voor gebruik op de kolonie biofilms, we ontwikkelde technieken voor het behoud van elk monster op het substraat van de groei en het lamineren met een agar-overlayer, en lysine toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing. Deze optimalisaties verbeteren monster bewaring en het behoud van micromorphological functies. Monsters voorbereid op deze wijze zijn vatbaar voor dunne segmenteren en imaging door licht, fluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie. Wij hebben deze techniek toegepast om de kolonie biofilms van Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisen Vibrio cholerae. Het hoge niveau van detail zichtbaar in de monsters die zijn gegenereerd door deze methode, gecombineerd met verslaggever stam engineering of het gebruik van bepaalde kleurstoffen, spannende inzichten in de Fysiologie en de ontwikkeling van microbiële gemeenschappen kan bieden.

Deze methode genereert biofilm dun-secties waarin verschillende morfologische kenmerken en de zones van de genexpressie door DIC, fluorescentie microscopie en TEM beeld kunnen worden. Hoewel DIC geschikt zijn met behulp van een 40 X olie onderdompeling doelstelling kan voldoende zijn om te laten zien van sommige morfologische kenmerken (figuur 2E), we hebben gevonden dat fluorescentie microscopie van stammen ontworpen om constitutively express fluorescent pro...

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Het algemene doel van deze procedure is om paraffine-ingebedde biofilm-secties te genereren die kunnen worden gebruikt om de verdeling van genexpressie te beoordelen, zoals gerapporteerd door de productie van fluorescerende eiwitten binnen intacte inheemse morfologieën. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van microbiële gemeenschappen, zoals hoe de expressie van specifieke genen in de productie van exopolymere stoffen verdeeld is in de context van de inheemse biofilm-architectuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat het analyse van genexpressie mogelijk maakt binnen de bewaarde morfologie van biofilm-doorsneden terwijl het ook toegankelijk is voor downstream-behandelingen zoals het kleuren van specifieke kenmerken en hoge resolutie beeldvorming zoals confocale of elektronenmicroscopie.Na het bereiden van agar-tryptone oplossing volgens het tekstprotocol, gebruik een 50-milliliter conische buis om 45 milliliter van de oplossing in een 100-millimeter bij 100 millimeter vierkante schaal te gieten. Laat de agar ongeveer 20 tot 30 minuten stollen. Giet een tweede 15-millimeter laag bovenop de eerste laag en laat het dan een nacht stol

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.

Gist Colony integratiemethode

The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Bucher, T., et. al., Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. J. Vis. Exp.(2016)This video demonstrates the preparation of mature bacterial biofilm colonies for high-resolution imaging. It covers fixation, dehydration, mounting, and metal coating steps to preserve and visualize biofilm morphology.

Preparation of Bacterial Biofilm Colonies for Morphological Analysis

This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode te groeien en kwalitatief analyseren bacteriële biofilms op schimmeldraden door confocale en elektronenmicroscopie.

Een nieuwe methode voor Kwalitatieve Multi-schaal analyse van bacteriële biofilms op draadschimmelcel Koloniën met behulp van confocale en Electron Microscopy

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor het verzamelen, fixeren en onderhouden van mycoheterotrofe plantenmonsters, waarbij verschillende microscopietechnieken worden toegepast, zoals scanning- en transmissie-elektronenmicroscopie, licht-, confocale en fluorescentiemicroscopie om schimmelkolonisatie te bestuderen in plantenweefsels en zaden ontkiemd met mycorrhizaschimmels.

Microscopietechnieken voor het interpreteren van schimmelkolonisatie in mycoheterotrofe plantenweefsels en symbiotische kieming van zaden

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

De kolonievormende cel (CFC) assay is een in vitro assay waarin hematopoietische voorlopercellen vormen kolonies in een semi-vast medium. Een combinatie van kolonie morfologie, celmorfologie en flowcytometrie worden gebruikt om het vermogen van de voorouders te laten groeien en differentiëren langs de verschillende hematopoietische lijnen te beoordelen.

Colony Forming Cell (CFC) test voor humane hematopoietische cellen

Leer paraffine-insluiting en dunne secties van microbiële biofilms voor genexpressie-analyse. Deze methode behoudt de oorspronkelijke morfologie en maakt hoogresolutiebeeldvorming mogelijk.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Meer video's verkennen