Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Het algemene doel van deze procedure is om paraffine-ingebedde biofilm-secties te genereren die kunnen worden gebruikt om de verdeling van genexpressie te beoordelen, zoals gerapporteerd door de productie van fluorescerende eiwitten binnen intacte inheemse morfologieën. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van microbiële gemeenschappen, zoals hoe de expressie van specifieke genen in de productie van exopolymere stoffen verdeeld is in de context van de inheemse biofilm-architectuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat het analyse van genexpressie mogelijk maakt binnen de bewaarde morfologie van biofilm-doorsneden terwijl het ook toegankelijk is voor downstream-behandelingen zoals het kleuren van specifieke kenmerken en hoge resolutie beeldvorming zoals confocale of elektronenmicroscopie.

Na het bereiden van agar-tryptone oplossing volgens het tekstprotocol, gebruik een 50-milliliter conische buis om 45 milliliter van de oplossing in een 100-millimeter bij 100 millimeter vierkante schaal te gieten. Laat de agar ongeveer 20 tot 30 minuten stollen. Giet een tweede 15-millimeter laag bovenop de eerste laag en laat het dan een nacht stollen, en gebruik indien nodig een pluisvrij doekje om condensatie van de deksels te verwijderen.

Vervolgens, om biofilms van kolonies te spotten, na het kweken van een geïsoleerde enkele P.Aeruginosa kolonie uit een bevroren stock volgens het tekstprotocol, pipet 2,5 tot 10 microliters van de celsuspensie op een medium twee-laags plaat. Kolonies kunnen in het donker worden geïncubeerd bij 25 graden Celsius in 80 tot 100% relatieve luchtvochtigheid gedurende maximaal vier dagen. Giet voorzichtig 15 milliliter van de agar oplossing over het groeimedium en de kolonie en laat de agar bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten een gel vormen.

Gebruik vervolgens een scherp scheermes om een vierkant, drie-laags stuk te snijden met de kolonie gelamineerd tussen de bovenste twee lagen. Als u meerdere monsters bereidt, zorg er dan voor dat elk stuk op een vergelijkbare grootte wordt gesneden. Verwijder voorzichtig overtollig agar uit het kolonie-bevattende stuk.

Bevochtig vervolgens het platte hoofd van een spatel in PBS of water en steek het voorzichtig tussen de bovenste en onderste agarlagen. Breng onmiddellijk de gelamineerde kolonie over in een inbeddingscassette die is gelabeld met een chemisch resistente markeringspen. Plaats de inbeddingscassette in een glazen dia-verzenddoos die eerder bereide fixeervloeistof bevat.

Verwerk de monsters. Gebruik 1X PBS om ze twee keer gedurende één uur te wassen. Voor de beste resultaten, automatiseer reagenshomogenisatie met behulp van de lage instelling op de spinfunctie van een automatische weefselprocessor.

Om de monsters in te bedden, vul een wasvorm met gesmolten paraffine was verwarmd tot 55 graden Celsius, gebruik vervolgens een verwarmde platte spatel om snel de geïnfiltreerde stuk uit de inbeddingscassette over te brengen naar de wasvorm, en zorg ervoor dat het stuk parallel aan de bodem van de mal rust. Laat de was overnacht bij vier graden Celsius stollen. In vaste was gegoten monsters kunnen op deze temperatuur onbeperkt worden bewaard.

Zodra de was is gestold, snijdt u het monster uit de mal en gebruikt u een scheermes om overtollig was rond het monster te trimmen. Laat wat was uitsteken van het ene uiteinde van het monster dat kan worden gebruikt om het vast te klemmen in de microtoom. Het is belangrijk om het was-ingebedde monster zodanig te trimmen dat de vorm het verzamelen van gladde lineaire linten vergemakkelijkt.

Kleine onvolkomenheden in het trimmen kunnen artefacten in het lint produceren en de integriteit van de sectie aantasten. Vervolgens verwarmt u een waterbad tot 42 graden Celsius. Klem vervolgens het monster in de microtoom met de oppervlakte van de kolonie loodrecht op de rand van de mes.

Trim het monster in 50-micrometer intervallen totdat het gewenste vlak van de kolonie is bereikt van waaruit secties zullen worden verzameld met behulp van een microtoom ingesteld op een snijdersnelheid van 75 tot 80 RPM en een opruimingshoek van zes tot 10 graden. Snijd een lint van het gewenste aantal 10-micrometer dikke secties. Gebruik vervolgens een fijnpuntig penseel om het lint los te maken van het mes.

Nu, met een pincet of een druppel water aan het uiteinde van een Pasteur-pipet, brengt u het lint voorzichtig over naar het waterbad. Plaats onmiddellijk een dia in het waterbad en plaats het onder het lint op een hoek van 45 graden. Raak de smalle rand van het lint aan de dia net onder het matte label.

Het lint zou moeten hechten. Trek de dia uit het waterbad en pas de hoek aan zodat deze loodrecht staat op het oppervlak van het water waardoor het lint plat tegen de dia langs zijn lengte ligt. Vermijd het vangen van overtollig water onder het lint.

Leg de dia voorzichtig op een absorberend, pluisvrij weefsel dat overtollig water uit de sectie wegvoert. Leg vervolgens de dia op een papieren handdoek en laat deze in het donker bij kamertemperatuur overnacht drogen. Verwarm een genivelleerd heet plaatje tot 45 graden Celsius en plaats de dia gedurende 30 tot 60 minuten op de plaat.

De was wordt semi-gesmolten en plat tegen de dia. Til de dia voorzichtig van het hete plaatje en leg het plat op een gladde kamertemperatuuroppervlakte gedurende ongeveer een minuut tot de was is gestold. Zorg ervoor dat de gesmolten was niet naar beide kanten van de dia trekt.

Met de monsters in een glazen dia-verzenddoos, ontwas de dia's in vier wasbeurten van clearingmiddel gedurende vijf minuten elk. Gebruik een Buchner-aspirator om de oplossing tussen de wasbeurten te verwijderen. Gebruik 100% ethanol om de dia's drie keer gedurende één minuut elk te wassen.

Vervolgens, na het rehydreren van de dia's volgens het tekstprotocol, monteer de secties onmiddellijk in een tris-gebufferd montagemedium en breng een dekglas aan. De overlay agar rond de sectie reageert niet met het fixeermiddel, dus het hecht niet aan het