Visualisatie van DNA verdichting in cyanobacteriën door hoogspannings-Cryo-Elektronentomografie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van microbiologie, zoals hoe de DNA-structuur verandert tijdens de celcyclus van bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk is om de ultrastructuur van hele bacteriële cellen dicht bij de levende toestand te visualiseren op geschikte tijdstippen zonder enige aanvullende behandelingen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Chihong Song, een postdoc uit mijn lab, en Mako Hayashi, een afstudeerstudent uit het lab van Dr. Kaneko.

Begin met het kweken van cyanobacteriën op negen centimeter, gesteriliseerde BG-11 platen met 1,5% agar en 0,3% natriumthiosulfaat. Incubeer de platen bij 23 graden Celsius onder een 12-12 lichtcyclus met 50 micro-E licht per vierkante meter per seconde. Om de cellen te onderhouden, breng ze wekelijks over naar verse BG-11 agar platen.

Binnen een week verschijnen er groene banden in de culturen. Breng de groene klonters cellen over met behulp van een vlam-gesteriliseerde lus en strijk ze uit op de nieuwe plaat. Om DNA-verdichting te observeren, verzamel de cellen die zes dagen zijn gekweekt aan het einde van de lichtperiode.

Om de cellen van de plaat te verwijderen, voeg je één milliliter 0,2-molaire sucrose toe. Verzamel vervolgens de celsuspensie en herhaal de sucrose toevoeging en verwijdering tot de oplossing groen wordt. De kleurverandering geeft aan dat de meeste cellen zijn vrijgekomen.

Breng nu 500 microliter van de gesuspendeerde celsuspensie over naar een Microfuge buis en voeg Hoechst-kleurstof toe voor een eindconcentratie van één microgram per milliliter. Laat de cellen vervolgens 10 minuten in het donker incuberen. Draai vervolgens de cellen naar beneden, gooi het supernatant weg en suspendeer ze opnieuw in 10 microliter 0,2-molaire sucrose.

Breng vervolgens één microliter van de suspensie over naar een glazen plaatje, leg er een dekglas op en observeer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV-filter. Zoek met behulp van een 100 keer olie-immersie objectief naar bewijs van DNA-verdichting, wat in de meeste cellen zou moeten waarneembaar zijn. Bereid eerst het duikvriesapparaat voor.

Plaats vervolgens de vloeibare stikstofcontainer door de ethaancontainer en koelstaafbevestiging in te voegen. Vul vervolgens de container met vloeibare stikstof en koel deze af tot vloeibare stikstoftemperatuur. Laad daarna ethaan gas in de container.

Zorg ervoor dat u veiligheidsbril draagt, omdat vloeibaar ethaan explosief is. Verwijder ten slotte de koelstaafbevestiging en dek de container af met een plastic deksel om bevriezing te voorkomen. Om verder te gaan, ontlaad je de koolstofzijde van een koolstofgecoat EM-rooster gedurende 30 seconden bij 50 milliamps met behulp van een plasma-ionenbarrière.

Bereid vervolgens de Vitrobot volgens het testprotocol voor. Gebruik pincetten om het voorbehandelde EM-rooster in de kamer te plaatsen. Behandel het EM-rooster met één microliter, 15-nanometer BSA-goudtracer om als fiducial marker te dienen voordat je het monster aanbrengt.

Breng nu 2,5 microliter celsuspensie op het rooster aan. Verwijder eventueel overtollig oplossing met filterpapier en bevries het rooster onmiddellijk in vloeibaar ethaan. Bewaar het bevroren rooster in vloeibare stikstof tot ze kunnen worden onderzocht.

Start vervolgens de HVEM en stel hem in op een hoge spanning van één megavolt. Koel vervolgens de monsterroosterhouder af tot min 150 graden Celsius met behulp van vloeibare stikstof. Eenmaal afgekoeld, monteer je het bevroren rooster in de gekoelde cryo-monsterhouder en laad je het in de HVEM.

Zorg ervoor dat je de installatie niet met ijs vervuilt. Selecteer nu een beeldgebied met een lage vergroting van 1.000 keer. Pas vervolgens de eucentrische z-as hoogte aan en kant de monsterstadium naar min 60 graden.

Verwijder nu de speling van de draairotatie. Focus vervolgens bij de doellocatie met een vergroting van 10.000 keer. Stel een onder focus van zes tot 10 micron in door afwijking van het scherp gefocuste beeld.

Stel voor beeldvorming de dosis in op twee elektronen per vierkante ångström per seconde of minder. Houd de elektrondosering in de gaten, die wordt weerspiegeld door de stroomdichtheid, en maak een beeld met een digitale camera of op een elektronenfilm. Verzamel vervolgens kantelen afbeeldingen van min 60 tot plus 60 graden met stappen van twee tot vier graden.

Gebruik indien mogelijk de geautomatiseerde functies van de microscoop. Open het commerciële softwarepakket en laad de kantelbeelden voor de tomografische reconstructie. Maak vervolgens een beeldstapelbestand van de individuele beelden met behulp van de opdracht tif2mrc of newstack.

Start vervolgens de eTomo GUI-software en voer de beeldparameters in voor pixelgrootte, fiducial diameter, beeldafwijking, enzovoort. Maak zo het bewerkingsscript. Gebruik nu de voorgestelde software om een kantelserie te maken, uitgelijnd met behulp van fiducial markers, met een gemiddelde resterende fout van minder dan 0,5.

Reconstrueer tenslotte een 3D tomogram met behulp van het SIRT-algoritme. Extraheer nu een gebied van belang uit het tomogram en pas een ruisonderdrukkingsfilter toe, zoals een anisotropisch diffusiefilter, een bilaterale filter of een wiskundig morfologisch filter. Voer het filteren uit met parameters die het beeldcontrast verbeteren.

Segmenteer vervolgens een kenmerk van belang. Gebruik de slice-functie om het tomogram te openen. Ga vervolgens naar het Segmentatie Editor-venster en selecteer een nieuw labelveld om een segmentatiebestand te maken.

Traceer vervolgens handmatig de rand van het kenmerk van belang in de eerste slice en vervolgens in elk van de andere slices. Aanvullende kenmerken van belang kunnen worden toegevoegd met behulp van dezelfde bewerkingen. Selecteer nu het SurfaceView-menu om een oppervlakte rendering te genereren met behulp van opties in het SurfaceGen-menu om het gesegmenteerde volume te visualiseren.

Gebruik de gereedschappen