Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Het algemene doel van deze video is om verschillende variaties op technieken voor het bereiden van negatieve kleuring transmissie-elektronenmicroscopie-monsters te demonstreren. Negatieve kleuring is de beste manier om snel de kwaliteit van een EM-monster te beoordelen. Het is belangrijk om te erkennen dat verschillende roostervoorbereidingstechnieken beter werken voor sommige monsters.

De techniek die het beste werkt voor elk specifiek monster moet worden bepaald door middel van proef en fout. Om te beginnen, bereid de EM-roosters voor met behulp van de koolstofbladmethode en bereid de negatieve kleuringsreagentia voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Plaats een met koolstof bekleed EM-rooster met de bovenkant omhoog op een microscoopglaasje.

Plaats het glaasje in een gloeiontladingseenheid en behandel het rooster gedurende minimaal 30 seconden bij 10 milliampère om het rooster hydrofiel te maken. Wanneer u klaar bent, verwijdert u het monster uit de ontladingseenheid. Gebruik vervolgens een paar negatieve druktangen om de rand van het rooster vast te grijpen.

Om te kleuren met behulp van de zijveegmethode, brengt u eerst drie tot vijf microliter van het monster aan op het ondersteunende oppervlak. Laat het monster 10 seconden tot een minuut adsorberen op het roosteroppervlak, raak vervolgens de rand van het rooster aan een velletje filterpapier en laat capillaire actie het vocht wegzuigen. Plaats vervolgens 50 microliter druppels ultrapuur water of een geschikte vluchtige bufferoplossing op een velletje laboratoriumfilm.

Raak voorzichtig de koolstofoppervlakte van het rooster aan de druppel aan en til een kleine druppel op naar het oppervlak van het rooster. Raak vervolgens de rand van het rooster aan een velletje filterpapier en laat capillaire actie het vocht wegzuigen. Plaats vervolgens twee druppels van 50 microliter kleuringsreagens op een velletje laboratoriumfilm.

Raak voorzichtig de koolstofoppervlakte van het rooster aan de druppel aan en til een kleine druppel op naar het bovenoppervlak van het rooster. Als de kleuring naar de achterkant van het rooster migreert, dan is de koolstoffilm gebroken en moet het worden weggegooid. Na 10 tot 15 seconden raakt u de rand van het rooster aan een velletje filterpapier en laat u capillaire actie het vocht wegzuigen.

Herhaal deze kleuringsstap nog een keer en laat het rooster vervolgens aan de lucht drogen. Om het monster te kleuren met behulp van de knipmethode, grijpt u de rand van het rooster met een paar negatieve druktangen en brengt u drie tot vijf microliter monster aan op het ondersteunende oppervlak. Houdt u de tangen in één hand, laat u het rooster ongeveer 45 graden wegdraaien en knipt u snel met de pols om het grootste deel van de druppel die zich bovenop het rooster bevindt weg te knippen.

Gebruik vervolgens een glazen Pasteurpipet om een druppel wasoplossing aan het ondersteunende oppervlak toe te passen. Knip de druppel weg en herhaal dit een paar keer om het monster te wassen. Breng vervolgens een druppel kleuringsreagens aan op het ondersteunende oppervlak en knip de druppel weer weg.

Herhaal deze kleuringsstap één tot drie keer, afhankelijk van de kleuringsdiepte die vereist is voor visualisatie van het monster. Verwijder overtollig kleuring door de gescheurde rand van een velletje filterpapier aan de rand van het rooster te raken en laat het rooster vervolgens aan de lucht drogen. Om het monster te kleuren met behulp van de snelle spoelmethode, trekt u eerst 30 tot 70 microliter kleuring in de punt van een 200 microliterpipet.

Draai de volumeknop om vijf microliter lucht op te trekken en vervolgens vijf tot 30 microliter wasreagens op te trekken, gevolgd door nog een kleine luchtspleet, voordat er weer vijf microliter monster wordt opgezogen. Grijpt u de rand van een rooster met een paar negatieve druktangen en laat u het rooster ongeveer 45 graden wegdraaien. In één snelle beweging spuit u de hele inhoud van de pipettepunt over het oppervlak van het met koolstof beklede EM-rooster.

Verwijder overtollig kleuring door de gescheurde rand van een velletje filterpapier aan de rand van het rooster te raken en laat het rooster vervolgens aan de lucht drogen. De ideale keuze voor een negatieve kleuring is sterk afhankelijk van het monster. De meest gebruikte kleuring is uranylacetaat, maar ook lanthanide-kleuringen kunnen worden gebruikt.

Voor diep ingebedde monsters produceren lanthanide-gebaseerde kleuringen, thuliumacetaat en erbiumacetaat, negatieve kleuring van gelijkwaardige kwaliteit aan uranylacetaat, zoals beoordeeld door de schijnbare contrast en scherpte van de gekleurde deeltjes, waarbij thuliumacetaat helderdere en scherpere beelden produceert dan erbiumacetaat. De grote korrelgrootte van thuliumacetaat wordt duidelijk zichtbaar bij hoge vergroting, hier getoond wanneer een monster van tabaksmozaïek vezelige deeltjes werd gekleurd met 1% thuliumacetaat. Met behulp van thuliumacetaat is de 23 angstrom herhaling van het tabaksmozaïek vezelige deeltje duidelijk zichtbaar met het blote oog.

Geen van de andere geteste lanthanide-kleuringen was in staat om dit kenmerk op te lossen. Een ander moeilijk te beeldend monster is het spierafgeleide C-eiwit. Dit monster produceert significant verschillende beelden afhankelijk van de kleuringsmethode.

Wanneer gekleurd met behulp van de zijveegmethode, verschijnt het als een bolvormige, ingezakt vleugelachtige structuur. Wanneer roosters worden bereid met behulp van de knipmethode, wordt het C-eiwit waargenomen als een reeks domeinen die lijken op kralen aan een touw. Dit vertegenwoordigt beter de werkelijke C-eiwitstructuur.

Eenmaal beheerst, duurt het slechts ongeveer een minuut om een negatief gekleurd monster voor te bereiden. Het is belangrijk om te onthouden dat elk monster anders reageert op elke kleuringstechniek. Voor nieuwe monsters moet de beste benadering experimenteel worden bepaald.

Vergeet niet dat uranylkleuringsreagentia giftig en licht radioactief zijn. Zorg ervoor dat ze worden wegge