Een Microbiomechanical systeem voor het bestuderen van de vorming van de Varicosity en herstel in Midden Neuron axonen
30 april 2018
Dit protocol beschrijft een fysiologisch relevante, hydrofoor vloeistof aanpak voor snelle en omkeerbare inductie van varicosities in de neuronen.
Het algemene doel van deze onder druk staande vloeistofpomp is om herhaalbare en consistente zwellingen langs de axonen van gekweekte neuronen te produceren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van hersenletsel, zoals de mechanismen achter subcellulaire morfologische veranderingen in neuronen na een blessure. Het grote voordeel van deze techniek is dat de methode consistente en herhaalbare morfologische veranderingen produceert die na verloop van tijd herstellen.
Dit is een zeer belangrijke techniek die we in het laboratorium hebben ontwikkeld. Dit is omdat we het systeem niet alleen kunnen gebruiken om moleculaire mechanismen te identificeren die mechanische stress-geïnduceerde axonmorfologische verandering bepalen als een nieuwe vorm van neuronale plasticiteit, maar ook om het systeem als screeningstool te gebruiken om nieuwe medicijnen en behandelingsstrategieën voor milde of traumatische hersenletsel te identificeren. Om deze procedure te starten, plaatst u één of meer dozen met deksels van 12 millimeter of 25 millimeter in een glazen beker met 70% salpeterzuur en laat de deksels een nacht bij kamertemperatuur incuberen.
De volgende dag brengt u alle deksels over in een vierliterbeker gevuld met 2,5 liter tweemaal gedestilleerd water. Schud de beker met de deksels gedurende één uur bij 100 RPM en vergeet niet om rubberen banden te gebruiken om de beker vast te houden tijdens het schudden. Vervolgens brengt u de gereinigde deksels over naar een droge flacon met het metalen deksel.
Bakken de deksels in een oven bij 225 graden Celsius gedurende zes uur. Laat ze daarna afkoelen tot kamertemperatuur en bewaar ze in een gesteriliseerde plastic container tot gebruik. Plaats nu één deksel in elk putje van een 24-putjesplaat.
Voeg 30 microliter dekselcoatingsoplossing toe aan een 12 millimeter deksel en draai. Voeg vervolgens één milliliter steriele PBS toe aan elk putje. De plaat kan onmiddellijk worden gebruikt of worden bewaard bij vier graden Celsius in steriele PBS gedurende maximaal een week.
Op de dag van de dissectie verwijdert u PBS uit de plaat. Laat luchtdrogen en plaats de plaat twee tot vier uur onder UV-licht. Om de hippocampale neuronen voor de cultuur te dissociëren, ontdooit u de protease-enzymoplossing en verwarmt u het plateermedium voor op 37 graden Celsius.
Spoel vervolgens de gedissecteerde hippocampus met SLDS. Verwijder het vervolgens en voeg twee milliliter protease-enzymoplossing toe en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de hippocampus explantaten twee keer met vijf tot 10 milliliter plateermedium en voeg vijf milliliter plateermedium toe.
Dissocieer de hippocampale explantaten in enkele cellen door een kleine vortex te genereren met een pipet met een plastic punt van één milliliter. Pipetteer omlaag en omhoog ongeveer 40 keer, vermijd het vormen van zuurstofbubbels totdat de oplossing troebel wordt en er geen grote stukken explantat meer overblijven. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 1.125 maal zwaartekracht gedurende drie minuten.
Verwijder het supernatant met de cellen ondergedompeld in medium en suspendeer de cellen opnieuw in 145 milliliter plateermedium. Voeg vervolgens één milliliter van de celsuspensie per putje toe aan een 24-putjesplaat. Incubeer de cellen in het plateermedium bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vier uur.
Verwijder vervolgens het plateermedium en vervang het door vers onderhoudsmedium. Vervang na twee dagen de helft van het medium door twee micromolair RSC opgelost in onderhoudsmedium om de groei van fibroblasten, endotheel- en gliacellen te remmen. Vervolgens, nadat de cellen twee dagen aan RSC zijn blootgesteld, vervangt u het medium door vers onderhoudsmedium.
Om te transfecteren voor de visualisatie van celmorfologie, verdunt u de constructie van de voorraad op één microgram per microliter in Opti-MEM-medium en vortex. Verdun vervolgens liposoom-gemedieerde transfectiereagens in Opti-MEM-media en vortex. Bereid vervolgens één constructie-dilutie en één transfectie-dilutie voor voor elke putje.
Bereid vervolgens een een-op-een mengsel van de constructie en Opti-MEM-medium en transfectiereagens en Opti-MEM-medium en vortex. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na 20 minuten de helft van het medium uit elk putje en breng dit medium over in een schone conische buis.
Bewaar de buis in de incubator en voeg 100 microliter van het mengsel toe dat in de vorige stap is bereid aan het resterende medium in het putje. Laat de cellen gedurende 20 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius incuberen. Tijdens de incubatie voegt u één volume vers onderhoudsmedium toe aan het medium in de conische buis en plaatst u het mengsel in dezelfde incubator.
Na incubatie verwijdert u de mediums met de transfectieloplossing uit de putjes en vervangt u deze door de een-op-een mengsel van oud en vers onderhoudsmedium in de conische buis. Bij deze procedure steekt u de pipet in de schroefdop van de micromanipulator om deze op zijn plaats te houden. Schroef de metalen platte schroef die aan de arm van de micromanipulator is bevestigd, zodat deze het niet getrokkene uiteinde van de pipet net boven waar de rubberen slang is bevestigd houdt.
Houd de pipet onder een hoek van 45 graden ten opzichte van het oppervlak van het neuron dat deksels bevat. Schakel de fluorescentiefilter in. Open de diafragma en zorg ervoor dat een fluorescerende vlek door het objectief kan worden gezien.
Gebruik de micromanipulator om de pipet in een positie te bewegen die de punt uitlijnt met de fluorescerende vlek en laat de pipet zakken tot net boven de hoogte van de celcultuurschaal. Zodra deze in positie is, schakel de doorgelaten licht in en schakel de fluorescentie uit. Gebruik een pincet om één deksel met de cellen naar de pipet te kantelen van de celcultuurplaat naar de celcultuurschaal met 2 milliliter Hank's buffer bij kamertemperatuur.
Gebruik de fijne focusknop en het 20-voudige objectief om op een vlak te focussen dat ongeveer vier volledige omwentelingen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode met onder druk gezette vloeistof om snelle en reversibele varicositeiten in gekweekte neuronen op te wekken. Het doel is om de mechanismen achter subcellulaire morfologische veranderingen als gevolg van mechanische stress te verduidelijken, wat waardevol is voor onderzoek naar neuronale plasticiteit en behandelingen van hersenletsel.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Neuronale plasticiteit
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- De studie richt zich op neuronale morfologie en de adaptatie daarvan aan mechanische stress.
- Varicositeiten zijn zwellingen langs axonen die cruciaal zijn voor het begrijpen van de neuronale functie.
- Deze techniek is van groot belang voor het onderzoeken van mechanismen bij hersenletsel.
- Het vermogen om deze veranderingen te reproduceren heeft implicaties voor drugscreening en therapeutische strategieën.
Doel van de studie
- Om een methode vast te stellen voor het induceren van consistente neuronale morfologische veranderingen.
- Om de onderliggende moleculaire mechanismen van deze veranderingen te onderzoeken.
- Om nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van letsel te identificeren.
Gebruikte methoden
- De methode maakt gebruik van een gecultiveerd neuronmodel, met de focus op hippocampale neuronen.
- Omvat specifieke voorbereidingsstappen voor dekglasjes en celkweek.
- Er worden geen multi-omics workflows in de tekst genoemd.
- Kritieke stappen omvatten het reinigen, het coaten van dekglasjes en het transfecteren van cellen voor visualisatie.
- De opstelling met onder druk staande vloeistof wordt gebruikt om axonale zwellingen in de neuronen op te wekken.
Belangrijkste resultaten
- De techniek produceert reproduceerbare morfologische veranderingen die na verloop van tijd herstellen.
- Het maakt het mogelijk om door mechanische stress geïnduceerde neuronale plasticiteit te onderzoeken.
- Biologische reacties op de stress kunnen worden gemonitord, wat inzicht geeft in herstelmechanismen.
- De resultaten kunnen bijdragen aan het begrip van reacties bij traumatisch hersenletsel.
Conclusies
- Deze studie stelt een betrouwbare methode vast voor het onderzoeken van veranderingen in de neuronale morfologie.
- De resultaten werpen licht op neuronale adaptatiemechanismen die relevant zijn voor letsel en herstel.
- De methode biedt potentieel voor het screenen van therapeutische interventies in modellen van neuronale beschadiging.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit onder druk staande vloeistofsysteem maakt snelle, omkeerbare inductie van axonale varicositeiten in centrale neuronen mogelijk, waardoor een gecontroleerd model ontstaat voor het bestuderen van mechanosensitieve paden die relevant zijn voor traumatisch hersenletsel en neuronale plasticiteit. Door mechanische stress te koppelen aan subcellulaire morfologische veranderingen en proteïnedynamiek, ondersteunt deze methode het minimaliseren van risico's bij het selecteren van targets in vroege discoveryfasen, in het bijzonder voor ionkanalen en cytoskelettargets. De compatibiliteit met live-imaging, elektrofysiologie en drugperfusie maakt integratie in screeningcascades mogelijk voor mechanistische validatie en lead-optimalisatie in modellen voor neurodegeneratie en letsel.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de activering van transient receptor potential-kanalen te onderzoeken als moleculair mechanisme van door mechanische stress geïnduceerde axonale zwelling.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar, reversibel fenotype om target engagement en padmodulatie in levende neuronen te valideren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door vloeistofdruk-input te correleren met gedefinieerde kinetiek van axonale varicositeitsvorming en herstel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare morfologische resultaten (vorming/herstel van varicositeiten) die geschikt zijn voor screening op basis van high-content imaging.
- Operationele waarde: Compatibel met drugperfusie en calcium-imaging, waardoor de effecten van verbindingen op mechanosensitieve reacties kunnen worden beoordeeld.
- Klaar voor assay: Gestandaardiseerde preparatie van dekglasjes en transfectieprotocollen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen wells en experimenten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Waarde: Modelleert axonale pathologie gezien bij traumatisch hersenletsel, wat preklinische evaluatie van beschermende of regeneratieve verbindingen mogelijk maakt.
- Mechanistische Continuïteit: Slaat een brug tussen acute mechanische insulten en subcellulaire herstelprocessen, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Relevantie voor Ziektebeeld: Direct toepasbaar bij het bestuderen van cytoskeletdynamiek, calciumsignalering en proteïnetransport in de context van letsel.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via fenotypische screening tot preklinische werkzaamheidstesten, in het bijzonder voor neuroprotectieve en neurorestoratieve kandidaten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing van mechanosensitieve ionkanalen en cytoskeletregulatoren via gecontroleerde axonale deformatie.
- Screening: Maakt assay-standaardisatie mogelijk voor het kwantificeren van morfologisch herstel als functionele readout van de activiteit van verbindingen.
- Analytics: Levert tijdsongeloopte, kwantitatieve gegevens over de kinetiek van varicositeitsvorming en -oplossing voor comparatieve conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Modelleert vroege axonale pathologie bij hersenletsel, wat preklinische continuïteit mogelijk maakt van mechanisme naar functionele uitkomst.
- Enterprise-hergebruik: Gestandaardiseerde microfluïdische druktoepassing maakt hergebruik over verschillende neuronale typen en experimentele condities mogelijk met minimale re-optimalisatie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar neuronale plasticiteit door mechanische stress te isoleren als onafhankelijke variabele.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid van axonale zwellingfenotypes, waardoor variabiliteit in downstream-assays wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, op mechanismen gebaseerde efficiëntiesignalen te leveren in relevant letselmodel.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van verbindingen die gericht zijn op axonale integriteit en stressresponspaden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in neuronale kweek, microchirurgie en live-cell imaging.
- Afhankelijk van een systeem voor vloeistoftoediening onder druk en een micromanipulator voor nauwkeurige axonale targeting.
- Vereist standaardisatie van de preparatie van dekglasjes, de transfectie-efficiëntie en de puff-drukparameters.
- Aanpassing aan andere neuronentypen kan optimalisatie van de dissociatie- en kweekcondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de technische complexiteit van de opstelling en de noodzaak van gespecialiseerde vaardigheden in micromanipulatie.
