Ultrasensitive detectie van Biomarkers met behulp van een moleculaire Imprinting gebaseerd capacitieve Biosensor
16 februari 2018
Hier presenteren we een protocol voor de detectie en kwantificering van lage overvloedige molecules in complexe oplossingen met behulp van moleculaire inprenting in combinatie met een capaciteit biosensor.
Het algemene doel van deze techniek is om laag voorkomende biomoleculen in zeer complexe monsters te detecteren en te kwantificeren met hoge gevoeligheid, eenvoud, lage kosten, snelheid, en zonder het gebruik van enige markering. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biotechnologie, biochemie en biomedische wetenschappen, zoals milieubewaking, voedselveiligheid, drinkwaterkwaliteit en medische diagnostiek. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de inherente snelheid, eenvoud, hoge gevoeligheid, lage kosten, eenvoudige manipulatie en realtime detectie zonder het gebruik van markeringsreagentia.
De implicaties van deze techniek reiken tot de diagnose van ziekten vanwege het vermogen om laag voorkomende biomoleculen te kwantificeren. Bijvoorbeeld, verschillende biomarkers in real time. Om de glazen dekglasjes schoon te maken, dompel ze 10 minuten onder in 10 milliliter 1,0 molair HCl in een ultrasone reiniger op kamertemperatuur.
Dompel ze vervolgens onder in gedeïoniseerd water en 1,0 molair natriumhydroxide onder dezelfde omstandigheden. Droog de glazen dekglasjes met stikstofgas. Dompel vervolgens de schone en droge dekglasjes een uur lang in 10 milliliter APTES-oplossing om aminogroepen op het oppervlak van het dekglas te introduceren op kamertemperatuur.
Spoel de dekglasjes af met gedeïoniseerd water voordat je ze opnieuw droogt met stikstofgas. Dompel de APTES-gemodificeerde dekglasjes twee uur lang in een 10 milliliter oplossing van glutaaraldehyde om de aminogroepen op het oppervlak bij kamertemperatuur te activeren. Na incubatie spoelt u de dekglasjes af met 10 millimolair fosfaatbuffer om overtollig glutaaraldehyde van het oppervlak te verwijderen.
Droog de dekglasjes met stikstofgas. Bereid vervolgens 1,0 milliliter sjabloonoplossing in 10 millimolair fosfaatbuffer in een concentratie van 0,1 milligram per milliliter. Laat 200 microliter van deze sjabloonoplossing vallen op de gemodificeerde dekglasjes en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius.
Om de elektroden schoon te maken, dompel je de elektroden eerst 10 minuten onder in een klein bekertje met vijf milliliter 70% ethanol in een ultrasone reiniger op kamertemperatuur. Dompel vervolgens de elektroden achtereenvolgens onder in gedeïoniseerd water, aceton, gedeïoniseerd water, Zure Piranha-oplossing en gedeïoniseerd water onder dezelfde omstandigheden. Droog de elektroden met stikstofgas.
Voer de elektropolymerisatie van tyramine uit door acht milliliter 10 millimolair tyramine-oplossing te bereiden in 10 millimolair fosfaatbuffer met twee milliliter ethanol. Voer 15 cycli van cyclische voltammetrische scans uit in deze oplossing met behulp van een potentiostaat die een potentiaalbereik van nul tot 1,5 volt en een scanfrequentie van 50 millivolt per seconde dekt. Spoel vervolgens de elektroden af met gedeïoniseerd water voordat u de elektroden droogt met stikstofgas.
Dompel de elektroden in een oplossing met 30 millimolair acryloylchloride en 30 millimolair trimethylamine in tolueen bij kamertemperatuur gedurende de nacht voordat u de elektroden opnieuw spoelt en droogt. Bereid voorafgaand aan de polymerisatie een monimeeroplossing met monomeren en cross-linker in 820 microliter ultrapuur water. Bereid vervolgens 5%volume op volume TEMED in ultrapuur water.
Voeg 20 microliter van de TEMED-oplossing toe aan de monomeroplossing en spoel vijf minuten lang met stikstofgas. Voeg vervolgens 20 microliter vers bereide APS toe aan de monomeroplossing. Pipet 1,5 microliter van de monomeroplossing op het gemodificeerde gouden elektrodeoppervlak.
Start nu de polymerisatie door de sjabloonstempel in contact te brengen met het met monomeren behandelde oppervlak en laat het vijf uur op kamertemperatuur staan. Verwijder na polymerisatie de sjabloonstempel voorzichtig van het oppervlak, met behulp van een pincet. Spoel vervolgens de elektrode af met gedeïoniseerd water en droog met stikstofgas.
Dompel de elektroden gedurende twintig minuten onder in één milliliter tien millomer van een dodecanetheol bereid in ethanol om de pinholes op het oppervlak van de elektrode te bedekken. Spoel vervolgens de elektroden af met gedeïoniseerd water en droog de elektroden met stikstofgas voordat u hun oppervlakken karakteriseert met rasterelektronenmicroscopie. Plaats de geïmprenteerde capacitieve gouden elektroden in de elektrochemische flowcel geïntegreerd in een capacitieve biosensor.
Bereid 100 milliliter regeneratiebuffer en een liter loopbuffer. Begin de analyse met de injectie van regeneratiebuffer om het systeem te regenereren en loopbuffer om het systeem gedurende 25 minuten opnieuw in evenwicht te brengen. Bereid standaard sjabloonoplossingen voor in het gewenste concentratiebereik in loopbuffer.
Injecteer vervolgens 250 microliter van deze standaardoplossingen sequentieel in het systeem onder optimale omstandigheden. De oppervlaktekarakterisering van de gouden elektroden wordt uitgevoerd door rasterelektronenmicroscopie. Het blote gouden oppervlak wordt getoond.
Ook getoond zijn bacteriofagen die op verschillende vergrotingen op het oppervlak van de elektrode hechten. Hier wordt de realtime binding van bacteriofagen aan de geïmprenteerde gouden elektrode weergegeven door middel van een sensogram. Een stabiele basislijn wordt vastgesteld na regeneratie en hernieuwde evenwichtstoestand van het systeem vóór de injectie van het monster.
Er zijn faagspecifieke holtes op de elektrode. Injectie van de monster-inducerende bacteriofagen resulteert in een verminderde capaciteit, als gevolg van de binding van doelbacteriofagen aan de geïmprenteerde holtes op het oppervlak van de gouden elektroden. Kalibratiecurven tonen de veranderende capaciteit ten opzichte van eiwitinjectie bij bacteriofage-injectie.
Uit de vergelijkingen in deze grafieken is het mogelijk om de concentratie van bacteriofagen of eiwitten in een monster te berekenen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een ultragevoelig, snel en realtime detect
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het detecteren en kwantificeren van biomoleculen met een lage abundantie in complexe oplossingen met behulp van moleculaire imprinting en een capacitieve biosensor. De methode kenmerkt zich door een hoge gevoeligheid, eenvoud en kostenefficiëntie, waardoor deze geschikt is voor diverse toepassingen binnen de biotechnologie en biomedische wetenschappen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biotechnologie
- Biochemie
- Biomedische wetenschappen
Achtergrond
- De detectie van biomoleculen in lage concentraties is cruciaal in diverse vakgebieden.
- Huidige methoden vereisen vaak labeling, wat het proces kan compliceren.
- Deze techniek biedt een labelvrije benadering voor real-time detectie.
- Toepassingen omvatten onder andere milieumonitoring en medische diagnostiek.
Doel van de studie
- Om een gevoelige en eenvoudige methode voor de detectie van biomoleculen te ontwikkelen.
- Om real-time monitoring van biomarkers te faciliteren.
- Om een kosteneffectieve oplossing te bieden voor de analyse van complexe monsters.
Gebruikte methoden
- Moleculaire imprint op goudelektroden.
- Elektropolymerisatie van tyramine voor de preparatie van de sensor.
- Capaciteitsmeting voor de kwantificering van biomoleculen.
- Oppervlaktekarakterisering met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt real-time detectie van doelbiomoleculen mogelijk.
- Kalibratiecurves tonen de relatie tussen capacitantie en de concentratie van biomoleculen aan.
- Succesvolle toepassing bij het detecteren van bacteriofagen op elektrode-oppervlakken.
- De techniek kan in ongeveer vijf en een halve uur worden voltooid.
Conclusies
- De ontwikkelde methode is efficiënt voor het detecteren van biomoleculen met een lage abundantie.
- Het heeft belangrijke implicaties voor diagnostiek en milieumonitoring.
- Het protocol is eenvoudig en kan worden aangepast voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode voldoet aan de behoefte aan labelvrije detectie met een hoge gevoeligheid van biomarkers met een lage abundantie in complexe matrices, een kritische tekortkoming bij targetvalidatie in vroege stadia en de ontwikkeling van assays. Door moleculaire imprinting te combineren met capacitieve biosensing, maakt het real-time kwantificering mogelijk zonder antilichamen of fluorescente labels, waardoor de complexiteit en de kosten van de assay worden verminderd. De aanpak ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid in workflows voor biomarkerdetectie, met name voor toepassingen waarbij snelle screening van milieu- of klinische monsters vereist is.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken via directe detectie van biomoleculen met een lage abundantie onder natuurlijke monstercondities.
- Operationele waarde: Elimineert de afhankelijkheid van antilichamen, waardoor variabiliteit wordt verminderd en reproduceerbare studies naar target-engagement mogelijk worden.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de kwantificering van biomarkers voor mechanische risicoreductie en hypothese-gestuurde selectie van targets.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt labelvrije, kwantitatieve resultaten voor screeningscampagnes waarbij traditionele immunoassays onvoldoende sensitiviteit hebben.
- Operationele waarde: Faciliteert assay-standaardisatie via capacitieve meting, waardoor een consistente signaalinterpretatie over verschillende runs mogelijk is.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt herbruikbare sensorplatforms na regeneratie, waardoor de kosten per assay en de hoeveelheid afval worden verminderd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Maakt monitoring van biomarkerfluctuaties in ziekterelateerde systemen mogelijk, van ontdekking tot preklinische evaluatie.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Kwantitatieve verschuivingen in de capaciteit correleren met de doelconcentratie, wat go/no-go-criteria informeert op basis van detecteerbare drempels.
- Mechanische risicoreductie: Bevestigt de aanwezigheid van het target in complexe biologische matrices zonder labeling-artefacten.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen tot biomarkerdetectie die klaar is voor assay-toepassing, ter ondersteuning van fasen voor lead-identificatie waarbij sensitiviteit en specificiteit van cruciaal belang zijn.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk door targets met een lage abundantie te detecteren in complexe lysaten of biologische vloeistoffen.
- Screening: Levert kwantitatieve, labelvrije output die geschikt is voor primaire screening van verbindingenbibliotheken tegen geïmprinte targets.
- Analytics: Capaciteitsmetingen leveren real-time, kwantitatieve gegevens voor het vergelijken van bindingscondities en het berekenen van targetconcentraties.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de uitlijning van biomarkers in preklinische modellen door target-engagement te detecteren in serum of weefselextracten.
- Hergebruik op Bedrijfsniveau: Sensoroppervlakken kunnen worden geregenereerd en hergebruikt, waardoor de methode een duurzaam platform is voor herhaalde biomarker-screening.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in biomarkerdetectie door labelingsstappen te elimineren die de natuurlijke binding kunnen beïnvloeden.
- Operationele waarde: Vereenvoudigt de workflow door labelvrije detectie en real-time monitoring, waardoor de handmatige tijd en het aantal reagentia-stappen worden verminderd.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk bij targetvalidatie door onmiddellijke, kwantitatieve feedback te geven over de aanwezigheid van het target.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van detecteerbare concentratiebereiken in complexe monsters.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in oppervlaktechemie, elektropolymerisatie en biosensorinstrumentatie.
- Is afhankelijk van capacitieve biosensorsystemen met geïntegreerde potentiostaten voor meting en besturing.
- Vereist standaardisatie van regeneratie- en equilibratieprotocollen tussen teams voor reproduceerbare resultaten.
- Aanpassing aan nieuwe targets vereist optimalisatie van de imprintingcondities (templateconcentratie, polymerisatietijd).
- Praktische beperkingen omvatten vervuiling van het oppervlak bij zeer complexe monsters, wat wordt beperkt door de in het protocol beschreven thiolpassivatiestappen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Modification of Glass Cover Slips (Template Stamps)
2:17
Modification of Capacitive Gold Electrodes
3:34
Preparation of Protein-imprinted Capacitive Gold Electrodes
4:54
Real-time Capacitive Measurements with Template-imprinted Capacitive Gold Electrodes
5:39
Results: Detection of Bacteriophage and Protein Binding to Imprinted Gold Electrodes
6:46
Conclusion
