Transplantatie van stamcellen adipeus weefsel afkomstige blad om lekkage na gedeeltelijke Colectomy in een Rat-Model
11 augustus 2018
De voorbereiding en de transplantatie van vetweefsel afgeleid cel van de stam (ASC) bladen op onvoldoende ingehecht colorectal anastomoses in een rat-model wordt gepresenteerd. Deze nieuwe aanvraag blijkt dat ASC bladen colorectal wapendrager lekkage kunnen verminderen.
Omdat ze een positief effect aannemen op de genezing van weefsel, zijn ASC-sheets getest in veel ziektemodellen, zoals myocardinfarct. Dit experiment toont aan dat ASC-sheets intra-abdominaal kunnen worden gebruikt en kunnen worden toegepast op de darm. Het belangrijkste voordeel van ASC-sheets is dat er geen synthetische materialen nodig zijn.
Bovendien is ASC-sheettransplantatie relatief eenvoudig uit te voeren, met slechts een kleine hoeveelheid oefening. Deze nieuwe toepassing van ASC-sheettransplantatie werd ontwikkeld om lekkage na darmresectie te voorkomen en biedt een eerste stap naar een nieuwe therapeutische strategie. ASC-sheets toegepast op intestinale anastomose zijn veelbelovend gebleken bij het voorkomen van lekkage.
ASC-sheets kunnen ook worden toegepast op andere intra-abdominale organen, zoals de urinewegen. Begin met het dissekeren van menselijk subcutaan abdominaal vetweefsel in stukken van 0,5 cm, met een steriele chirurgische blad van grootte 10, Adson-Brown weefselserpenten en Metzenbaum-schaar. Weeg de totale hoeveelheid gedisseceerd weefsel in een steriele glazen fles.
Voeg 30 ml isolatiemedium per fles toe. En verteer het gedissecteerde vetweefsel in een shakerincubator bij 150 rpm en 37 graden Celsius gedurende één uur. Na een uur verdeel de verteerde weefseloplossing in 50 ml buizen en centrifugeer de buizen gedurende 10 minuten bij 390 G. Na de centrifugatie verwijder de supernatant.
Voeg medium toe om de celpellets te resuspenderen en voeg meer kweekmedium toe, tot 45 ml. Centrifugeer de gecombineerde cellen gedurende vijf minuten bij 390 G en verwijder de supernatant. Resuspendeer de celpellet met 10 ml kweekmedium.
En filter de celsuspensie door een 100 micron filter. Voeg 50 l van 3% zure metheenblauw-oplossing toe aan 50 l celsuspensie om rode bloedcellen te elimineren. Na het mengen van de oplossing, pipet 10 l op een hemocytometer en tel de cellen.
Plak de cellen met een dichtheid van 40000 cellen per vierkante cm, in een T175 fles met kweekmedium. En incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een vochtige atmosfeer met 5%CO2. De volgende dag, was de cellen met warm fosfaatgebufferd zoutwater om cellulaire puinhopen te verwijderen.
Vervolgens vervangt u het medium door 10%FBS-kweekmedium, plus vers toegevoegd ascorbinezuur-2-fosfaat en humaan recombinant fibroblastengroeifactor twee. Incuber tot de cellen 90% confluency bereiken. Subcultiveer de vetweefselstamcellen bij 90% confluency, met behulp van standaard 0,25% Trypsin-EDTA-oplossing.
Neutraliseer na drie tot vijf minuten de 0,25% Trypsin-EDTA-oplossing met 10 ml kweekmedium. Breng over naar een centrifugeerbuis en centrifugeer de cellen gedurende acht minuten bij 250 G. Verwijder de supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml kweekmedium. Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, plak de cellen in T175 kweekflessen, met een dichtheid van 8000 cellen per vierkante cm.
Vries de resterende ASC's in vloeibare stikstof in, met 10% dimethylsulfoxide in kweekmedium voor verder gebruik. Bekleed 3,5 cm diameter thermoresponsieve kweekschotels vooraf met 1 ml foetaal bovien serum. Plaats vervolgens de schotels in een incubator bij 37 graden Celsius, gedurende ten minste 30 minuten vóór het zaaien.
Om ASC-adhesie aan de thermoresponsieve schotel te bevorderen en het risico op voortijdige loslating van de ASC-sheet tijdens het kweken te verminderen, moet de thermoresponsieve schotel voor het zaaien van cellen worden voorgecoat met foetaal bovien serum. Trypsiniseer ASC's zoals voorheen, als er na trypsinisatie celklompjes zijn, filter de cellen dan door een 100 micron filter voor het tellen. Verwijder de schotels uit de incubator en breng over naar een verwarmde plaat bij 37 graden Celsius.
Verwijder FBS uit de schotel. Na het resuspenderen van de celpellet in LG DMEM, met 10%FBS, en het tellen van de cellen, verdun 3,52 keer 10 tot de 6e ASC's in 2 ml kweekmedium per schotel, om 400000 cellen per vierkante cm in elke 3,5 cm schotel te zaaien. Verdeel de cellen zo gelijkmatig mogelijk door de schotel voorzichtig te slingeren.
Kweek vervolgens ASC-sheets gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in een vochtige atmosfeer met 5%CO2. Op de dag van transplantatie, laat de kweekschotels afkoelen tot kamertemperatuur gedurende 40 minuten vóór in vivo-transplantatie om ASC-sheetloslating te vergemakkelijken. Eenmaal afgekoeld, verwijder het kweekmedium en vervang het door 1 ml serumvrij LG DMEM.
Om de cellage te transplanteren, grijpt u voorzichtig de rand van de ASC-sheet met atraumatische pincetten en plaatst u de schotelzijde van de ASC-sheet bovenop de anastomoselijn. Voorzichtig handelen met de sheet en correcte plaatsing van het blad zijn essentieel om een succesvolle intacte sheettransplantatie te garanderen. Strek de ASC-sheet voorzichtig uit tot ongeveer 0,25 cm boven en onder de anastomoselijn.
Wikt de sheet om de dikke darm, tilt de dikke darm op om de ASC-sheet om de dorsale zijde te wikkelen. Controledieren, die geen getransplanteerde ASC-sheets ontvingen, vertoonden fecale lekkage nabij de anastomoselijn, aangegeven door de witte pijl op postoperatieve dag drie. Die dieren met getransplanteerde ASC-sheets, aangegeven door de zwarte pijl, vertoonden verminderde fecale lekkage en abscessvorming op postoperatieve dag drie.
Hetzelfde resultaat werd zeven dagen na de operatie waargenomen. Deze afbeelding toont een representatieve dwarsdoorsnede van de colorectale anastomoseringsplaats in een getransplanteerd dier gekleurd met H en E. De sheetstructuur kon tot zeven dagen na de operatie bij de anastomoseplaats worden geïdentificeerd. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in enkele minuten worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
ASC-sheet zal spontaan hechten aan het nulceloppervlak van de colon, er is geen no
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert de preparatie en transplantatie van vellen van uit vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC) op onvoldoende gehechte colorectale anastomosen in een ratmodel. De resultaten tonen aan dat ASC-vellen lekkage van de colorectale anastomose aanzienlijk kunnen verminderen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Colorectale Chirurgie
Achtergrond
- ASC-sheets zijn getest in diverse ziekte-modellen op hun positieve effecten op weefselherstel.
- Ze kunnen intra-abdominaal worden toegepast, waaronder op de darm.
- ASC-sheets vereisen geen synthetische materialen, waardoor ze een natuurlijkere optie vormen voor herstel.
- De transplantatietechniek is relatief eenvoudig en vereist minimale oefening.
Doel van de studie
- Om het gebruik van ASC-sheets bij het voorkomen van lekken na darmresectie te onderzoeken.
- Om een nieuwe therapeutische strategie voor colorectale anastomose te ontwikkelen.
- Om de effectiviteit van ASC-sheets bij het bevorderen van weefselherstel in het darmgebied te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van ASC-sheets uit vetweefsel.
- Transplantatie van ASC-sheets op colorectale anastomosen in een ratmodel.
- Evaluatie van anastomoselekkage na de operatie.
- Vergelijking van de uitkomsten met en zonder toepassing van ASC-sheets.
Belangrijkste resultaten
- ASC-sheets verminderden de incidentie van lekkage bij colorectale anastomosen significant.
- De transplantatieprocedure bleek eenvoudig en effectief.
- De resultaten ondersteunen het potentieel van ASC-sheets als therapeutische optie bij colorectale chirurgie.
- Verdere studies worden gesuggereerd om de langetermijnuitkomsten en toepassingen te onderzoeken.
Conclusies
- ASC-sheets vormen een veelbelovende benadering om de genezing bij colorectale anastomosen te verbeteren.
- Deze studie legt de basis voor toekomstig onderzoek naar ASC-toepassingen in chirurgische settings.
- De bevindingen zouden kunnen leiden tot verbeterde patiëntresultaten bij colorectale operaties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Anastomotisch lekken blijft een kritische uitdaging bij colorectale chirurgie, wat een directe impact heeft op het herstel van de patiënt en de zorglast verhoogt. Transplantatie van vellen van uit vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC) biedt een biologisch gestuurde aanpak om weefselgenezing op anastomotische plaatsen te verbeteren zonder gebruik van synthetische materialen. Dit preklinische model ondersteunt de evaluatie in een vroeg stadium van regeneratieve strategieën voor het verminderen van chirurgische complicaties.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar stamcel-gemedieerde weefselherstelmechanismen in een klinisch relevant letselmodel.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd systeem om paracriene en immunomodulerende bijdragen aan de anastomotische integriteit te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare histologische en functionele resultaten van anastomotische genezing en het voorkomen van lekkage.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbaarheidstesten van celveladhesie en transplantatie onder fysiologische omstandigheden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert de ziekterelevantie in een knaagdiermodel van colorectale anastomose, waardoor in vitro bevindingen worden gekoppeld aan in vivo resultaten.
- Operationele waarde: Maakt een risico-gecorrigeerde evaluatie van de werkzaamheid van ASC-sheets mogelijk voorafgaand aan grotere preklinische studies.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode voor transplantatie van ASC-sheets past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek en ondersteunt de targetvalidatie en het mechanistisch risicobeheer voor regeneratieve therapieën in de gastro-intestinale chirurgie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten over de secretie van trofische factoren door ASC's en immunomodulatie in weefselherstelpaden.
- Screening: Maakt beoordeling mogelijk van de kwaliteit van celvellen, adhesiekracht en biocompatibiliteit voor downstream-toepassingen.
- Analytics: Levert incidentie van lekkage, abcesvorming en histopathologische scoring als kwantitatieve eindpunten voor comparatieve analyse.
- Translationeel Onderzoek: Vestigt een preklinisch model om regeneratieve interventies te evalueren vóór translatie naar grote dieren of klinische toepassing.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een aanpasbaar platform voor het evalueren van celgebaseerde therapieën in diverse intra-abdominale orgaansystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij stamcel-gemedieerde genezing door variabelen te isoleren in een gecontroleerd chirurgisch model.
- Operationele waarde: Biedt een transplantatietechniek zonder hechtingen of lijm, wat de standaardisatie van de procedure vereenvoudigt.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door vroege signalen van effectiviteit te leveren voor regeneratieve benaderingen bij chirurgische indicaties met een hoog complicatierisico.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gestratificeerde prioritering van ASC-gebaseerde kandidaten mogelijk op basis van functionele weefselherstelresultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de isolatie, expansie en sheetvorming van uit vetweefsel afgeleide stamcellen met behulp van thermo-responsieve culturesystemen.
- Afhankelijk van toegang tot steriele chirurgische instrumenten, incubatoren en faciliteiten voor histologische analyse voor de beoordeling van de resultaten.
- Vereist gestandaardiseerde celzaaidichtheden en cultuurtijden om een consistente sheetkwaliteit en loslaatingseigenschappen te waarborgen.
- Omvat overwegingen met betrekking tot adaptatie bij de vertaling van het model naar andere anatomische locaties of grotere diersystemen.
- Beperkt door het korte observatievenster in knaagdiermodellen, waardoor langdurige remodellering of functionele integratie mogelijk niet worden vastgelegd.
