Generatie en isolatie van de celcyclus-gearresteerd cellen met complexe Karyotypes
April 13th, 2018
Aneuploïdie leidt tot instabiliteit van het genoom, die uiteindelijk celcyclus-gearresteerd cellen met complexe karyotypes produceert. Dit witboek biedt een eenvoudige en handige methode om te isoleren van de aneuploid cellen met complexe karyotypes dat niet langer verdelen.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige methode te bieden om celcyclus-gearresteerde cellen met complexe karyotypen te genereren en isoleren. Deze methode kan antwoorden geven op belangrijke vragen op het gebied van aneuploïdie-onderzoek, zoals de interactie van het immuunsysteem met aneuploïde cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een celpopulatie genereert die alleen complexe karyotypen bevat.
Om te beginnen met de synchronisatie van RPE-1 hTERT-cellen, gebruik vers ontdooid materiaal en verdeel ze in een weefselkweekbakje van 10 centimeter met acht milliliter standaard groeimedium. Gebruik vervolgens een hemocytometer om het aantal cellen te bepalen. Daarna incubeer de cellen een nacht.
De volgende dag vervangt u het standaard groeimedium door medium dat vijf millimolar thymidine bevat. Incubeer 24 uur bij 37 graden Celsius om cellen te synchroniseren op de G1S-grens. Na 24 uur wast u de cellen drie keer met PBS.
Voeg vervolgens standaard groeimedium toe aan de gewassen cellen en incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Was de cellen eerst met 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens medium toe dat 500 nanomolar Mps1-remmer reversine bevat.
Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag wast u de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens standaard groeimedium toe en plaats de bakjes terug in de incubator.
Ongeveer 72 uur na de eerste abnormale mitose, wast u de cellen met 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens medium toe dat 330 nanomolar nocodazol bevat. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius.
De volgende dag zuigt u het nocodazolmedium af. Voeg vervolgens drie milliliter PBS toe aan de bak en tik op de zijkant van de plaat om de mitotische cellen los te maken. Draai de plaat tussen elke tik om een gelijkmatige verwijdering van mitotische cellen mogelijk te maken.
Na de eerste schudbeweging, zuigt u alle vloeistof die zich aan de klep en rand van de plaat heeft gehecht. Controleer vervolgens de plaat onder de microscoop bij 10X vergroting. Was vervolgens de cellen met vijf milliliter PBS.
Voeg vervolgens medium toe dat 330 nanomolar nocodazol bevat. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Na de laatste schudbeweging, voegt u 10 milliliter standaard groeimedium toe.
Incubeer de cellen 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius voordat u de tests uitvoert. De cellen die op de plaat achterblijven, worden gerefereerd als gearresteerd met complex karyotype of ArCK-cellen. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om ArCK-cellen te isoleren en verschillende kenmerken specifiek voor ArCK-cellen worden geanalyseerd om hun isolatie te bevestigen.
ArCK-cellen vertonen verhoogde niveaus van celcyclusremmers p53, p21 en p16 in de immunoblot-analyse, terwijl euploïde en aneuploïde circulerende cellen dit niet doen. Bovendien zijn ArCK-cellen positief voor senescentie-geassocieerde bèta-Galactosidase, die blauw-groen kleurt, terwijl euploïde controlecellen dit niet zijn. Segmentatieplots onthullen dat ArCK-cellen aneuploïde zijn, gekenmerkt door meerdere, willekeurige chromosoombezittingen en chromosoomberogingen.
Segmentatieplots tonen het aantal kopieën van enkele cellen van chromosoom één tot X, relatief tot een euploïde referentie log twee-schaal. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle mitotische cellen tijdens elke schudbeweging worden verwijderd. Na het uitvoeren van deze procedure kunnen andere methoden, zoals cytokine-assays, worden uitgevoerd.
Deze assays helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, zoals het vermogen van ArCK-cellen om te interageren met de cellen van het immuunsysteem. Vergeet niet dat nocodazol gevaarlijk is. Bij gebruik van dit reagens moet geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt om ArCK-cellen efficiënt in vitro te isoleren. Deze procedure kan binnen zeven dagen worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
Overzicht
Deze studie presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren van aneuploïde cellen met complexe karyotypen die vastlopen in de celcyclus. De techniek is gericht op het verbeteren van het begrip van aneuploïdie en de implicaties ervan in cellulair gedrag en immuuninteracties.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Neurowetenschap
Achtergrond
- Aneuploïdie is geassocieerd met genoomonstabiliteit.
- Cellen met complexe karyotypen stoppen vaak met delen.
- Het begrijpen van deze cellen kan inzichten bieden in kanker en andere ziekten.
- Het isoleren van deze cellen kan verder onderzoek naar hun eigenschappen vergemakkelijken.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het genereren en isoleren van celcyclus-gearresteerde cellen.
- Om de kenmerken van aneuploïde cellen te onderzoeken.
- Om de interactie tussen aneuploïde cellen en het immuunsysteem te verkennen.
Gebruikte methoden
- Synchronisatie van RPE-1 hTERT cellen met behulp van thymidine en nocodazole.
- Cell shake-off techniek om mitotische cellen te isoleren.
- Immunoblet analyse om celcyclusremmers te beoordelen.
- Senescentie-geassocieerde beta-Galactosidase kleuring voor identificatie van ArCK cellen.
Belangrijkste resultaten
- ArCK cellen vertonen verhoogde niveaus van celcyclusremmers.
- Deze cellen zijn positief voor senescentie-geassocieerde markers.
- Segmentatieplots bevestigen aneuploïdie in geïsoleerde cellen.
- De methode isoleert effectief cellen met complexe karyotypen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare manier om aneuploïde cellen te bestuderen.
- Geïsoleerde ArCK cellen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek naar immuuninteracties.
- Juiste uitvoering van de methode kan resultaten opleveren binnen een week.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating cell cycle-arrested cells with complex karyotypes enables mechanistic de-risking of aneuploidy-driven phenotypes in discovery biology. This approach supports target validation by providing a reproducible system to study chromosomal instability and its impact on cellular senescence, inflammation, and immune interactions. The method’s reliance on standard tissue culture techniques enhances scalability and cross-functional adoption in early-stage R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking aneuploidy to genome instability and pro-inflammatory phenotypes.
- Operational Value: Provides a standardized, low-cost workflow for generating ArCK cells using thymidine, reversine, and nocodazole synchronization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a defined cell population with complex karyotypes for quantitative analysis of senescence markers and cytokine secretion.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent isolation of arrested cells via shake-off and nocodazole treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of aneuploid cell interactions with immune cells, informing immunomodulatory target assessment.
- Operational Value: Enables downstream functional assays such as cytokine profiling and senescence-associated beta-Galactosidase staining to validate phenotypic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening, particularly for mechanisms involving chromosomal instability and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating cells with defined karyotypic complexity to clarify causal links between aneuploidy and cellular phenotypes.
- Screening: Enables reproducible preparation of ArCK cells for high-content analysis of cell cycle inhibitors and secretory profiles.
- Analytics: Provides quantitative outputs including immunoblot detection of p53, p21, p16 and segmentation plots for single-cell copy number variation.
- Translational Research: Connects to immune interaction studies, supporting biomarker exploration in senescence-associated secretory phenotypes.
- Enterprise Reuse: Uses accessible reagents and standard culture equipment, allowing adaptation across laboratories without specialized infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in aneuploidy research by providing a defined arrest model with complex karyotypes.
- Operational Value: Delivers a seven-day protocol with high specificity for ArCK cells, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling early assessment of aneuploidy-driven biological risks in target pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets linked to chromosomal instability and senescence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell synchronization techniques and mitotic shake-off procedures.
- Dependent on access to standard tissue culture incubators, hemocytometers, and fluorescence or brightfield microscopy for validation.
- Necessitates standardization of nocodazole handling and wash steps to ensure complete removal of mitotic cells across replicates.
- Adaptation to other cell lines may require optimization of thymidine, reversine, and nocodazole concentrations and timing.
- Limited to in vitro models; primary tissue or in vivo applicability not addressed in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
