Generatie en isolatie van de celcyclus-gearresteerd cellen met complexe Karyotypes
13 april 2018
Aneuploïdie leidt tot instabiliteit van het genoom, die uiteindelijk celcyclus-gearresteerd cellen met complexe karyotypes produceert. Dit witboek biedt een eenvoudige en handige methode om te isoleren van de aneuploid cellen met complexe karyotypes dat niet langer verdelen.
Het algemene doel van dit protocol is om een eenvoudige methode te bieden om celcyclus-gearresteerde cellen met complexe karyotypen te genereren en isoleren. Deze methode kan antwoorden geven op belangrijke vragen op het gebied van aneuploïdie-onderzoek, zoals de interactie van het immuunsysteem met aneuploïde cellen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een celpopulatie genereert die alleen complexe karyotypen bevat.
Om te beginnen met de synchronisatie van RPE-1 hTERT-cellen, gebruik vers ontdooid materiaal en verdeel ze in een weefselkweekbakje van 10 centimeter met acht milliliter standaard groeimedium. Gebruik vervolgens een hemocytometer om het aantal cellen te bepalen. Daarna incubeer de cellen een nacht.
De volgende dag vervangt u het standaard groeimedium door medium dat vijf millimolar thymidine bevat. Incubeer 24 uur bij 37 graden Celsius om cellen te synchroniseren op de G1S-grens. Na 24 uur wast u de cellen drie keer met PBS.
Voeg vervolgens standaard groeimedium toe aan de gewassen cellen en incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius. Was de cellen eerst met 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens medium toe dat 500 nanomolar Mps1-remmer reversine bevat.
Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag wast u de cellen drie keer met PBS. Voeg vervolgens standaard groeimedium toe en plaats de bakjes terug in de incubator.
Ongeveer 72 uur na de eerste abnormale mitose, wast u de cellen met 10 milliliter PBS. Voeg vervolgens medium toe dat 330 nanomolar nocodazol bevat. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius.
De volgende dag zuigt u het nocodazolmedium af. Voeg vervolgens drie milliliter PBS toe aan de bak en tik op de zijkant van de plaat om de mitotische cellen los te maken. Draai de plaat tussen elke tik om een gelijkmatige verwijdering van mitotische cellen mogelijk te maken.
Na de eerste schudbeweging, zuigt u alle vloeistof die zich aan de klep en rand van de plaat heeft gehecht. Controleer vervolgens de plaat onder de microscoop bij 10X vergroting. Was vervolgens de cellen met vijf milliliter PBS.
Voeg vervolgens medium toe dat 330 nanomolar nocodazol bevat. Incubeer gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Na de laatste schudbeweging, voegt u 10 milliliter standaard groeimedium toe.
Incubeer de cellen 12 tot 24 uur bij 37 graden Celsius voordat u de tests uitvoert. De cellen die op de plaat achterblijven, worden gerefereerd als gearresteerd met complex karyotype of ArCK-cellen. Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om ArCK-cellen te isoleren en verschillende kenmerken specifiek voor ArCK-cellen worden geanalyseerd om hun isolatie te bevestigen.
ArCK-cellen vertonen verhoogde niveaus van celcyclusremmers p53, p21 en p16 in de immunoblot-analyse, terwijl euploïde en aneuploïde circulerende cellen dit niet doen. Bovendien zijn ArCK-cellen positief voor senescentie-geassocieerde bèta-Galactosidase, die blauw-groen kleurt, terwijl euploïde controlecellen dit niet zijn. Segmentatieplots onthullen dat ArCK-cellen aneuploïde zijn, gekenmerkt door meerdere, willekeurige chromosoombezittingen en chromosoomberogingen.
Segmentatieplots tonen het aantal kopieën van enkele cellen van chromosoom één tot X, relatief tot een euploïde referentie log twee-schaal. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle mitotische cellen tijdens elke schudbeweging worden verwijderd. Na het uitvoeren van deze procedure kunnen andere methoden, zoals cytokine-assays, worden uitgevoerd.
Deze assays helpen bij het beantwoorden van aanvullende vragen, zoals het vermogen van ArCK-cellen om te interageren met de cellen van het immuunsysteem. Vergeet niet dat nocodazol gevaarlijk is. Bij gebruik van dit reagens moet geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt om ArCK-cellen efficiënt in vitro te isoleren. Deze procedure kan binnen zeven dagen worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd.
Overzicht
Deze studie presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren van aneuploïde cellen met complexe karyotypes die zijn gearresteerd in de celcyclus. De techniek is erop gericht het begrip van aneuploïdie en de implicaties hiervan voor het cellulaire gedrag en immuuninteracties te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Celbiologie
- Genetica
- Neurowetenschap
Achtergrond
- Aneuploïdie is geassocieerd met genoominstabiliteit.
- Cellen met complexe karyotypes stoppen vaak met delen.
- Inzicht in deze cellen kan nieuwe inzichten bieden in kanker en andere ziekten.
- Isolatie van deze cellen kan verder onderzoek naar hun eigenschappen faciliteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het genereren en isoleren van cellen in de celcyclusstop.
- Het onderzoeken van de kenmerken van aneuploïde cellen.
- Het verkennen van de interactie tussen aneuploïde cellen en het immuunsysteem.
Gebruikte methoden
- Synchronisatie van RPE-1 hTERT-cellen met behulp van thymidine en nocodazol.
- Cell shake-off-techniek voor het isoleren van mitotische cellen.
- Immunoblot-analyse om celcyclusremmers te beoordelen.
- Kleuring voor senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase voor de identificatie van ArCK-cellen.
Belangrijkste Resultaten
- ArCK-cellen vertonen verhoogde gehaltes aan celcyclusremmers.
- Deze cellen zijn positief voor senescentie-geassocieerde markers.
- Segmentatieplots bevestigen aneuploïdie in geïsoleerde cellen.
- De methode isoleert effectief cellen met complexe karyotypes.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode om aneuploïde cellen te bestuderen.
- Geïsoleerde ArCK-cellen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek naar immuuninteracties.
- Correcte uitvoering van de methode kan binnen een week resultaten opleveren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het isoleren van cellen in de celcyclusarrest met complexe karyotypes maakt een mechanische risicoreductie van aneuploïdie-gestuurde fenotypes mogelijk in discovery biology. Deze aanpak ondersteunt targetvalidatie door een reproduceerbaar systeem te bieden om chromosomale instabiliteit en de impact daarvan op cellulaire senescentie, inflammatie en immuuninteracties te bestuderen. De afhankelijkheid van de methode van standaard weefselkweektechnieken vergroot de schaalbaarheid en de cross-functionele adoptie in vroege R&D-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken die aneuploïdie koppelen aan genoominstabiliteit en pro-inflammatoire fenotypes.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, kosteneffectieve workflow voor het genereren van ArCK-cellen met behulp van synchronisatie met thymidine, reversine en nocodazol.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert een gedefinieerde celpopulatie met complexe karyotypes voor kwantitatieve analyse van senescentiemarkers en cytokine-secretie.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays door consistente isolatie van gearresteerde cellen via shake-off en nocodazolbehandeling.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de studie naar interacties tussen aneuploïde cellen en immuuncellen, wat bijdraagt aan de beoordeling van immunomodulerende targets.
- Operationele waarde: Maakt downstream functionele assays mogelijk, zoals cytokinenprofilering en kleuring voor senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase, om fenotypische resultaten te valideren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesetoetsing tot fenotypische screening, in het bijzonder voor mechanismen die chromosomale instabiliteit en stressresponspaden omvatten.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door cellen met een gedefinieerde karyotypische complexiteit te isoleren om causale verbanden tussen aneuploïdie en cellulaire fenotypes te verduidelijken.
- Screening: Maakt reproduceerbare preparatie van ArCK-cellen mogelijk voor high-content analyse van celcyclusremmers en secretoire profielen.
- Analytics: Levert kwantitatieve outputs, waaronder immunoblot-detectie van p53, p21, p16 en segmentatieplots voor copy number variation op single-cell niveau.
- Translationeel Onderzoek: Legt een verband met studies naar immuuninteracties, ter ondersteuning van biomarker-exploratie in senescence-associated secretory phenotypes.
- Enterprise Hergebruik: Maakt gebruik van toegankelijke reagentia en standaard kweekapparatuur, waardoor aanpassing in verschillende laboratoria mogelijk is zonder gespecialiseerde infrastructuur.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in aneuploïdie-onderzoek door een gedefinieerd arrest-model met complexe karyotypes te bieden.
- Operationele waarde: Levert een protocol van zeven dagen met een hoge specificiteit voor ArCK-cellen, waardoor de doorvoer en reproduceerbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door een vroege beoordeling mogelijk te maken van door aneuploïdie gedreven biologische risico's in doelpaden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets die gekoppeld zijn aan chromosomale instabiliteit en senescentie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in technieken voor celsynchronisatie en procedures voor mitotische shake-off.
- Afhankelijk van toegang tot standaard weefselkweekincubatoren, hemocytometers en fluorescentie- of brightfield-microscopie voor validatie.
- Vereist standaardisatie van de nocodazole-behandeling en wasstappen om volledige verwijdering van mitotische cellen over de replica's heen te garanderen.
- Aanpassing aan andere cellijnen kan optimalisatie van de concentraties en timing van thymidine, reversine en nocodazole vereisen.
- Beperkt tot in vitro-modellen; toepasbaarheid op primair weefsel of in vivo wordt in het bronmateriaal niet behandeld.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
