Name: Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Leer mastcellen isoleren uit het buikvlies van muizen en hun functie karakteriseren met Ca²⁺-beeldvorming en degranulatietests. Deze methoden helpen onderzoekers immuunreacties en calciumsignalering bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen Julia Geminn voor technische bijstand in de mestcel voorbereiding en kweken. Dit werk werd gesteund door de transregionale Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Duitse wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (officieel goedgekeurd door de regionale Raad van Karlsruhe).
1. PMC isolatie en teelt door intraperitoneaal Lavage
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Ijs</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL spuiten</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G naalden</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G naalden</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Piepschuim blok broches en pins</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Collectie buizen (50 mL Plastic Centrifuge buizen)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>70% ethanol</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>RPMI Medium (Pre gekoeld en bewaard op ijs)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>PMC Medium: RPMI Medium + 20% FCS (foetaal kalfsserum) + 1% penicilline streptomycine-oplossing (Pen-Strep)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing - DPBS (zonder Ca2 + en Mg2 +)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Cultuur kolven (25 cm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>Groeifactoren voorraad oplossingen (IL-3: 1 μg/l; SCF: 2,5 μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>Serologische pipetten (10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Pipetten tips steriele (20-200 µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>Bank Centrifuge</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>Schaar en pincet</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>CO2 kamer voor muizen</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>Open steriele kap</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>Gesloten steriele kap</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td>Cel incubator (37 ° C en 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>Overdracht pipetten (20-200 µL)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Materialen voor stap 1.
<ol><li>
PMC isolatie door intraperitoneaal lavage
	<ol>
<li>Voorafgaand aan de isolatie van de cel, bereiden de in tabel 1genoemde materialen.</li>
		<li>8 tot 14 weken oude mannelijke muizen voor PMC isolatie gebruiken. Een muis door CO2 inademing euthanaseren, en bevestig de dood door verlies van reflexen. Spray de muis met 70% ethanol en repareren op een schuim-blok met behulp van pennen (dorsale zijde naar beneden). Verwijder de ventrale huid van de muis met behulp van de rand van de botte schaar. Te voorkomen beschadiging van de peritoneale holte. Opmerking: We gebruiken meestal dit protocol voor muizen met een stam van de genetische achtergrond van C57BL/6N.</li>
		<li>7 mL van het ijskoude RPMI medium en 5 ml van de lucht in de peritoneale holte met een spuit van 10 mL uitgerust met een 27 G naald te injecteren. Duw de naald zorgvuldig in het buikvlies en doen niet alle organen perforate. Gebruik een plek in de regio van de epididymaire vet te verminderen het risico van een orgel perforatie.</li>
		<li>Na injectie, schud de muis voor 1 min om peritoneale cellen in het medium van de RPMI los te maken. Niet schudden de muis te sterk, om te voorkomen beschadiging van de interne organen en besmetten de peritoneale holte met het bloed.</li>
		<li>De 10 mL spuit hergebruik door het uit te rusten met een nieuwe 20 G canule. Verschuiving van de binnenorganen aan de ene kant door het kantelen van het schuim blok en het zachtjes tikken op de Bank middellange aspiratie om gemakkelijker te maken van de andere kant. Invoegen van een naald van 20 G, schuine rand omhoog en de vloeistof uit de buik gecombineerd voorzichtig en langzaam (~0.5 mL/s) om te voorkomen dat verstopping door de innerlijke organen. Verzamel zo veel vloeistof mogelijk (meestal 5 – 6 mL).</li>
		<li>De naald van de spuit verwijderen en de overdracht van de verzamelde celsuspensie in een collectie buis op ijs. Gooi een monsterbuisje als er zichtbaar bloed besmetting.</li>
		<li>Centrifugeer de buizen met de celsuspensie bij ~ 300 x g gedurende 5 min. Gecombineerd onder een steriele motorkap het supernatant. Voor elke muis, combineren de monster pellets in 4 mL koud (4-10 ° C) PMC Medium en overdracht de celsuspensie over in een maatkolf van 25 cm2 cultuur. Voeg de groeifactoren IL-3 en SCF op de eindconcentraties 10 ng/mL en 30 ng/mL, respectievelijk. Plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) en incubeer gedurende ~ 48 h tot en met de volgende procedure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PMC cultuur
	<ol>
<li>Dag 2 (~ 48 h na isolatie): middellange wijzigen<ol>
<li>Schakel de cellen van het supernatant en niet-aanhanger (erytrocyten en dode cellen), gecombineerd het medium van de kolf door een Pasteur Pipetteer tip plaatsen aan de rand van de kolf en de kolf bijna horizontaal te houden. Voeg 4 mL voorverwarmde PMC Medium per muis. Toevoegen van de factoren die de groei IL-3 (10 ng/mL) en SCF (30 ng/mL). Plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dag 9: Cel splitsen<ol>
<li>Breng de celsuspensie uit de cel cultuur kolf in een tube van 50 mL kunststof centrifuge. Wassen van de kolf driemaal met 10 mL pre opgewarmd (37 ° C) Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS), het verzamelen van de celsuspensie met vrijstaande cellen in de dezelfde 50 mL kunststof Centrifugeer buis. Tellen van de concentratie van de cel door een hemocytometer en berekenen van het totale aantal van de cellen.</li>
			<li>Centrifugeer de celsuspensie bij ~ 300 x g gedurende 5 min en het supernatant gecombineerd. Herstellen van de pellet in voorverwarmde PMC Medium (37 ° C) te verkrijgen van de cel concentratie 1 x 106 cellen/mL. De celsuspensie overbrengen in een nieuwe cultuur maatkolf van 25 cm2 . Gooi de oude kolf met fibroblasten vast te houden aan de onderkant.</li>
			<li>Toevoegen van de factoren die de groei IL-3 (10 ng/mL) en SCF (30 ng/mL), en plaats de kolf met de cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dagen 12-15: cel metingen<ol>
<li>Als alle experimenten met stimulatie van FcɛRI-receptoren zijn gepland, voorbehandeling de cellen overnachting met 300 ng/mL IgE anti-DNP in standaard kweekmedium. Ga verder met stap 2 of stap 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de meting van de concentratie van fluorimetrische intracellulaire vrij Calcium in PMCs
<ol><li>Voorafgaand aan de metingen, voorbereiding van de materialen die zijn vermeld in tabel 2. Ook het bereiden van een Imaging-Setup bestaande uit: omgekeerde fluorescentie Microscoop; Doelstelling: 40 X / 1.3 olieverf; Fura 2 Filter ingesteld; CCD-Camera; Excitatie lichtbron; Imaging acquisitie programma; Zwaartekracht gevoed oplossing toepassing systeem.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 dagen oud) 1 x 106 cellen/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Concanavalin A</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Fura-2 AM</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Pluronic F-127 20%-oplossingligttussen</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Cover slips glazen ronde; ø 25 mm; Nr. 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Stockoplossing van DNP-HSA (dinitrofenol-menselijke serumalbumine)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Stockoplossing van anti-DNP-antilichamen (IgE)</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Platte bodemplaat (12 wells)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Samengestelde 48/80-stockoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Dekken goed Imaging Chambers</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>Overdracht pipetten (20-200 µL)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Materialen voor stap 2.
<ol start="2"><li>
Imaging Fura-2-voorbereiding
	<ol>
<li>Het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een hemocytometer en aanpassen van de concentratie van de cel tot 1 x 106 cellen/mL. Splitsen de PMCs kolonies door zachtjes pipetteren (3-5 keer) de celsuspensie met een 1 mL pipet tip.</li>
		<li>Bereiden een Ca2 +-bevattende HEPES gebufferde zoutoplossing (Ca2 +- HBSS) bestaat uit 135 mM NaCl, 6 mM KCl 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES en 12 mM glucose. Breng de pH op 7.4 met 3 M NaOH.</li>
		<li>Bereiden van concanavalin A gecoate dia's door pipetting 1 druppel concanavalin A oplossing (0,1 mg/mL in H2O) op elk 25 mm ronde cover glas onder een steriele motorkap. Laat de druppels op de cover slips voor ten minste 1 min. en deze vervolgens verwijdert de meeste van de oplossing met een pipet en laat de hoes glijdt luchtdroog voor 45 min. zorgvuldig druk de concanavalin A behandeld cover glijdt op het rubber imaging kamer (Zie Tabel van materialen) totdat zij hechten om te verkrijgen microscopie imaging kamers. Opmerking: Poly-L-Lysine bedekt dia's kunnen worden gebruikt als alternatief.</li>
		<li>Los van de fluorescente Ca2 + kleurstof Fura-2 AM (1 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaar deze oplossing beschermd tegen licht.</li>
		<li>Verdun de Fura-2 AM stockoplossing in Ca2 +- HBSS om een eindconcentratie van 5 µM ter voorbereiding van de "laden buffer". Te vullen met 5 µL/mL 20% pluronic F-127 in DMSO.</li>
		<li>Mix 500 µL van de "laden buffer" met 500 µL van de celsuspensie PMC. Pipetteer van het mengsel in de beeldvorming kamer en Incubeer de cellen gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Instellen van de ernst toepassing systeem met verschillende oplossingen volgens het protocol stimulatie gevoed. Aanvulling 1 spuit met 40 mL van Ca2 +- HBSS oplossing 2 met 40 mL van Ca2 +- HBSS oplossing met 100 ng/mL DNP syringe, syringe 3 met 40 mL van Ca2 +- HBSS oplossing met 50 µg/mL samengestelde 48/80, syringe 4 met 40 mL nominaal Ca2 +-gratis-HBSS oplossing, en 5 met 40 mL nominaal Ca2 +syringe-gratis-HBSS oplossing 2 µM met Thapsigargin.</li>
		<li>Een 40 X hoog-diafragma olie onderdompeling doelstelling voor te bereiden door het plaatsen van een kleine daling van onderdompeling olie daarop.</li>
		<li>Mount de toepassing-systeem op het podium van de omgekeerde Microscoop. Zet de imaging zaal met de geladen cellen in het systeem van de toepassing en beveiligen om te voorkomen dat beweging tijdens de opname. Zet de doorvallend licht en focus van de cellen.</li>
		<li>Spoel de cellen drie keer met Ca2 +- HBSS buffer met behulp van de zwaartekracht-gevoed toepassing systeem.</li>
		<li>Incubeer de cellen in Ca2 +- HBSS voor 5 min voor Fura-2 AM ambtshalve verestering.</li>
		<li>Spoel de cellen één meer tijd voordat de beeldvorming, als u wilt verwijderen om het even welk potentieel gelekt fluorescente kleurstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cel imaging
	<ol>
<li>Start het grafische programma voor de overname in de fysiologische acquisitie-modus. Open het instellingenvenster, en pas de focus en de optimale Acquisitietijd (die eveneens moet gelden voor excitatie met 340 nm en 380 nm en meestal varieert tussen 50-150 ms). Opmerking: Minimaliseert de blootstelling van de Fura-2 geladen cel om enig licht te vermijden photobleaching van de kleurstof.</li>
		<li>Beeld van een referentie-foto, en de cellen markeren als regio's van belang (ROI). Markeer de laatste ROI in een gebied waar geen cellen aanwezig zijn en dit gedeelte definiëren als de achtergrond.</li>
		<li>Voltooi de installatie en start de meting met een 5 s verwerving tarief. Opmerking: De cellen zal worden afwisselend verlicht met de lichte excitatie van 340 nm en 380 nm, en de uitgestoten fluorescentie (> 510 nm) zal worden verzameld met behulp van de CCD-camera. De beelden van de fluorescentie signalen F340 nm en F380 nm, alsmede de verhouding (F340 nm/F380 nm) zal in drie vensters worden weergegeven. De grafieken van het tijdsverloop van de intensiteit van de fluorescentie individuele ROIs betekenen waarden ook voortdurend wordt getoond.</li>
		<li>Oplossingen op het nummer van de juiste cyclus volgens het ontwerp van het experiment bijvoegen:<ol>
<li>Maatregel antigeen-geïnduceerde hoogte van [Ca2 +]ik, zoals geïllustreerd in Figuur 2A, 2B, van toepassing zijn de spuit 2 oplossing na cyclus 20, en stop opname na cyclus 150.</li>
			<li>Voor het meten van de hoogte van [Ca2 +] samengestelde 48/80-geïnduceerde toepassingi,zoals geïllustreerd in Figuur 2C, van de spuit 3-oplossing na cyclus 20, en stop opname na cyclus 150.</li>
			<li>Voor het meten van de hoogte van [Ca2 +]ik opgeroepen door SOCE, zoals geïllustreerd in Figuur 2D, breng de spuit 4 oplossing na cyclus 10, gelden de spuit 5 oplossing na cyclus 70, breng de spuit 4 oplossing na cyclus 120, Breng de spuit 1 oplossing na cyclus 150, en stoppen met opnemen na cyclus 220.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na het beëindigen van de meting, zet de resultaten in een tabel van de verhouding met de gemeten intensiteiten voor zowel excitatie golflengten met en zonder achtergrondcorrectie, evenals de waarden van de verhouding met en zonder achtergrondcorrectie voor elke ROI en elk tijdstip van de meting. In het programma van de verwerving, druk achtereenvolgens op de knoppen: "start cutter", "mark allen", "convert alle", "fysiologie metingen", "Ok,"Ok". De bestanden opslaan als tabellen en afbeeldingsstapels voor off-line analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. beta-hexosaminidase Release meting in PMCs
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 dagen oud) 1 x 106 cellen/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Stockoplossing van anti-DNP-antilichamen (IgE)</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Stockoplossing van DNP-HSA</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Samengestelde 48/80-stockoplossing</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Ionomycin</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>96-wells-plaat, v-vormige bodem</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>96-wells-platen, vlakke bodem</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Kunststof centrifuge buizen (15 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Serologische pipetten</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Cel incubator (37 ° C en 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Bank Centrifuge</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>Microtiterplaat afleesapparaat voor extinctie metingen</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>Meerkanaalspipet (20-200 μl)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Materialen voor stap 3.
<ol><li>Voorafgaand aan de metingen, bereiden de in tabel 3genoemde materialen. Opmerking: β-hexosaminidase na hun stimulatie MCs vrijgelaten ontstabiel p-nitrofenyl-acetyl-D-glucosamine (pNAG) in p-nitrofenol en N-acetyl-D-glucosamine. Het bedrag van de β-hexosaminidase in de steekproef is evenredig aan het bedrag van de p-nitrofenol, die zal worden gevormd. In een omgeving met hoge pH van "Stop Solution" p-nitrofenol bestaat als volledig gedeprotoneerde p-nitrophenolat en kan worden gedetecteerd door de lichtabsorptie op 405 nm.</li>
	<li>Bereid de Tyrode oplossing met 130 mM NaCl, 5 mM KCl2CaCl 1.4 mM, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5,6 mM glucose en BSA 0,1%. Breng de pH op 7.4 met 3 M NaOH.</li>
	<li>Bereid de lysis-oplossing door het toevoegen van een 1% volume van Triton X-100 tot de Tyrode de oplossing.</li>
	<li>Bereid de oplossing van de stop samengesteld uit 200 mM glycine en breng de pH op 10,7 met NaOH.</li>
	<li>Bereid de oplossing van de oplossing (4-nitrofenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) pNAG door het oplossen van pNAG in 0.4 M citroenzuur om een eindconcentratie van 4 mM.</li>
	<li>Berekent het bedrag van de cellen die nodig zijn voor de bepaling (uitvoeren van de bepaling in tweevoud). Gebruik 200.000 PMCs per putje. 2 putten gebruiken als negatieve controles (Tyrode de oplossing zonder enige secretagogues zoals DNP of samengestelde 48/80) en 2 wells als positieve controle (Tyrode de oplossing met 10 µM Ionomycin) voor elke genotype.</li>
	<li>Breng de cellen in een centrifugebuis 15 mL kunststof, het volume tot 15 mL met Tyrode de oplossing en centrifugeer bij 200 x g voor 4 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet van Pasteur en resuspendeer de cellen in de Tyrode oplossing van 2 x 106 cellen /mL.</li>
	<li>100 µL van de celsuspensie per putje overbrengen in een goed, V 96-Wells-bodemplaat. Voeg 25 µL van stimulatie of control-oplossing aan elk putje (volgens de pipetting regeling geïllustreerd in Figuur 3A). Incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Zet de reactie stop door het plaatsen van de 96-wells-plaat op het ijs gedurende 5 minuten. Vervolgens na de plaat bij 4 ° C gedurende 4 minuten op 120 x gcentrifugeren. Breng 120 µL van het supernatans dat met behulp van een meerkanaalspipet op een bodemplaat die flat-96-Wells en plaats deze op het ijs. Zorgvuldig raak de cel pellets, maar volledig gecombineerd het supernatant.</li>
	<li>125 µL van lysis buffer aan de cel pellets toevoegen. Incubeer de cel pellets gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer hen na de incubatie door herhaalde pipetteren (ongeveer 5 keer).</li>
	<li>Pipetteer 25 µL van de oplossing van de pNAG (4 mM) in de vereiste putten van een nieuwe flat-96-Wells bodemplaat. 25 µL uit elke supernatant toevoegen aan de oplossing bereid pNAG, alsmede 25 µL van elke cel lysate.</li>
	<li>Incubeer de reactie batches gedurende 1 uur bij 37 ° C. Pipetteer 150 µL van stop oplossing aan elk putje aan zet de reactie stop na de incubatie.</li>
	<li>Analyseren van de plaat met een microplate-lezer met behulp van een dual-golflengte instelling op 405 nm met referentie 630 nm voor automatisch op de achtergrond aftrekken. In het programma van de verwerving, vinkt u het vakje 'Reference' en selecteer in het menu element van "Absorptie"-programma "630 nm" van het drop-down lijst. Als de optische dichtheid van de monsters te hoog is, maak een aangewezen verdunning van de sonde voor het nameten.</li>
	<li>Bereken het percentage van β-hexosaminidase release volgens de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57222/57222eq1.jpg"> waar Release [%] het percentage van specifieke bèta-hexosaminidase release is, een [supernatant] is de achtergrond van absorptie van het supernatans dat gecorrigeerd en een [lysate] is de achtergrond van de absorptie van de corresponderende cel lysate gecorrigeerd.</li>
</ol>

<ol><li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+mast+cells%3A+negative%2C+as+well+as+positive%2C+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li>
<li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li>
<li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li>
<li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7508174">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%22tunable%22+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+mast+cells%3A+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li>
<li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li>
<li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150(2014).</li>
<li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-specific+Cre%2FloxP-mediated+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li>
<li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+cell-derived+mast+cells%3A+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3838314">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li>
<li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li>
<li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H%281%29-antihistamines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li>
<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
<li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).</li>
<li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li>
<li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li>
<li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2531691">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li>
<li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators%3A+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

MC modellen kunnen met succes worden gebruikt om te studeren MC degranulatie chemotaxis, adhesie, alsmede over de intracellulaire signaaltransductie signaalroutes betrokken bij MC activering verhelderen. Sommige onderzoekers gebruik menselijke MCs modellen, zoals vereeuwigd lijnen (LAD2 en HMC1) of menselijke MCs afgeleid van koord bloed voorlopercellen (CD133 +) en perifeer bloed voorlopercellen (CD34 +). Anderen verkiezen knaagdier MC modellen, zoals vereeuwigd (rat basofiele leukemie RBL - 2H 3 MC lijn) of primaire ge...

MCs spelen een prominente rol tijdens aangeboren en verworven immuunrespons. Specifiek, MCs deelnemen aan het doden van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en parasieten, en ook degraderen potentieel toxische endogene peptiden of componenten van de boosdoeners (voor recensie zie Galli et al. 20081). De fysiologische rol van MCs in aangeboren en adaptieve immuniteit is het onderwerp van een verhit debat. Daarom moeten de talrijke verschillen van de gegevens in de studies met verschillende Muismodellen van de MC-deficiënte systematische herbeoordeling van immunologische functies voor MCs buiten allergie2. Volwassen MCs zijn meestal gelokaliseerd in weefsels en organen zoals de huid, longen en darmen, en bevinden zich meestal alleen in kleine aantallen in het bloed. MCs hematopoietische precursoren, zoals MC progenitorcellen, ontlenen en hun differentiatie en rijping in de microenvironments van bijna alle gevacuoliseerd weefsels1te voltooien. Factor T-cell-derived Interleukine (IL) -3 promoot selectief de levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie van de bevolking van een pluripotente van muis MCs uit hun hematopoietische progenitorcellen3. Stamcel factor (SCF) wordt geproduceerd door structurele cellen in de weefsels en speelt een cruciale rol in de MC ontwikkeling, overleving, migratie en functie4. De eigenschappen van afzonderlijke MCs kunnen verschillen afhankelijk van hun vermogen om te synthetiseren en slaan verschillende proteasen of proteoglycans. Bij muizen, zijn de zogenaamde bindweefsel-type MCs mucosal MCs volgens hun anatomische lokalisatie, de morfologie en de inhoud van heparine en proteasen5onderscheiden.
In MCs, een stijging van gratis cytosolische Ca2 + ([Ca2 +]ik) is onmisbaar voor de degranulatie en productie van eicosanoiden, alsmede voor de synthese van cytokinen en activering van transcriptiefactoren in reactie op het antigeen en verschillende secretagogues6. Een belangrijk downstream doelwit van deze stimuli is phospholipase C, die ontstabiel phosphatidylinositol 4,5-difosfaat tot diacylglycerol (DAG) en inositol-1,4,5-trisphosphate. DAG geactiveerd proteïne kinase C en IP3 releases ionen van Ca2 + van het endoplasmatisch reticulum. Uitputting van deze winkels activeert Ca2 + toestroom via plasmamembraan Ca2 + kanalen, wat leidt tot het opslaan van bediende calcium ingang (SOCE). Dit proces wordt opgeroepen door de interactie van de Ca2 +-sensor, stromale interactie molecuul-1 (Stim1), in het endoplasmatisch reticulum met Orai17 , alsook door middel van de activering van voorbijgaande receptor potentiële canonieke (TRPC) kanaal eiwitten (voor recensie zie Freichel et al. 20148) in het plasma-membraan.
Om te studeren worden de fysiologische rol van deze kanalen, verschillende farmacologische (toepassing van kanaal-blokkers) of genetische benaderingen meestal gebruikt. In het laatste geval, onderdrukking van eiwit expressie wordt bereikt door zich te richten van mRNA (knockdown) of genomic DNA bewerken met globale of weefsel-specifieke9 schrapping van een exon codering een porie vormen subeenheid van een kanaal (knock-out). De beschikbaarheid van een blocker met voldoende specificiteit voor deze kanalen is beperkt. Daarnaast de vechtpartij aanpak vereist zorgvuldige controle van haar effectiviteit gebruikt, bijv., westelijke analyse van de vlek, en wordt gehinderd door het ontbreken van specifieke antilichamen voor de gerichte kanaal proteïne in veel gevallen. Dus, het gebruik van knock-out Muismodellen wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard voor een dergelijke analyse. Een voorkeur in vitro model voor het onderzoek van MC functies is de teelt van PMCs die geïsoleerde ex vivo als een volwassen populatie worden kunnen (in tegenstelling tot differentiëren MCs in vitro van, bijv., beenmergcellen)10 . In vergelijking met het beenmerg afgeleid MCs (BMMCs), die ook gebruikt zijn bij het bestuderen van MC functie in vitro, de stimulatie van FcεRI en bèta-hexosaminidase is versie verhoogd, 8-fold en 100-fold in PMCs, respectievelijk. In dit artikel beschrijven we een methode van isolatie en de teelt van lymfkliertest PMCs, die het mogelijk maakt om te verkrijgen na 2 weken voor het kweken van een groot aantal zuivere bindweefsel Typ MCs, voldoende voor verdere analyse.
Ondanks de recente vooruitgang in de ontwikkeling en toepassing van genetisch gecodeerde calcium indicatoren het gebruik ervan is nog steeds beperkt door moeilijkheden bij de levering van genen aan doelcellen, specifiek, in zeer gespecialiseerde cellen zoals primaire gekweekte MCs. Bovendien ontbreekt deze groep van fluorescerende indicatoren voor [Ca2 +]ik metingen nog steeds ratiometric kleurstoffen met een hoog dynamisch bereik. Om deze redenen is de aanbevolen methode voor meting van ratiometric [Ca2 +]ik nog steeds het gebruik van de fluorescente kleurstof "Fura-2"11.
Op dit moment de meest gebruikte aanpak voor de evaluatie van de activering van de MC en degranulatie is het meten van β-hexosaminidase-activiteiten. Β-hexosaminidase, een allergische bemiddelaar, is een van de onderdelen van de MC-submodule die mede vrijgegeven met histamine is in constante verhouding van MCs12. Β-hexosaminidase kan gemakkelijk en nauwkeurig gemeten worden door de reactie met een specifieke substraat, die produceert een meetbare hoeveelheid een colorigenic product dat gemakkelijk in een microplate colorimetrische bepaling aantoonbaar. In dit artikel, is een toepassing van deze techniek voor de analyse van PMCs degranulatie in reactie op een verscheidenheid van stimuli gemeld.
Samenvoeging van de hoge-affiniteit plasmalemmal IgE-receptor (FcɛRI) wordt geactiveerd in MCs een veelzijdige intracellulaire signalering weg, wat leidt tot een vrijval van secretoire submodule inhoud in de omliggende extracellulaire ruimte. Naast het specifieke antigeen, vele andere stimuli MCs om los van een divers scala aan immunomodulerende bemiddelaars, zoals aanvulling anafylatoxines kunnen activeren (bv., C3a en C5a)13, de vasoconstrictor peptide endothelin 1 (ET1)14 , als ook talrijke kationogene stoffen en drugs veroorzaken pseudoallergic Reacties (bv., icatibant)15 door binding aan MRGPRX216. Intracellulaire signaalroutes die betrokken zijn bij MRGPR-geïnduceerde MCs degranulatie worden slecht gekenmerkt in vergelijking met FcɛRI-gemedieerde intracellulaire signalering; deze trajecten alleen gestart worden intensief bestudeerd tijdens de laatste paar jaar17 na de receptor identificatie16. Grotendeels, blijven het plasmamembraan ionenkanalen die betrokken zijn bij de ingang van calcium gevolgd door stimulatie van de MRGPRX2 om te worden begrepen. Dus, dit artikel ook focust op intracellulair calcium signalering en degranulatie van MCs gestimuleerd met MRGPR-agonisten.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R&amp;D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DNP-Antibody&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Compound 48/80&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>CoverWell Imaging Chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plate, v-shaped bottom&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates, flat bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate reader with "i-control" software&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Flat bottom plate&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks (25 cm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips glasses round; &oslash; 25 mm; No. 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>HC Filter Set Fura 2&nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Monochromatic Light Source</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Acquisition Program</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gravity fed solution application system</td><td>Custom Made</td><td>4-channel</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Bench Centrifuge</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mastcellen (MCs), spelen als onderdeel van het immuunsysteem, een belangrijke rol bij de verdediging van de gastheer tegen diverse ziekteverwekkers en in de inleiding van de allergische reactie van het immuunsysteem. De activering van MCs via de cross-linking van oppervlak IgE bij hoge affiniteit IgE-receptor (FcεRI), maar ook via de stimulatie van verschillende andere receptoren gebonden, initieert de opkomst van de vrije intracellulaire Ca2 + niveau ([Ca2 +]ik) dat bevordert de vrijlating van inflammatoire en allergische bemiddelaars/mediators. De identificatie van moleculaire bestanddelen die betrokken zijn bij deze signaalroutes is van cruciaal belang voor het begrijpen van de verordening van MC functie. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de isolatie van lymfkliertest bindweefsel type MCs door peritoneale lavage en teelt van peritoneale MCs (PMCs). Culturen van MCs uit verschillende Muismodellen van de knock-out door deze methodologie vertegenwoordigen een nuttige benadering voor de identificatie van eiwitten die betrokken zijn in MC signalering trajecten. Bovendien, we tevens een protocol voor eencellige Fura-2 imaging zoals een belangrijke techniek voor de kwantificering van Ca2 + signalering in MCs. fluorescentie gebaseerde controle voor [Ca2 +]ik een betrouwbare is en veelgebruikte aanpak studie Ca2 + signalering gebeurtenissen, met inbegrip van winkel bediende calcium ingang, die van het grootste belang voor de activering van de MC is. Voor de analyse van MC degranulatie beschrijven we een β-hexosaminidase release assay. Het bedrag van de β-hexosaminidase vrijgegeven in het kweekmedium is beschouwd als een degranulatie marker voor alle drie verschillende secretoire deelverzamelingen beschreven in MCs. β-hexosaminidase kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door haar reactie met een substraat van de colorigenic in een microtiterplaat plaat colorimetrische bepaling. Deze zeer reproduceerbaar techniek is kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Over het geheel genomen het verstrekte protocol blijkt een hoge opbrengst weergeven voor MCs uiting van typische MC oppervlakte markeringen, typische morfologische en fenotypische kenmerken van MCs en demonstreren zeer reproduceerbaar reacties op secretagogues in Ca2 +- beeldvorming en degranulatie testen.

PMCs werden geïsoleerd van 3 wild type muizen (C57BL/6N) door intraperitoneaal lavage en verdere gekweekte in RPMI medium aangevuld met 20% FCS en 1% Pen-Strep in aanwezigheid van groeifactoren (IL-3 bij 10 ng/mL) en SCF op 30 ng/mL onder steriele bevochtigde voorwaarden op 37 ° C en 5% CO2. Het medium is gewijzigd op dag 2 en 9 na de isolatie van de cel. De morfologie van de cel werd geanalyseerd via licht DIC beeldvorming (Zie Figuur 1A, ...

Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van intracellulaire signalering op prikkelbare cellen, zoals welke ionkanalen cruciaal zijn voor activering van immuuncellen en afgifte van mediatoren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn hun relatieve eenvoud en de mogelijkheid om tegelijkertijd een groot aantal cellen te analyseren. Kathrin Ohlenschlager, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zal Fura-2 calciumbeeldvorming in mestcellen demonstreren.Om deze procedure te starten, spuit de geëuthaniseerde muis met 70%ethanol en bevestig hem met zijn rugzijde naar beneden op een schuimblokken met behulp van spelden. Gebruik stompe schaar om de huid over de buik van de muis te verwijderen en vermijd schade aan de buikholte. Injecteer vervolgens zeven milliliter ijskoud RPMI-medium in de buikholte door voorzichtig een naald van 27 gauge in het peritoneum in te brengen.Boor geen organen door en gebruik een plek in de regio van het epididymale vet om het risico op een orgaanperforatie te verminderen. Na injectie, schud de muis gedurende een minuut om de cellen uit de buikholte los te maken in het RMPI-medium. Schud de muis ni

isolation-peritoneum-derived-mast-cells-their-functional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

This video demonstrates a colorimetric assay to determine the degranulation activity of mast cells. The enzyme released by the mast cells hydrolyzes the substrate and produces a colored product. The degranulation activity of the mast cells was measured as the percentage release of enzymes outside the cell normalized with the total enzyme content in the cell.

Mast Cell Degranulation Assay to Study the Effect of a Target Chemical

This video demonstrates a peritoneal lavage method for isolating mature connective tissue-type mast cells from the peritoneal cavity of adult mice. Upon isolating a mixture of primary immune cells from the peritoneal cavity, selective proliferation of mast cells is performed under appropriate culture conditions.

A Technique to Isolate Primary Mast Cells from a Murine Peritoneal Cavity

Mastceldegranulering, de vrijlating van allergische mediatoren, is belangrijk bij allergie, astma, en parasiet defensie. Technieken 1 voor de beoordeling van effecten van geneesmiddelen en toxische stoffen op degranulatie Hier laten we zien, methodologie onlangs gebruikt om de krachtige remmende effect van antibacterieel middel triclosan 2 vertonen.

Een Microplate Assay aan chemische Effecten op RBL-2H3 mestceldegranulatie Assess: Effecten van Triclosan, zonder gebruik van een organisch oplosmiddel

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel's.

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

Het doel van dit protocol is het isoleren van mononucleaire cellen die zich in de lamina propria van de dikke darm bevinden door enzymatische vertering van het weefsel met collagenase. Dit protocol maakt een efficiënte isolatie van mononucleaire cellen mogelijk, wat resulteert in een enkelvoudige celsuspensie die op zijn beurt kan worden gebruikt voor robuuste immunophenotypering.

Isolatie van lamina propria mononucleaire cellen van Murine Colon met behulp van Collagenase E

Technieken voor het genereren van een bibliotheek van korte peptiden die mestcellen kunnen activeren via de MRGPRX2-receptor worden beschreven. Bijbehorende technieken zijn eenvoudig, goedkoop en kunnen worden uitgebreid naar andere celreceptoren.

Screening van peptiden die MRGPRX2 activeren met behulp van Engineered HEK Cells

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

Leer mastcellen isoleren uit het buikvlies van muizen en hun functie karakteriseren met Ca²⁺-beeldvorming en degranulatietests. Deze methoden helpen onderzoekers immuunreacties en calciumsignalering bestuderen.

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests (Video) | JoVE Journal

Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca^{2 +}-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Meer video's verkennen