Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca^{2 +}-beeldvorming en degranulatie vitrotests

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van intracellulaire signalering op prikkelbare cellen, zoals welke ionkanalen cruciaal zijn voor activering van immuuncellen en afgifte van mediatoren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn hun relatieve eenvoud en de mogelijkheid om tegelijkertijd een groot aantal cellen te analyseren. Kathrin Ohlenschlager, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zal Fura-2 calciumbeeldvorming in mestcellen demonstreren.

Om deze procedure te starten, spuit de geëuthaniseerde muis met 70%ethanol en bevestig hem met zijn rugzijde naar beneden op een schuimblokken met behulp van spelden. Gebruik stompe schaar om de huid over de buik van de muis te verwijderen en vermijd schade aan de buikholte. Injecteer vervolgens zeven milliliter ijskoud RPMI-medium in de buikholte door voorzichtig een naald van 27 gauge in het peritoneum in te brengen.

Boor geen organen door en gebruik een plek in de regio van het epididymale vet om het risico op een orgaanperforatie te verminderen. Na injectie, schud de muis gedurende een minuut om de cellen uit de buikholte los te maken in het RMPI-medium. Schud de muis niet te krachtig om schade aan de inwendige organen en besmetting van de buikholte met bloed te voorkomen.

Hergebruik vervolgens de spuit door deze uit te rusten met een nieuwe 20 gauge cannula. Verplaats de inwendige organen naar één kant door de schuimblokken te kantelen en zachtjes te tikken op de werkbank om de aspiratie van medium van de andere kant gemakkelijker te maken. Breng vervolgens een 20 gauge naald met de punt naar boven in om de vloeistof uit de buik voorzichtig en langzaam te aspireren om verstopping door de inwendige organen te voorkomen.

Verzamel zoveel vloeistof mogelijk. Vervolgens verwijder de naald uit de spuit en breng de verzamelde celsuspensie over in een opvangbuisje op ijs. Gooi een monsterschaaltje weg als er zichtbare bloedbesmetting is.

Centrifugeer de buis met schone celsuspensie bij 300 g gedurende vijf minuten. Aspiraat onder een steriele kap de supernatant. Breng de monsterpellets opnieuw op in koud PMC-medium en breng de celsuspensie over in een celcultuurkolf van 25 vierkante centimeter.

Voeg vervolgens de groeifactoren IL-3 en SCF toe tot de eindconcentraties van respectievelijk 10 nanogram per milliliter en 30 nanogram per milliliter. Incubeer de cellen gedurende ongeveer 48 uur bij 37 graden Celsius tot de volgende procedure. Op dagen 12 tot 15, als er experimenten met stimulatie van plasmalemmale IgE-receptoren gepland zijn, behandel de cellen een nacht met 300 nanogram per milliliter IgE anti-DNP in standaard kweekmedium.

Om Fura-2 beeldvorming voor te bereiden, verdun Fura-2, AM stockoplossing in calcium HBSS tot een eindconcentratie van vijf micromolair om de laadbuffer voor te bereiden. Meng vervolgens 500 microliter van de laadbuffer met 500 microliter van de PMC-celsuspensie. Pipetteer het mengsel in de beeldvormingskamer en incubeer de cellen gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.

Stel het zwaartekrachtvoedingssysteem in met verschillende oplossingen volgens het stimulatieprotocol. Monteer vervolgens het toedieningssysteem op het podium van de omgekeerde microscoop. Bereid een 40X hoog-apertuur olie-immersie objectief voor door een kleine druppel olie-immersieolie erop te plaatsen.

Plaats de beeldvormingskamer met de geladen cellen in het toedieningssysteem en zet het vast om beweging tijdens opname te voorkomen. Zet vervolgens het doorgelaten licht aan en focus op de cellen. Start vervolgens het beeldverwervingsprogramma in de fysiologische acquisitiemodus.

Open het setup-venster en pas de focus en de optimale verwervingstijd aan. Maak een referentiefoto en markeer de cellen als ROI's. Markeer de laatste ROI in een gebied waar geen cellen aanwezig zijn en definieer deze als achtergrond.

Voltooi vervolgens de setup en start de meting met een acquisitiesnelheid van vijf seconden. Voeg vervolgens oplossingen toe bij het juiste cyclusnummer volgens het ontwerp van het experiment. Om de door antigeen geïnduceerde verhoging van intracellulaire calciumconcentratie te meten, breng de tweede spuit-oplossing aan na cyclus 20 en stop met opnemen na cyclus 150.

Om de door compound 48/80 geïnduceerde verhoging van intracellulaire calciumconcentratie te meten, breng de derde spuit-oplossing aan na cyclus 20 en stop met opnemen na cyclus 150. Om de verhoging van intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door SOCE te meten, breng de vierde spuit-oplossing aan na cyclus 10, breng de vijfde spuit-oplossing aan na cyclus 70, breng de vierde spuit-oplossing aan na cyclus 120, breng de eerste spuit-oplossing aan na cyclus 150 en stop met opnemen na cyclus 220. Druk in het verwervingsprogramma achtereenvolgens op de knoppen Start Cutter, Mark All, Convert All, Physiology Measurements, OK en vervolgens nogmaals OK.

Sla de bestanden op als tabellen en beeldstacks voor offline analyse. Om de bèta-hexosaminidase-afgifte te meten, breng 100 microliter van de celsuspensie per putje over naar een 96-well V-bodem puttenplaat. Voeg 25 microliter van een stimulatie- of controle-oplossing toe aan elke put.

Vervolgens incubeer de cellen gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Stop vervolgens de reactie door de 96-well plaat vijf minuten op ijs te plaatsen. Centrifugeer vervolgens de plaat bij vier graden Celsius gedurende vier minuten bij 120 g.

Breng 120 microliter van de supernatant over naar een vlakbodem 96-well plaat en plaats deze op ijs. Vermijd voorzichtig om de celpellets aan te raken, maar aspireer de supernatant volledig. Voeg vervolgens 125 microliter lyseerbuffer toe aan de celpellets.

Incubeer de celpellets vijf minuten bij kamertemperatuur en suspendeer ze na de incubatie opnieuw door herhaaldelijk te pipetteren. Pipetteer 25 microliter van de vier millimolair pNAG-oplossing in de vereiste putjes van een nieuwe vlakbodem 9