Name: Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer hoe optogenetica en kunstmatige microRNAs worden gecombineerd om genknockdown-effecten op presynaptische functie in intacte neuronale circuits te bestuderen. Deze methode maakt selectieve monitoring van synaptische transmissie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) voor ondersteuning en Carmela Vitale voor het helpen met de demonstratie. Dit werk werd gefinancierd door IIT en de Compagnia San Paolo (subsidie no. 9734 voor LAC).

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Co uitdrukking van een optogenetic-sonde en een miR tegen een presynaptische gen van belang biedt een krachtige aanpak karakteriseren van het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale circuits. Voor deze experimentele aanpak is het belangrijk om te identificeren en te karakteriseren miRs die zeer doelmatig en selectief in het kloppen van het gen van belang in native systemen. Indien mogelijk, moeten twee of meer onafhankelijke miRs tegen de dezelfde mRNA van belang te controleren voor eventuele af-target effecten worden gebruikt. Redding-experimenten, waarin een miR-resistente gen is opnieuw in het systeem, kunnen worden gebruikt als een besturingselement voor specificiteit.
Met behulp van de dezelfde constructie wil een optogenetic voorziet sonde en een miR stimuleren optisch alleen de presynaptische neuronen die zijn gemanipuleerd. Dit is niet mogelijk met elektrische stimulaties omdat zij geen onderscheid tussen besmette en niet-besmette neuronen maken, waardoor de productie van gemengd en verdunde resultaten. Omdat optische stimulaties meerdere actie potentials15veroorzaken kunnen, is het belangrijk om te kiezen voor alleen de snelste optogenetic sondes, onder een groeiende palet15,19,20,21. Daarnaast is het essentieel om ervoor te zorgen dat optische stimulatie er niet toe brengt een directe depolarisatie van exocytose los, om te voorkomen dat het omzeilen van enkele van de stappen van synaptische transmissie die men wenst te onderzoeken van22.
De experimentele aanpak beschrijven we hier, maakt het mogelijk om te evalueren in parallel de fysiologische relevantie van meerdere presynaptische genen van belang binnen een bepaald tijdsbestek (4-6 maanden). Het is echter belangrijk om te onthouden dat knockdowns zelden 100% bereiken. RAAVs moeten bovendien worden uitgedrukt voor ten minste twee weken te voorzien in maximale vechtpartij en vol expressie van de optogenetic sonde, die een beperking van de tijd vertegenwoordigen kan, bij het onderzoeken van de vroege ontwikkelings processen. Hoewel meer tijd in beslag, voorwaardelijke knock-out muizen beperkt tot presynaptische neuronen, over het algemeen leiden tot volledige verwijdering van het gen van belang en bieden daarom een geldig complementaire aanpak.
Een specifieke voordeel van de miR-technologie is dat hierdoor de uitdrukking van meerdere miRs van de dezelfde promotor. Deze eigenschap is vooral gebruikt om vechtpartij efficiënter door het invoegen van meerdere exemplaren van dezelfde miR of verschillende miRs tegen hetzelfde target gen. Het kan echter ook gebruikt om knockdown meerdere genen met het uitspreken van miRs tegen7,23van de genen van de verschillende doelgroepen. Deze eigenschap kan worden gebruikt om meerdere presynaptische eiwitten om te ontleden presynaptische signaalroutes stilte.
We hebben hier optogenetics gecombineerd met kunstmatige miRs te karakteriseren van de effecten van gene knockdown op presynaptische functie in acute hippocampal plakjes. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om te manipuleren en sonde neuronale circuit in vivo. Bovendien, zouden kunstmatige miRs combineren met chemogenetic benaderingen een ondervragen neuronale circuit op langere tijd schalen.

Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale schakelingen te karakteriseren. Onderzoeken van de presynaptische functie in intact neuronale circuit is uitdagend omdat vele presynaptische los te klein zijn en ver weg van het soma dat gecombineerde moleculaire en elektrofysiologische interventies. Hoewel de interferentie van RNA biedt een krachtig en flexibel middel om vechtpartij synaptic eiwitten1, is deze aanpak gebruikt spaarzaam te onderzoeken van exocytose functie, want het is moeilijk op te sporen van de effecten van knockdown met behulp van traditionele elektrische stimulaties, die geen onderscheid tussen maken gemanipuleerd en naïef presynaptische los2. Hier beschrijven we hoe te combineren met kunstmatige microRNA (miR)-gemedieerde van RNA-interferentie met onlangs ontwikkelde optogenetic-technologie om het bereiken van selectieve stimulatie van gemanipuleerde presynaptische los in acute hersenen plakjes.
Hoewel voorwaardelijke knock-out muizen in combinatie met electrofysiologie kunnen ook worden gebruikt voor het onderzoeken van de functie van de presynaptische eiwitten3,4, nodig onze strategie niet de ontwikkeling en het onderhoud van genetisch gemodificeerde muis lijnen en ook gemakkelijk kan worden gebruikt om het neerhalen van specifieke isoforms van een gen. Ten opzichte van meer algemeen gebruikte korte haarspeld RNAs (shRNAs), kunstmatige miRs, die we hier gebruiken, bieden belangrijke voordelen voor knockdown in neuronen. In tegenstelling tot shRNAs, kunnen ze onder de controle van een polymerase II promotor1worden uitgedrukt. Dus, een enkele promotor kan worden gebruikt om te rijden de expressie van miR zowel een optogenetic-sonde, samen met een fluorescerende verslaggever. Op deze manier kan de grootte van de constructie worden gehouden binnen de grenzen van de verpakking van recombinante virussen adeno-geassocieerde (rAAV, figuur 1A). Ook vermindert het gebruik van een interne constructie en een enkele promotor experimentele variabiliteit omdat het zorgt voor de uitdrukking van de miR, de optogenetic sonde en de fluorescerende verslaggever in een vaste verhouding.
Wij hebben onlangs deze technologie te onderzoeken van de rol van alternatief afgesplitste isoforms van exocytose calcium kanalen in de hippocampus5toegepast. Een dergelijke strategie geldt over het algemeen aan het bestuderen van de fysiologische relevantie van andere presynaptically uitgedrukte proteïnen in een circuit van de hersenen van belang.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>Acrylamide/Bis-acrylamide, 30% solution</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Animal Temperature Controller with heat pad</td><td>WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Brain slices Prechamber</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera-based imager</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; MP</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture reagents</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent substrate</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Cytosine &beta;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin ointment</td><td>Local pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Injection micropipettes</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Inorganic salts &amp; detergents</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2-creatine phosphate</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrane</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 &micro;m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Ocular lubricant</td><td>Local pharmacy</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate inhibitors</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting devices</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone iodine</td><td>Local pharmacy</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol Lysis Reagent</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic apparatus</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetics combineren met kunstmatige micrornas te karakteriseren van de effecten van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale circuits

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Het doel van dit protocol is te karakteriseren van het effect van gene knockdown op presynaptische functie binnen intact neuronale circuits. We beschrijven een werkstroom op hoe te combineren met kunstmatige microRNA (miR)-gemedieerde van RNA-interferentie met optogenetics tot selectieve stimulatie van gemanipuleerde presynaptische los in acute hersenen plakjes. De experimentele aanpak impliceert het gebruik van een enkele virale constructie en een enkel neuron-specific promotor te rijden van de uitdrukking van zowel een optogenetic-sonde en kunstmatige miR(s) tegen presynaptische gene(s). Wanneer stereotactically geïnjecteerd in de regio van de hersenen van belang, maakt de uitgesproken constructie het mogelijk om te stimuleren met licht uitsluitend de neuronen met verminderde expressie van de gene(s) onderzochte. Deze strategie vereist geen ontwikkeling en onderhoud van genetisch gemodificeerde muis lijnen en kan in principe worden toegepast op andere organismen en op elke neuronale gen van keuze. Wij hebben onlangs toegepast om te onderzoeken hoe het knockdown van alternatieve splice isoforms van exocytose P/Q-type spanning-gated calcium kanalen (VGCCs) op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 excitatory synapsen in acute hippocampal plakjes regelt. Een soortgelijke aanpak kan ook worden gebruikt om te manipuleren en sonde van de neuronale circuit in vivo.

De hierboven beschreven procedures bieden een robuuste methode om te beoordelen hoe synaptische transmissie wordt beïnvloed door de knockdown van synaptic eiwitten in de presynaptische neuronen. Representatieve resultaten op hoe het knockdown alternatief isoforms van exocytose Cav2.1 splice (P/Q-type) VGCCs regelt op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 excitatory synapsen hieronder als voorbeeld gegeven worden.
CAv2.1 (P/Q-type) kanalen zijn de overheersende presynaptische VGCCs op de meest snelle synapsen in het centrale zenuwstelsel. Alternatieve splicing van de wederzijds exclusieve exons 37a en 37b van de porie-vormende α1 subeenheid van Cav2.1 (α1A) produceert twee grote varianten, Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Om te bepalen of Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb] differentieel synaptische transmissie en plasticiteit in rat hippocampal piramidale neuronen regelen, we voor het eerst ontwikkeld isovorm-specifieke miRs aan knockdown selectief Cav 2.1 [Eva] of Cav2.1 [EFb]5. Ondanks het korte formaat (97 bp) en hoge gelijkenis (61.86% identiteit op het niveau van de nucleotide) tussen exons 37a en 37b, we drie miR sequenties tegen kon ontwerpen rat Cav2.1 [Eva] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) en twee tegen rat Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) met voorspelde hoogrenderende vechtpartij. Als negatieve controle (miR controle), hebben we de pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg plasmide met een reeks die de enige bekende gewervelde gen niet richt gebruikt. Gebaseerd op een eerste scherm in cuvetten van het HEK 293 tegen heterologe kanalen, we geselecteerd miR EFa1, miR EFa3 en miR EFb2 en hun expressie cassettes gekloond in de 3-' UTR van de vector pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, die is ontworpen voor de productie van rAAVs en waar de synapsin promotor rijdt uitdrukking van de ultrasnelle channelrhodopsin ChETA, het rood fluorescerende eiwit TdTomato en de ingevoegde miR (Figuur 1). Wij ook gedupliceerd de cassette van de expressie van miR EFb2 de vechtpartij efficiëntie van deze miR te verhogen.
Vervolgens wij bereid rAAV1/2 voor de bovenstaande vier constructies en gekwantificeerd hun vechtpartij efficiëntie en selectiviteit in primaire rat neuronale culturen met behulp van isovorm-specifieke qRT-PCR. miR EFa1 en miR EFa3 verminderd mRNA van inheemse Cav2.1 [Eva] met ~ 70% maar niet die van Cav2.1 [EFb], terwijl miR EFb verminderd mRNA van inheemse Cav2.1 [EFb] door ~ 60%, maar niet die van Cav2.1 [Eva] (Figuur 2).
Wij vervolgens stereotactically elk van de vier rAAV1/2 in het CA3 gebied ingespoten van de hippocampus voor P18 rats (figuur 3A-C), met de coördinaten van de (A-P/M-L/D-V van Bregma) −2.6 / ± 2,9 / −2.9. Vijftien tot twintig-vier dagen na injectie, we bereid van acute hippocampal segmenten uit rAAV1/2-geïnjecteerd ratten en TdTomato fluorescentie gebruikt om te bevestigen de expressie en de localisatie van rAAVs (figuur 3B). Om te onderzoeken of presynaptische knockdown Cav2.1 [Eva] of Cav2.1 [EFb] beïnvloed op korte termijn synaptische plasticiteit op CA3 aan CA1 synapsen, we selectief besmette CA3 neuronen met korte 473 nm lichte laserpulsen (2 ms durende gestimuleerd ; Figuur 3 c), en de resulterende EPSCs geregistreerd door het patchen piramidale neuronen in de proximale aan mediale tract CA1 regio (Figuur 3 c). We vonden dat het knockdown van Cav2.1 splice isoforms beïnvloed reacties op gepaarde-pulse stimulatie in tegengestelde richtingen: knockdown van Cav2.1 [Eva] (miR EFa1 of miR EFa3) gestimuleerd gekoppeld-pulse versoepeling (PPF) Overwegende dat de vechtpartij van Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) afgeschaft (figuur 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figuur 1: Schema van de constructies voor gecombineerde expressie van de ultrasnelle optogenetic sonde ChETA en isovorm-specifieke miRs tegen Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]. (A) kaart van de rAAV bouwen pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, met een synapsin promotor (Syn), de ultrasnelle channelrhodopsin ChETA geanelleerd tot TdTomato, en in de proximale 3' UTR, een Cav2.1 splice isovorm-specifieke miR. Restrictie-enzymen getoond zijn enkele scharen. (B) Top, regeling van de expressie-cassette. De synapsin promotor rijdt uitdrukking van zowel ChETA-TdTomato en een isovorm-specifieke miR. Bodem, omgekeerde aanvulling van de target 21-nucleotide sequences, die deel van de miR-cassette uitmaken. Voor miR EFb2 werden twee identieke miR cassettes uitgedrukt in tandem een na de andere. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Figuur 2. Evaluatie van de vechtpartij efficiëntie en selectiviteit van isovorm-specifieke miRs voor Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb]. Isovorm-specifieke qRT-PCR analyse op RNA van 17-18 DIV primaire culturen besmet op 6 DIV met rAAVs uitdrukken miRs gericht op beide Cav2.1 [Eva] (miR EFa1 en miR EFa3) dat werd geïsoleerd of Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Gegevens worden genormaliseerd naar de negatieve controle (miR controle). miR EFa1 en miR EFa3 aanzienlijk en selectief verminderen mRNA van Cav2.1 [Eva] (n = 8 en 7 culturen, respectievelijk), terwijl miR EFb aanzienlijk en selectief mRNA van Cav2.1 [EFb vermindert] (n = 4 culturen; *** p < 0,001; one-way analyse van variantie test gevolgd door na detest Tukey-Kramer). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM. Dit percentage is aangepast van Thalhammer, A. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Figuur 3. Beoordeling van de rol van Cav2.1 [Eva] en Cav2.1 [EFb] in de inheemse hippocampus door gerichte stimulatie van knock-down neuronen met optogenetics. (A) regeling van de cassette van de expressie van de constructies van de rAAV gebruikt voor in-vivo -infectie. (B) Hippocampal deel toont de fluorescentie van dat TdTomato is beperkt tot de regio CA3 en haar prognoses. (C) experimentele configuratie: laserstraal op CA3 waarin werd geregisseerd en patch klem opnames werden uitgevoerd vanaf CA1 piramidale neuronen. (D) 2 ms durende blauw (473 nm) lichte laserpulsen scheen bij 20 Hz roepen EPSCs waarvan PPF is miRs gericht op Cav2.1 [Eva] stegen en afgeschaft door miR voor Cav2.1 [EFb]. Samenvatting van de (E) van gepaarde-pulse verhouding voor experimenten zoals in (D), tonen een toename in PPF voor miR EFa1 miR EFa3 en een afname van miR EFb2, ten opzichte van miR controle (n = 9-11 opnamen; * p = 0,02; ** p = 0,01; *** p < 0.0004; analyse van covariantie). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM. Dit percentage is aangepast van Thalhammer, A. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Het algemene doel van het combineren van door kunstmatige microRNA gemedieerde RNA-interferentie met optogenetica is om het effect van genknockdown op presynaptische functie binnen intacte neuronale circuits te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van synaptische fysiologie, zoals het aanpakken van de fysiologische rol van presynaptische eiwitten in intacte hersencircuits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de synaptische transmissie selectief te monitoren bij neuronen met verminderde expressie van het presynaptische eiwit dat onderzocht wordt.Ook hebben we deze methode gebruikt om de presynaptische functie in acute herfsneden te onderzoeken. Het kan ook worden toegepast om neuronale veiligheid in vivo te manipuleren en te onderzoeken. De procedure zal worden gedemonstreerd door Carmela Vitale, een afstudeerstudent van ons laboratorium.Na het ontwerpen van de microRNA's en het construeren van een recombinant vector om de microRNA's en de optogenetische sonde tot expressie te brengen, bereid primaire neuronale culturen voor uit het hersengebied van belang. Om dit te doen, volg een gevestigd corticoculturing-protocol van L.A.Cingolani en Company met de volgende aanpassingen. Gebruik eerst zes-well platen, plateer een half miljoen neuronen per well en gebruik 2,5 milliliter aanhechtingsmedium per well.Nadat de plaat vier uur is geïncubeerd, wissel naar 3,3 milliliter onderhoudsmedium per well, en als overgroei van astrocyten wordt waargenomen, voeg dan 0,5 milliliter onderhoudsmedium toe dat is aangevuld met 7,5 micromolar AraC bij drie tot vier DIV's. Bij vijf tot zes DIV's infecteert u drie wells voor elke microRNA om te testen. Gebruik de laagste infectieuze dosis die ten minste 99%van de neuronen zal infecteren.Voeg het virus direct toe aan de neuronen, meng voorzichtig en plaats de platen terug in de incubator bij 37 graden Celsius. Bij 17 tot 18 DIV's lysee de neuronen voor een RNA-extractie. Kantel de platen en gebruik glazen pipetten om al het medium uit elke well te verwijderen.Voeg vervolgens onmiddellijk 700 microliter lyseregel aan elke well toe. Na een korte menging, brengt u het cellysaat uit elke well over naar afzonderlijke 1,5-milliliter buisjes. Voeg vervolgens 140 microliter chloroform toe aan elk lysate.Sluit snel de buisjes en schud krachtig gedurende 15 seconden om de inhoud te emulgeren. Centrifugeer vervolgens de buisjes 15 minuten bij 12.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng vervolgens voorzichtig de bovenste waterige fase die RNA bevat over naar een nieuwe buis.Laat de pipettenpunt niet de organische fase raken. Voeg aan de waterige fase 1,5 volumes van 100%ethanol toe en pipet de oplossing langzaam drie keer om te mengen. Zuiver vervolgens het RNA met een commercieel verkrijgbaar kit en bepaal de opbrengsten.Verwacht minimaal 3,5 microgram per monster. De verhoudingen voor zuiverheid ten opzichte van eiwitten en organische verbindingen moeten beide minimaal 1,9 zijn. Gebruik vervolgens een kit om 250, 500 of 1.000 nanogram RNA te retrotranscriberen.Bepaal vervolgens de knockdown-efficiëntie voor het endogene gen van belang door kwantitatieve RTPCR. Streef naar een knockdown-efficiëntie van minimaal 60%. Gebruik voor dit protocol een dier dat 15 dagen eerder of langer RAAV12 in de hersenen had geïnjecteerd volgens een eerder gepubliceerd protocol van A.Cetin en Company. Isolateer de hersenen en maak acute herfsneden met een vibratome en met gas doordrenkt ijskoud ACFF.Verzamel de sneden van het gebied van belang en minimaliseer hun blootstelling aan licht om activering van de optogenetische sonde te voorkomen. Laat de sneden 30 minuten herstellen bij 37 graden Celsius in dezelfde ACFF. Gebruik een kamer die speciaal is ontworpen voor het houden van herfsneden.Breng vervolgens de sneden terug naar kamertemperatuur, waar ze gezond blijven voor zes tot acht uur. Om verder te gaan, brengt u een snede over naar de opnamekamer en superfuseert u deze bij twee milliliter per minuut van ACFF. Controleer vervolgens kort het signaal van de tot expressie gebrachte fluorescente reporter om de lokalisatie en intensiteit van infectie vast te stellen.Vul vervolgens een patch-elektrode met de intracellulaire oplossing. Onder infraroodverlichting verkrijgt u nu een strak-afgesloten wholesale configuratie op een neuron dat synaptische input ontvangt van de geïnfecteerde neuronen. De serieweerstand kan ongecompenseerd blijven, maar deze moet constant en laag zijn.Als bijvoorbeeld CA3-piramideneuronen geïnfecteerd zijn, patcht u piramideneuronen in de proximale tot mediale tractus van de CA1-regio. Wanneer de cellen er gezwollen of verschrompeld uitzien, wanneer het patchen moeilijk wordt of de batches onstabiel zijn, zijn de geselecteerde sneden niet meer gezond genoeg om van op te nemen. Gebruik vervolgens farmacologie om de synaptische stromen onder onderzoek te isoleren.Als bijvoorbeeld het doel is om excitatoire synaptische transmissie te onderzoeken, blokkeert u inhibitoire synaptische transmissie door bicuculline toe te voegen aan het bad. Roep vervolgens synaptische stromen op, zoals excitatoire postsynaptische stromen, met behulp van een 473-nanometer blauwe laser gekoppeld aan een optische vezel gepositioneerd op de somata van de geïnfecteerde neuronen. Richt de laser niet op de axonen van de neuronen.Vermijd bijvoorbeeld het schijnen van licht op de Shaffer-collateralen. Directe depolarisatie van de axonen is niet wenselijk. Pas vervolgens de stimulatielengte aan tot een minimum om de mogelijkheid te verkleinen dat er meer dan één actiepotentiaal per lichtpuls wordt opgewekt.Verfijn vervolgens de intensiteit van de laser om kleine maar duidelijk detecteerbare synaptische stromen op te wekken. Voor excitatoire synaptische transmissie tussen CA3 en CA1 piramideneuronen, pas de intensiteit van de laser aan om synaptische stromen van 20 tot 50 picoamps op te wekken. Aan het einde van het experiment, breng tetrodotoxine aan op 0,5 micromolar om de natriumkanalen te blokkeren.De gevoeligheid van de optisch opgewekte stromen

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates microRNA-mediated inhibition of excitatory synaptic currents in mouse hippocampal brain slices. The CA3 neurons were infected with a recombinant viral vector harboring a construct for expressing a fluorescent reporter, a light-activated membrane channel, and a microRNA that downregulates the expression of voltage-gated calcium channels. Upon placing a slice in a recording chamber and patching a CA1 neuron with a recording pipette, light pulses were used to stimulate the...

MicroRNA-Mediated Inhibition of Excitatory Postsynaptic Currents in Mouse Hippocampal Slices

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Leer hoe optogenetica en kunstmatige microRNAs worden gecombineerd om genknockdown-effecten op presynaptische functie in intacte neuronale circuits te bestuderen. Deze methode maakt selectieve monitoring van synaptische transmissie mogelijk.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits (Video) | JoVE Journal

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

Meer video's verkennen