Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

Het algemene doel van het combineren van door kunstmatige microRNA gemedieerde RNA-interferentie met optogenetica is om het effect van genknockdown op presynaptische functie binnen intacte neuronale circuits te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van synaptische fysiologie, zoals het aanpakken van de fysiologische rol van presynaptische eiwitten in intacte hersencircuits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de synaptische transmissie selectief te monitoren bij neuronen met verminderde expressie van het presynaptische eiwit dat onderzocht wordt.

Ook hebben we deze methode gebruikt om de presynaptische functie in acute herfsneden te onderzoeken. Het kan ook worden toegepast om neuronale veiligheid in vivo te manipuleren en te onderzoeken. De procedure zal worden gedemonstreerd door Carmela Vitale, een afstudeerstudent van ons laboratorium.

Na het ontwerpen van de microRNA's en het construeren van een recombinant vector om de microRNA's en de optogenetische sonde tot expressie te brengen, bereid primaire neuronale culturen voor uit het hersengebied van belang. Om dit te doen, volg een gevestigd corticoculturing-protocol van L.A.Cingolani en Company met de volgende aanpassingen. Gebruik eerst zes-well platen, plateer een half miljoen neuronen per well en gebruik 2,5 milliliter aanhechtingsmedium per well.

Nadat de plaat vier uur is geïncubeerd, wissel naar 3,3 milliliter onderhoudsmedium per well, en als overgroei van astrocyten wordt waargenomen, voeg dan 0,5 milliliter onderhoudsmedium toe dat is aangevuld met 7,5 micromolar AraC bij drie tot vier DIV's. Bij vijf tot zes DIV's infecteert u drie wells voor elke microRNA om te testen. Gebruik de laagste infectieuze dosis die ten minste 99%van de neuronen zal infecteren.

Voeg het virus direct toe aan de neuronen, meng voorzichtig en plaats de platen terug in de incubator bij 37 graden Celsius. Bij 17 tot 18 DIV's lysee de neuronen voor een RNA-extractie. Kantel de platen en gebruik glazen pipetten om al het medium uit elke well te verwijderen.

Voeg vervolgens onmiddellijk 700 microliter lyseregel aan elke well toe. Na een korte menging, brengt u het cellysaat uit elke well over naar afzonderlijke 1,5-milliliter buisjes. Voeg vervolgens 140 microliter chloroform toe aan elk lysate.

Sluit snel de buisjes en schud krachtig gedurende 15 seconden om de inhoud te emulgeren. Centrifugeer vervolgens de buisjes 15 minuten bij 12.000 keer G bij vier graden Celsius. Breng vervolgens voorzichtig de bovenste waterige fase die RNA bevat over naar een nieuwe buis.

Laat de pipettenpunt niet de organische fase raken. Voeg aan de waterige fase 1,5 volumes van 100%ethanol toe en pipet de oplossing langzaam drie keer om te mengen. Zuiver vervolgens het RNA met een commercieel verkrijgbaar kit en bepaal de opbrengsten.

Verwacht minimaal 3,5 microgram per monster. De verhoudingen voor zuiverheid ten opzichte van eiwitten en organische verbindingen moeten beide minimaal 1,9 zijn. Gebruik vervolgens een kit om 250, 500 of 1.000 nanogram RNA te retrotranscriberen.

Bepaal vervolgens de knockdown-efficiëntie voor het endogene gen van belang door kwantitatieve RTPCR. Streef naar een knockdown-efficiëntie van minimaal 60%. Gebruik voor dit protocol een dier dat 15 dagen eerder of langer RAAV12 in de hersenen had geïnjecteerd volgens een eerder gepubliceerd protocol van A.Cetin en Company. Isolateer de hersenen en maak acute herfsneden met een vibratome en met gas doordrenkt ijskoud ACFF.

Verzamel de sneden van het gebied van belang en minimaliseer hun blootstelling aan licht om activering van de optogenetische sonde te voorkomen. Laat de sneden 30 minuten herstellen bij 37 graden Celsius in dezelfde ACFF. Gebruik een kamer die speciaal is ontworpen voor het houden van herfsneden.

Breng vervolgens de sneden terug naar kamertemperatuur, waar ze gezond blijven voor zes tot acht uur. Om verder te gaan, brengt u een snede over naar de opnamekamer en superfuseert u deze bij twee milliliter per minuut van ACFF. Controleer vervolgens kort het signaal van de tot expressie gebrachte fluorescente reporter om de lokalisatie en intensiteit van infectie vast te stellen.

Vul vervolgens een patch-elektrode met de intracellulaire oplossing. Onder infraroodverlichting verkrijgt u nu een strak-afgesloten wholesale configuratie op een neuron dat synaptische input ontvangt van de geïnfecteerde neuronen. De serieweerstand kan ongecompenseerd blijven, maar deze moet constant en laag zijn.

Als bijvoorbeeld CA3-piramideneuronen geïnfecteerd zijn, patcht u piramideneuronen in de proximale tot mediale tractus van de CA1-regio. Wanneer de cellen er gezwollen of verschrompeld uitzien, wanneer het patchen moeilijk wordt of de batches onstabiel zijn, zijn de geselecteerde sneden niet meer gezond genoeg om van op te nemen. Gebruik vervolgens farmacologie om de synaptische stromen onder onderzoek te isoleren.

Als bijvoorbeeld het doel is om excitatoire synaptische transmissie te onderzoeken, blokkeert u inhibitoire synaptische transmissie door bicuculline toe te voegen aan het bad. Roep vervolgens synaptische stromen op, zoals excitatoire postsynaptische stromen, met behulp van een 473-nanometer blauwe laser gekoppeld aan een optische vezel gepositioneerd op de somata van de geïnfecteerde neuronen. Richt de laser niet op de axonen van de neuronen.

Vermijd bijvoorbeeld het schijnen van licht op de Shaffer-collateralen. Directe depolarisatie van de axonen is niet wenselijk. Pas vervolgens de stimulatielengte aan tot een minimum om de mogelijkheid te verkleinen dat er meer dan één actiepotentiaal per lichtpuls wordt opgewekt.

Verfijn vervolgens de intensiteit van de laser om kleine maar duidelijk detecteerbare synaptische stromen op te wekken. Voor excitatoire synaptische transmissie tussen CA3 en CA1 piramideneuronen, pas de intensiteit van de laser aan om synaptische stromen van 20 tot 50 picoamps op te wekken. Aan het einde van het experiment, breng tetrodotoxine aan op 0,5 micromolar om de natriumkanalen te blokkeren.

De gevoeligheid van de optisch opgewekte stromen