Name: Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Leer hoe je tong-extracellulaire matrix bereidt via decellularisatie voor 3D-cultuur van tongplaveiselcelcarcinoom. Deze methode biedt een realistisch in-vitro model dat klinische tumorhistopathologie nabootst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de steun van onderzoekssubsidies van nationale Natural Science Foundation van China (31371390), het programma van de staat High-Tech ontwikkelingsproject (2014AA020702) en het programma van Guangdong wetenschap en technologie (2016B030231001).

Alle dierlijke werk werd verricht overeenkomstig de Akte van dierenwelzijn, institutioneel richtsnoeren en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité, zon Yat-sen-universiteit.
1. voorbereiding van de TEM
<ol><li>Uitvoeren van muizen door cervicale dislocatie en verwijder de tongen met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet.</li>
	<li>De tongen in 75% ethanol voor 3 min. onderdompelen en elke tong gestoken met een 1,5 mL Eppendorf (EP) buis met 1 mL 10 mM steriele fosfaat gebufferde oplossing (PBS). Opmerking: De concentratie van PBS in alle van de volgende stappen is hetzelfde als de concentratie in deze stap.</li>
	<li>Lysis van de cel door bevriezing dooi: de tongen in EP buizen bij-80 ° C gedurende 1 h bevriezen en ontdooien dan de tongen bij kamertemperatuur voor 45 min voor 3 cycli.</li>
	<li>Laden elke tong op een stuk van chirurgische hechtdraad met behulp van een chirurgische naald en het einde van de hechtdraad met een klein stukje van steriele zilverpapier wikkel. De bewerking uitvoeren in een 3,5 cm of 6 cm cultuur schotel met 75% ethanol onder steriele omstandigheden. Opmerking: De juiste lengte van elk stuk van chirurgische hechtdraad is ongeveer 20 cm, en de juiste grootte van elk stukje zilverpapier is over 0.3 cm2 (1 cm × 0.3 cm). De tong moet worden geladen in de buurt van het zilverpapier.</li>
	<li>Spoel elke tong met 3 mL steriele PBS in een 3,5 cm of 6 cm cultuur schotel voor 30 s. uitvoeren deze operatie onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>De tongen met ultrazuiver water wassen: ampicilin in een wide-mouth-fles met 250 mL steriele ultrazuiver water toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Zet de tongen in de fles met een roer-bar. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden. Opmerking: Maximaal 5 tongen kunnen worden gebracht in de dezelfde fles als tegenprestatie twining van de hechtdraad. Het zilverpapier is aan het einde van de hechtdraad in de fles om te voorkomen dat de tong glijden af. De tongen moeten worden geplaatst van 2 cm hoog vanaf de onderkant van de fles door het aanpassen van de lengte van de hechtdraad blijft in de fles. Deze opmerking is ook voor stappen 1.8, 1.10 1.12 en 1.16.</li>
	<li>Zet de fles op een magneetroerder voor 12u.</li>
	<li>Wassen van de tongen met NaCl: ampicilin toevoegen in een wide-mouth fles met 250 mL steriele 1 M NaCl om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.</li>
	<li>Door Triton X-100 lysis van de cel: ampicilin toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL in een wide-mouth-fles met 250 mL steriele 2% Triton X-100 in PBS. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Zet de fles op een magneetroerder gedurende 48 uur.</li>
	<li>Wassen tongen met CaCl2/MgCl2: ampicilin in een wide-mouth fles met 250 mL steriele 5 mM CaCl2/MgCl2 toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.</li>
	<li>Vertering door DNase: Voeg 1 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) aan elke EP-buis. DNase respectievelijk in HBSS toevoegen om een eindconcentratie van 300 µM. Beweeg elke tong in elk EP-buis, met een deel van de hechtdraad buiten de buis. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden. Opmerking: Zorg ervoor dat het deel van de hechtdraad die binnen de flessen in de vorige stappen blijft ook in de EP-buis in deze stap blijft, en ervoor te zorgen dat het deel van de hechtdraad dat buiten de flessen in de vorige stappen blijft ook buiten de EP buis in deze stap blijft.</li>
	<li>Incubeer de tongen in EP buizen bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Wassen van de tongen met PBS: ampicilin in een wide-mouth fles met 250 mL steriele PBS toevoegen om een eindconcentratie van 90 µg/mL. Verplaats de tongen en de roer-bar in de fles. Draai de fles dop met een deel van de hechtdraad resterende buiten de fles. Deze bewerking uitvoeren onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Zet de fles op een magneetroerder gedurende 24 uur.</li>
	<li>Bewaren de bereid TEM in steriele PBS bij 4 ° C tot gebruik.</li>
</ol>2. driedimensionale (3D) reconstitutie van TSCC
<ol><li>
Statische TSCC modelbouw
	<ol>
<li>Zaad 1.0 x 106 afzonderlijke TSCC cellen (Cal27) in een 3,5 cm cultuur schotel. Voeg 3 mL Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium/F12 (DF12) met 10% foetale runderserum (FBS), 90 µg/mL ampicilin, en 90 µg/mL kanamycine.</li>
		<li>Cultuur de Cal27 cellen bij 37 ° C gedurende 2 à 3 dagen. Zorg ervoor dat de cellen ten minste 60 omvatten % ruimte van de onderkant van de schotel.</li>
		<li>TEM op de Cal27 enkelgelaagde in de cultuur-schotel laden.</li>
		<li>Zet de schotel in een CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 28 dagen.</li>
		<li>Vernieuw het kweekmedium elke dag tijdens de cel cultuur. De CO2 -concentratie in de incubator is 5%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stirred TSCC modelbouw
	<ol>
<li>
Voorbereiding van een zelf-gemaakte stirred minibioreactor
		<ol>
<li>Haal de zuiger van een 10 mL spuit.</li>
			<li>Graven van een gat (doorsnede 1 cm) in de buurt van de lagere terminal van de staaf en laden van een roer-bar in het gat.</li>
			<li>Graven van een gat (diameter van 0,5 cm) in het midden van de fles dop van een plastic fles wide-mouth en zet de zuigerstang via het GLB.</li>
			<li>Snijd de helft van een tube van 50 mL centrifuge en het lassen aan de buitenkant van de fles dop.</li>
			<li>Hechten vishaken aan de staaf door inwikkeling van de staaf met visserij lijnen die zijn gebonden aan de vishaken. Opmerking: Maximaal 4 vishaken kunnen worden bevestigd aan een staaf.</li>
			<li>Autoclaaf de zelf-gemaakte complex vóór gebruik. Opmerking: Geen autoclaaf de plastic fles wide-mouth. Gebruik een nieuwe steriele plastic wide-mouth fles terwijl het kweken van cellen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dynamische celkweek
	<ol>
<li>Zaad 1.0 x 106 afzonderlijke Cal27 cellen in de zelf-gemaakte minibioreactor. Voeg 150 mL DF12 medium dat 10% FBS, 90 µg/mL ampicilin en 90 µg/mL kanamycine bevat.</li>
		<li>TEM laden op de minibioreactor met behulp van de vishaken aangesloten op de staaf.</li>
		<li>Draai de dop van de fles en zet de minibioreactor op een magneetroerder. Activeer de minibioreactor bij 200 t/min in een CO2 incubator bij 37 ° C voor 7 tot 14 dagen. Opmerking: De concentratie van CO2 in de CO2 incubator is 5%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
<li>Ng, S. L., Narayanan, K., Gao, S., Wan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restricted+progenitors+for+the+repopulation+of+decellularized+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Lineage restricted progenitors for the repopulation of decellularized heart.</a> Biomaterials. 32, 7571-7580 (2011).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat. Med. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
<li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+from+an+intact+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 16, 525-532 (2010).</li>
<li>Baptista, P. M., Siddiqui, M. M., Lozier, G., Rodriguez, S. R., Atala, A., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat. Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonhuman+primate+model+of+lung+regeneration%3A+detergent-mediated+decellularization+and+initial+in+vitro+recellularization+with+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">A nonhuman primate model of lung regeneration: detergent-mediated decellularization and initial in vitro recellularization with mesenchymal stem cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 2437-2452 (2012).</li>
<li>Daly, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+binding+and+recellularization+of+decellularized+mouse+lung+scaffolds+with+bone+marrow-derived+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells.</a> Tissue Eng. Pt A. 18, 1-16 (2012).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+orthotopic+transplantation+of+a+bioartificial+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung.</a> Nat. Med. 16, 927-933 (2010).</li>
<li>Petersen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+lungs+for+in+vivo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered lungs for in vivo implantation.</a> Science. 329, 538-541 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2581-2591 (2010).</li>
<li>Wallis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+detergent-based+protocols+for+mouse+lung+de-cellularization+and+re-cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of detergent-based protocols for mouse lung de-cellularization and re-cellularization.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 18, 420-432 (2012).</li>
<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+experimental+orthotopic+transplantation+of+a+bioengineered+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney.</a> Nat. Med. 19, 646-651 (2013).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een goed gangbaar protocol voor de fabricage van decellularized ECM moet behouden de oorspronkelijke samenstelling van de ECM tijdens het verwijderen van cellulaire componenten in weefsels bijna volledig21. Ondanks momenteel gerapporteerde decellularization protocollen waarvoor perfusie door middel van de therapieën materialen te verwijderen cellulaire door convectie vervoer, mechanische agitatie goedgekeurd hier, bekend als een traditionele, eenvoudige en goedkope methode22</sup...

De tong heeft verschillende belangrijke functies, zoals deglutition, articulatie en proeverij. Dus, de verslechtering van de tong functie heeft grote impact op patiënten levenskwaliteit1. De meest voorkomende maligniteit in de mondholte is tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC), die meestal voorkomt bij mensen die drinken van alcohol of roken van tabak2.
In de afgelopen jaren, is weinig vooruitgang geboekt in fundamenteel onderzoek op TSCC. Het gebrek aan efficiënte in vitro onderzoek modellen blijft als een van de grootste problemen. Dus, de extracellulaire matrix (ECM) blijkt te zijn van een mogelijke oplossing. Aangezien ECM een complex netwerk frame samengesteld uit onderdelen van de hoogst georganiseerde matrix is, zou Steiger materiaal met een ECM-achtige structuur en samenstelling bevoegd voor kankeronderzoek zijn. Decellularized ECM kan perfect de niche bieden voor de cellen van dezelfde oorsprong in vitro, die blijkt te zijn van het belangrijkste voordeel van ECM.
ECM kan worden bewaard met cellulaire componenten wordt verwijderd uit de weefsels door middel van de decellularization met behulp van detergentia en enzymen. Verschillende ECM componenten, met inbegrip van collageen, fibronectine en laminin in de decellularized matrix bieden een native-weefsel-achtige communicatie voor gekweekte cellen, bevordering van de overleving, proliferatie en differentiatie van de cellen3. Bovendien kan de immunogeniciteit voor transplantatie worden gereduceerd tot een minimaal niveau aan de afwezigheid van cellulaire componenten in ECM.
Tot nu toe hebben fabricage methoden voor decellularized ECM geprobeerd in verschillende weefsels en organen, zoals hart4,5,6,7, lever8,9,10 ,11, Long12,13,14,15,16,17, en nier18,19 , 20. echter geen relevant onderzoek is te vinden op soortgelijke werkzaamheden in de tong om het beste van onze kennis.
In deze studie werd decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) zowel efficiënt en goedkoop vervaardigd door een reeks van fysieke, chemische en enzymatische behandeling. Vervolgens werd de TEM gebruikt om te recapituleren TSCC in vitro, tonen een passende simulatie voor TSCC gedrag en ontwikkeling. TEM heeft goede biocompatibiliteit, evenals de mogelijkheid om te begeleiden van de cellen naar de weefsel-specifieke niche, waarmee wordt aangegeven dat de TEM groot potentieel in TSCC onderzoek3 wellicht. Het hier getoonde protocol biedt u de keuze voor onderzoekers bestuderen op pathogenese of klinische therapieën voor TSCC.

<table><tbody><tr><td>C57-BL/6J muizen</td><td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisch natriumfosfaat</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisch kaliumfosfaat&nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL EP buis</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-lage temperatuur vriezer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 cm celkweekschaal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 cm celkweekschaal</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische hechtdraad</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL fles met brede hals</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische roerder</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuit</td><td>Hunan Pingan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifugeerbuis</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27 cel</td><td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Tongue plaveiselcelcarcinoom cel lijn</td></tr><tr><td>U2OS cel</td><td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Menselijke osteosarcoomcel lijn</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes vrije zuur</td><td>BBI</td><td>A600264</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C koelkast</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterreiniger</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage van tong extracellulaire matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom in vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

De methoden zijn om te bouwen van een model voor effectieve en realistische voor tong squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, gemaakt naar producten decellularized tong extracellulaire matrix (TEM) waarmee functionele steigers voor TSCC bouw. TEM voorziet een niche in vitro celgroei, differentiatie en cel migratie. De microstructuren inheemse extracellulaire matrix (ECM) en biochemische composities bewaard in de decellularized matrix wordt voorzien dat weefsel-specifieke niches verankering van cellen. De fabricage van TEM kan worden gerealiseerd door deoxyribonuclease (DNase) spijsvertering gepaard met een ernstige van organische of anorganische voorbehandeling. Dit protocol is eenvoudig te bedienen en zorgt voor een hoog rendement voor de decellularization. De TEM toonde gunstige cytocompatibility voor TSCC cellen onder statische of stirred kweekomstandigheden, waardoor de bouw van de TSCC model. Een zelf-gemaakte bioreactor werd ook gebruikt voor de aanhoudende stirred voorwaarde voor celkweek. Gereconstrueerde TSCC met behulp van TEM toonde de kenmerken en eigenschappen die lijken op klinisch TSCC Histopathologie, het potentieel in TSCC onderzoek suggereert.

Dit protocol voor de bereiding van TEM ontpopt zich tot efficiënte en geschikte. De TEM toonde perfecte decellularization vergeleken met de moedertaal weefsels. De werkzaamheid van decellularization werd bevestigd door de Haematoxyline-eosine (HE) kleuring (Figuur 1A-B). De HE kleuring resultaten bleek volledige verdwijning van nucleaire kleuring in TEM (Figuur 1B). DNA inhoud kwantificering van ...

Een methode is hier weergegeven voor de voorbereiding van de tong extracellulaire matrix (TEM) met efficiënte decellularization. De TEM kan worden gebruikt als functionele steigers voor de wederopbouw van een tong plaveiselcelcarcinoom (TSCC) model onder statische of stirred cultuuromstandigheden.

Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oraal kankeronderzoek, zoals hoe een geschikt T-assist model in-vitro kan worden opgebouwd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat gereconstrueerde TSCC tumorkarakteristieken vertonen die een sterke gelijkenis vertonen met de klinische TSCC histopathologie. Toen we voor het eerst het idee hadden voor deze methode, realiseerden we ons dat 2-D gekweekte TSCC-cellen het native fenotype van TSCC niet goed vertoonden.Bovendien realiseerden we ons de belangrijkheid van de extracellulaire matrix voor het overleven van kanker en differentiatie. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de bereiding van de extracellulaire matrix van de tong en 3-D-kweek met behulp van een mini-bioreactor moeilijk te leren is via woorden alleen, en het beste wordt gezien voor verduidelijking. Na het isoleren van de tongen van geëuthaniseerde muizen volgens het tekstprotocol, dompelt u het weefsel gedurende drie minuten in 75% ethanol.Breng vervolgens elke tong over in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter, met één milliliter 10 milliMolair steriele PBS. Om cellyse uit te voeren, bevriest u

fabrication-tongue-extracellular-matrix-reconstitution-tongue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

In this video, we describe the isolation of epithelial cells from a murine tongue. These cells can be further cultured to give rise to cell colonies.

Isolation and Culture of Murine Tongue Epithelial Cells: A Procedure to Isolate and Culture Tongue Epithelial Cells from Mouse Model

This video demonstrates the preparation of the murine tongue extracellular matrix by using the decellularization method, which involves exposing the harvested tongue to a series of physical, chemical, and enzymatic treatments. The resulting TEM scaffold retains its native extracellular matrix composition, removing the cellular components.

Fabrication of Extracellular Matrix from Mouse Model: An Effective Procedure to Prepare Decellularized Tongue Extracellular Matrix from Murine Tongue

Weefselbewerkt-fibroblast afgeleid inheemse matrix is ​​een opkomende hulpmiddel om een ​​stromale substraat dat epitheelcelproliferatie en differentiatie ondersteunt genereren. Hier een protocol deze methode toegepast op de impact van verschillende stromale celtypen op tumorcel biologie beoordelen wordt gepresenteerd.

Tissue Engineering van Tumor Stromal Microenvironment met Toepassing op Cancer Cell Invasion

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

We hebben een gegeneraliseerd protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid hoogwaardige enkelvoudige cellen te scheiden van het epitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale en volwassen muistongs.

Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen

Het protocol presenteert een methode voor het kweken en verwerken van linguale organoïden afgeleid van smaakstamcellen geïsoleerd uit de achterste smaakpapillen van volwassen muizen.

Generatie en cultuur van linguale organoïden afgeleid van volwassen muizensmaak stamcellen

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.

Modellering van oraal-oesofageaal plaveiselcelcarcinoom in 3D-organoïden

Een unieke methode om chirurgisch orale plaveiselceltumoren die in de mondholte zijn gevestigd, te verwijderen, wordt hier getoond.

Translationeel relevant tumorresectiemodel voor muispreklinische modellen van orale plaveiselcelcarcinoom

Leer hoe je tong-extracellulaire matrix bereidt via decellularisatie voor 3D-cultuur van tongplaveiselcelcarcinoom. Deze methode biedt een realistisch in-vitro model dat klinische tumorhistopathologie nabootst.

Fabricage van tong extracellulaire Matrix en reconstructie van tong plaveiselcelcarcinoom In Vitro

Meer video's verkennen