High-throughput identificatie van synergetische Drug combinaties door de overlapping² methode

Het algemene doel van deze methodologie is om synergistische moleculen te identificeren, die elkaars activiteit versterken wanneer ze worden gecombineerd door middel van high-throughput screening. Synergistische geneesmiddelparen zijn een veelbelovende strategie voor het bestrijden van geneesmiddelresistente infecties, maar ze zijn moeilijk te identificeren. Deze methode kan moleculen identificeren die interageren met bestaande antimicrobiële geneesmiddelen die worden gebruikt om infectieziekten te behandelen.

Op de lange termijn kunnen deze combinaties de preklinische beoordeling ingaan en uiteindelijk de patiëntenzorg verbeteren. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast op elk organisme van belang en met elke bibliotheek van kleine moleculen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van meerdere infectieziekten, omdat het met elk organisme van belang werkt.

Gebruik een standaard spreadsheet om het gemiddelde groeicijfer en de standaarddeviatie te berekenen voor alle mutanten, in aanwezigheid van een bepaalde concentratie van de toegevoegde kleine molecuul. Bereken vervolgens de Z-scores voor elke concentratie van het kleine molecuul. Markeer vervolgens de genmutanten met significante Z-scores.

Kweek eerst een E.coli-cultuur in M9 minimaal medium, gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. Los vervolgens de kleine moleculen op in dimethylsulfoxide bij een hoge concentratie boven de 10 milligram per milliliter. Voeg vervolgens 100 microliter M9-medium toe aan elke put in een 96-wellsplaat.

Pipetteer een extra 100 microliter M9-medium in kolom één zodat het volume in die kolom 200 microliter is. Voeg vervolgens ongeveer 10 microliter van de geconcentreerde oplossing van het kleine molecuul toe in kolom één. Nadat de kleine moleculen zijn toegevoegd, begint u met het verdunnen over de X-as van de plaat.

Ga door met verdunnen tot er 100 microliter in kolom 11 is. Na het mengen van kolom 11, gooit u 100 microliter van die kolom weg. Laat er alleen medium in kolom 12 zijn om de gegevens te normaliseren.

Noteer vervolgens de optische dichtheidswaarde op 600 nanometer van de nachtcultuur die in M9 minimaal medium is gekweekt. Voeg vervolgens twee microliter van de cultuur toe aan elke put. Zodat er 1000 cellen per put zijn.

Schud de plaat voorzichtig en noteer de optische dichtheidswaarde op 600 nanometer voor nul uur tijdstip. Zodra de waarde is vastgelegd, incubeer de plaat gedurende een dag bij 37 graden Celsius.

Meet opnieuw de optische dichtheidswaarde op 600 nanometer voor 24 uur tijdstip. Om de checkerboard-test uit te voeren, kweekt u een E.coli-cultuur in M9 minimaal medium gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 100 microliter M9-medium toe aan elke put en voeg een extra 100 microliter van hetzelfde medium toe in kolom één van een 96-wellsplaat.

Voeg vervolgens de test kleine moleculen toe in elke put in kolom één. En voeg dubbele concentratie toe in put A1. Maak vervolgens een verdunningsgradiënt langs de X-as door 100 microliter over te brengen van kolom één naar kolom twee. Ga door met het verdunningsproces tot er 100 microliter is toegevoegd in kolom 11.

Na het mengen van kolom 11, gooit u 100 microliter van die kolom weg en laat u kolom 12 alleen met medium zonder enige medicijnen. Maak een andere gradiënt voor de tweede geneesmiddelverdunning. Om dit te doen, voegt u 100 microliter van het medium met twee X, minimale remmende concentratie van de inputmolecuul toe in rij A. Draag vervolgens 100 microliter over van rij A naar B. Ga door met het verdunningsproces tot er 100 microliter is toegevoegd in rij G. Na het mengen van rij G, gooit u 100 microliter uit de put weg.

Vervolgens inoculeert u de plaat met twee microliter van de cultuur in elke put. Zodat er 1000 cellen per put zijn. Meet vervolgens de optische dichtheidswaarde op 600 nanometer voor nul uur tijdstip.

Zodra de waarde is vastgelegd, incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. En meet vervolgens de optische dichtheidswaarde op 600 nanometer voor 24 uur tijdstip. Om high-throughput screening uit te voeren voor synergistische geneesmiddelen, kweekt u zowel wildtype als synergievoorspelling mutant cellen in M9 minimaal medium.

Voeg vervolgens de geneesmiddelen uit de bibliotheek toe aan het medium. Inoculeer vervolgens een plaat van bibliotheek geneesmiddelen met het wildtype en een andere plaat met synergievoorspelling mutant bacteriën. Deze plaat vertegenwoordigt de checkerboard-test die wordt gebruikt om synergistische geneesmiddelcombinaties te onderzoeken.

In deze plaat geeft put F9 met de laagste FICI-score van 0,07 aan dat het kleine molecuulpaar synergistisch is. Deze plaat vertegenwoordigt de checkerboard-test om niet-interagerende geneesmiddelcombinaties te onderzoeken. In deze plaat geeft put C3 met de laagste FICI-score van 1,0 aan dat het kleine molecuulpaar niet met elkaar interageert.

Deze plaat vertegenwoordigt de checkerboard-test die wordt gebruikt om antagonistische geneesmiddelcombinaties te onderzoeken. In deze plaat geeft put A1 met de laagste FICI-score van 8,0 aan dat de interactie tussen de geneesmiddelmoleculen antagonistisch is. Vervolgens wordt Befeldin A, een klein molecuul geneesmiddel in Fluconazol, gebruikt om de groei van C en U Formins te bestuderen.

De grafiek toont aan dat de groei van zowel het wildtype als de synergievoorspelling mutant licht wordt geïnhibeerd en in dezelfde mate. Dit geeft aan dat Befeldin A en Fluconazol niet-synergistische geneesmiddelpartners zijn. Daarentegen wordt de groei van de synergievoorspelling mutant van C en U Formins significant geïnhibeerd in aanwezigheid van Refromisyn en Fluconazol.

Wat aangeeft dat de geneesmiddelen synergistische partners zijn. Interessant is dat de wildtype groei helemaal niet wordt geïnhibeerd. Hier wordt het grootste groteverschil waargenomen tussen 32 en 49 uur na inoculatie.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek de tijd verkort