Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Het algemene doel van deze procedure is om een microfluïdische platform te gebruiken om een doorlaatbaar vasculair netwerk te construeren in een multicellulair aggregaat, of sferoïd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in alternatieve vormen van regeneratieve geneeskunde, zoals hoe een vasculair netwerk belangrijk is in vivo en in vitro weefselmodellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de route van medicijn- en supplementtoediening kan worden gesimuleerd in vitro via de levering van regio's van belang rechtstreeks in de sferoïden.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de moeilijkheid om de cellen in het doelgebied in het microfluïdische apparaat te introduceren. Na het gieten van het PDMS-prepolymer, moet het materiaal twee uur lang worden ontgast in een vacuümkamer, gevolgd door overnacht uitsharden bij 80 graden Celsius in een oven met luchtventilatie. De volgende ochtend moet het PDMS van de siliciumwafer worden gepeld, en een twee-millimeter-diameter gatpons gebruikt worden om gaten in het materiaal op de aangegeven posities te maken.

Gebruik een een-millimeter-diameter pons om de sferoïd-put te maken, en gebruik plakband om de PDMS-plaat en een 24-bij-24 millimeter glazen deksel te reinigen. Behandel de schone plaat gedurende 40 seconden met luchtplasma, en plak de PDMS-plaat op het deksel. Cure vervolgens de PDMS gedurende ten minste 12 uur bij 80 graden Celsius.

Twee tot drie dagen voor het zaaien van het microfluïdische apparaat, voegt u drie keer 10 tot de vijfde vers bevroren hLF, RFP-HUVECs en GFP-HUVECs toe aan 10 milliliter vers endotheelmedium in een 10-millimeter schaal. Wanneer de hLFs en RFP-HUVECs subconfluency bereiken, suspendeert u de hLFs en RFP-HUVECs in het endotheelmedium tot uiteindelijke concentraties van 1,0 keer 10 tot de vijfde en 2,5 keer 10 tot de vierde cellen per millimeter, respectievelijk. Na twee dagen in suspensiecultuur, voegt u in een bioveiligheidskast een 99-microliter druppel vers bereide mastermix-oplossing toe aan het midden van een 35-millimeter petrischaal op ijs.

Om het microfluïdische apparaat te laden, gebruikt u een aangepaste 100-microliter micropipettip om een sferoïd en 100 microliter medium over te brengen naar een tweede, kamertemperatuur petrischaal. Aspirateer vervolgens de sferoïd in een minimale hoeveelheid medium, en draai de pipet rechtop zodat de sferoïd door zwaartekracht naar de bodem van de pipettip beweegt. Raak de pipettip aan het meniscus van de mastermix-druppel om de sferoïd in de oplossing te spuiten zonder de pipetplunger in te drukken.

Voeg vervolgens snel een microliter vers bereide trombine toe aan de druppel, en meng de trombine voorzichtig in de oplossing. Zet de pipet in op zeven microliter, en breng de sferoïd langzaam over naar de sferoïd-put van de PDMS-plaat. De meest cruciale stap van de procedure is het injecteren van de sferoïd met voldoende gel om de sferoïd op de bodem van het apparaat te laten bezinken.

Na het laden, verwijdert u de pipettip voorzichtig om lekkage tussen de microposts te voorkomen. Incubeer de sferoïd gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Wanneer het fibrine is gestold, injecteert u langzaam 20 tot 30 microliter endotheelmedium in gaten een A en drie A om kanalen een en drie te laden, respectievelijk.

Breng vervolgens het apparaat over naar een natte laboratoriumdoek in een 100-millimeter schaal, en incubeer het apparaat bij 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende 24 uur om het verwijderen van eventuele luchtbellen op het grensvlak tussen het medium en het fibrine te vergemakkelijken. De volgende dag voegt u twee milliliter 0,05% trypsine-EDTA toe aan de subconfluente GFP-HUVECs, en stopt u de trypsine-reactie met vier milliliter compleet medium wanneer de cellen volledig zijn losgekomen. Verzamel de endotheelcellen door centrifugatie en suspendeer het pellet opnieuw in vers endotheelmedium met een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Injecteer vervolgens 20 microliter HUVECs in gat een B om kanaal een te laden, en plaats het apparaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, gekanteld in een hoek van 90 graden om ervoor te zorgen dat de HUVECs zich aan het fibrine in kanaal twee hechten. Na kanaal drie op dezelfde manier te hebben geladen, plaatst u het apparaat in een nieuwe 100-millimeter schaal met een vochtige laboratoriumdoek in de celcultuurincubator gedurende zeven tot veertien dagen, waarbij dagelijks de helft van het medium in kanalen een en drie wordt vervangen. Deze representatieve beelden, genomen op dag nul van HUVEC-lading, tonen fibrine-gel geladen in kanaal twee alleen, zonder enige lekkage in kanalen een of drie en met de HUVECs succesvol gehecht aan de zijwand van het fibrinegel.

De sferoïd kan ook worden waargenomen om goed te zijn bezonken op de bodem van het apparaat. Angiogene spruiten worden waargenomen beginnend op dag één, met de langste spruit die de sferoïd bereikt op dag drie in dit experiment, en met de meeste angiogene spruiten die de sferoïd bereiken tegen dag zeven. Optimaal, na vier dagen in het apparaat, kan stroming worden waargenomen door de vasculaire lumina met de vasculaire hoek gedefinieerd als de richting van de vasculaire tip en het centrum van de sferoïd vanaf de vasculaire wortel.

De vasculaire hoeken nemen af op een tijdsafhankelijke manier, wat duidt op migratie van de angiogene spruiten naar de sferoïd. RFP en GFP-HUVECs kunnen coördinatief een enkel vasculair lumen vormen, wat duidelijk aangeeft hoe angiogene spruiten vanuit kanalen een en drie anastomoseren naar RFP-HUVECs in de sferoïd om een continu vasculair netwerk te vormen. Verder stroomt FITC-dextran geïnjecteerd in kanaal een in het geconstrueerde vasculaire netwerk en de binnenkant van de sferoïd, en bereikt uiteindelijk kanaal drie