Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses
25 januari 2018
We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.
Het algemene doel van deze methode is om hoogwaardige protoplastcellen uit sojabonen te verkrijgen om regulerende en signaleringsmechanismen in levende sojacellen te onderzoeken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in regulatoire netwerken te beantwoorden, zoals wat hun directe doelgen is, de transfusiefactor openen en wat hun interacterende partner is, een eiwit openen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is kunst.
Het produceert grote hoeveelheden uniforme sojaprotoplastcellen, en het is eenvoudig en gemakkelijk. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het erg moeilijk is om mooie protoplasten uit sojabladeren te verkrijgen, tenzij je unifoliaat in een specifiek stadium. De selectie van bladeren in een geschikt ontwikkelingsstadium is de sleutel tot een succesvolle sojaprotoplastvoorbereiding.
Snijd nieuw uitgebreide unifoliate bladeren van 10 dagen oude sojaplantjes af. Om ervoor te zorgen dat wanneer een monster een hoog protoplastopbrengst geeft, verzamel ten minste drie monsters van unifoliate bladeren in licht verschillende ontwikkelingsstadia. Verwijder met een nieuw scheermesje de middennerf van elk unifoliaat blad en snijd de restanten vervolgens in stroken van 0,5 tot één millimeter.
Gebruik een tang om de bladstroken onmiddellijk voorzichtig over te brengen in 10 milliliter vers bereide enzymoplossing in een buisje van 15 milliliter. Vacuüm infiltreer de bladstroken gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de bladstroken in de enzymoplossing met zachte roering onder zwakke verlichting gedurende vier tot zes uur bij kamertemperatuur.
Terwijl protoplasten vrijkomen, zal de enzymoplossing geelgroen van kleur worden. Controleer de enzymprotoplastoplossing onder de microscoop bij 10x vergroting om het monster met de beste protoplastvertering te selecteren. De vrijgekomen protoplasten zijn bolvormig, terwijl de onverterde cellen onregelmatige of ovale vormen hebben.
Om de vertering te stoppen, giet de 10 milliliter enzymprotoplastoplossing met de beste protoplastvertering voorzichtig in een buisje van 50 milliliter en voeg 10 milliliter W5-oplossing bij kamertemperatuur toe. Draai het buisje een paar keer voorzichtig om. Giet vervolgens de enzymprotoplastoplossing voorzichtig in een schone nylon gaas met een maaswijdte van 75 micron die op een buisje van 50 milliliter is geplaatst om de onverterde bladweefsels te verwijderen.
Centrifugeer vervolgens de doorstromende enzymprotoplastoplossing gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G. Gebruik vervolgens een serologische pipet van 10 milliliter om voorzichtig het supernatant te verwijderen zonder de protoplast-pellet te verstoren. Breng de protoplast weer op schok in gekoelde W5-oplossing en bewaar het buisje van 50 milliliter op ijs.
Na het tellen van het aantal protoplasten op een hemocytometer onder de microscoop, verdun tot een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde protoplasten per milliliter in gekoelde W5-oplossing. Bewaar de protoplast 30 minuten op ijs. Centrifugeer de suspensie gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G.
Gebruik vervolgens een pipet van één milliliter om voorzichtig de W5-oplossing te verwijderen zonder de protoplast-pellet te verstoren. Breng de protoplast weer op schok in MMG-oplossing bij kamertemperatuur bij een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde protoplasten per milliliter. Gebruik om de protoplast voor transformatie voor te bereiden, ongesneden 200 microliter pipettentips om 100 microliter aliquoten van protoplasten in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met lage hechting te maken.
Leg een aliquot opzij om als negatieve controle te dienen. Voeg aan het resterende aliquot van protoplasten 10 microliter plasmide-DNA toe. Voeg langzaam 110 microliter vers bereide peg-oplossing toe aan de binnenwand van het microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.
Draai vervolgens voorzichtig om en draai het buisje tot de oplossing homogeen wordt. Incubeer de transformatiemixtures gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Om de transformatie te stoppen, voeg langzaam 400 microliter W5-oplossing toe aan elk buisje van 1,5 milliliter bij kamertemperatuur en draai voorzichtig om tot de oplossing homogeen wordt.
Centrifugeer de buisjes gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G. Gooi het supernatant weg. Voeg een milliliter WI-oplossing toe aan elk buisje.
Bedek het welboppervlak van een zes-wels weefselkweekplaat om te voorkomen dat de protoplasten aan de plaat blijven kleven. Voeg een milliliter vijf procent steriel runder serum toe aan elke wel en verwijder na een paar seconden het runder serum met een pipet. Breng de opgeschokte protoplasten over in de wels van de kweekplaat en dek de plaat af met een deksel.
Incubeer de protoplasten voor het oogsten gedurende twee dagen bij kamertemperatuur in het donker. Breng na twee dagen de protoplastsuspensie over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met lage hechting. Centrifugeer de buisjes gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G.
Verwijder het supernatant met een pipet. Breng 10 microliter protoplast over op een glasplaatje. Observeer fluorescerende signalen onder fluorescentie- of confocale microscopie met niet-getransformeerde protoplasten als negatieve controle.
Protoplastcellen werden bereid uit verschillende organen van 10 dagen oude sojabonen en werden onder de microscoop waargenomen. Celwanden van hypocaudaal en epicaudaal werden nauwelijks verteerd. En sommige cellen bleven aan elkaar vastzitten.
In het caudale loden en wortel werden celwanden slechts in een klein deel van de cellen verwijderd. In tegenstelling daarmee werden een groot aantal protoplasten waargenomen wanneer unifoliaat werd gebruikt. De plantjes in deze foto van links naar rechts illustreren unifoliate bladeren die niet uitgebreid zijn, net uitgebreid of volledig uitgebreid zijn.
Terwijl zowel de niet-uitgeb
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudig en effectief protocol voor het bereiden van grote hoeveelheden sojaboon protoplasten. Deze protoplasten zijn essentieel voor het bestuderen van complexe regulatoire en signaleringsmechanismen in levende sojabooncellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiologie
- Celbiologie
- Regulatoire Mechanismen
Achtergrond
- Protoplasten zijn plantencellen waarvan de celwand is verwijderd.
- Ze worden gebruikt om cellulaire processen in een gecontroleerde omgeving te bestuderen.
- Het verkrijgen van hoogwaardige protoplasten kan een uitdaging zijn.
- Bladselectie in het juiste ontwikkelingsstadium is cruciaal voor succes.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de bereiding van protoplasten uit sojabonen.
- Om het onderzoek naar regulatoire netwerken in sojabooncellen te vergemakkelijken.
- Om interacties tussen eiwitten en doelgenen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Selectie van sojaboonbladeren in een specifiek ontwikkelingsstadium.
- Enzymatische vertering om protoplasten te isoleren.
- Optimalisatie van omstandigheden voor de levensvatbaarheid van protoplasten.
- Karakterisering van protoplasten voor experimenteel gebruik.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle bereiding van grote hoeveelheden uniforme sojaboon protoplasten.
- Protoplasten kunnen worden gebruikt om genregulatie en signaalroutes te bestuderen.
- De methode is eenvoudig en toegankelijk voor onderzoekers.
- Belangrijkste factoren die de kwaliteit van protoplasten beïnvloeden, zijn geïdentificeerd.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol verbetert de mogelijkheid om levende celprocessen in sojaboon te bestuderen.
- Het biedt een basis voor verder onderzoek naar regulatoire mechanismen in planten.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om complexe interacties in de plantenbiologie te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of soybean protoplasts enables rapid functional interrogation of gene regulatory and signaling mechanisms in a model legume system. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for trait discovery and crop biotechnology pipelines. High-yield, uniform protoplast preparations facilitate scalable, quantitative transient gene expression analyses relevant to translational plant R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of gene function and regulatory network hypotheses in live soybean cells.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying immediate gene targets and protein interactions.
- Facilitates rapid portfolio triage through functional validation of candidate genes.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-yield source of uniform protoplasts for reproducible transient expression assays.
- Enables quantitative measurement of gene expression outputs using fluorescence or confocal microscopy.
- Supports assay scalability and platform reuse for diverse gene constructs and regulatory elements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling live-cell analysis of regulatory pathways.
- Maintains continuity from gene discovery through preclinical trait validation in a model crop system.
- Reduces biological risk by providing predictive data on gene function prior to stable transformation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-validation continuum, bridging early gene function studies with downstream trait development and screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene regulatory and signaling mechanisms in a controlled cellular context.
- Screening: Delivers assay-ready protoplasts for reproducible, quantitative transient expression analysis.
- Analytics: Enables direct measurement of fluorescence or protein localization to compare experimental conditions.
- Translational Research: Provides a live-cell system for evaluating candidate biomarkers and regulatory elements relevant to crop improvement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics and trait validation across multiple gene targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and regulatory network mapping.
- Operational Value: Standardizes protoplast preparation for reproducible, high-throughput analyses.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for gene targets, improving R&D capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant cell isolation and transient gene expression techniques.
- Needs access to fluorescence or confocal microscopy for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of leaf selection and transformation parameters.
- May require adaptation for different soybean varieties or related legume species.
- Empirical optimization of digestion and transformation conditions is essential for reproducibility.
