Name: Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer een eenvoudige methode voor het isoleren van soja-protoplasten om regulerende en signaalmechanismen in levende plantencellen te bestuderen. Dit protocol produceert grote hoeveelheden uniforme cellen voor genexpressie-analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Plant Genome Research Program van de National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. de groei van de planten
<ol><li>Zaaien 5-10 sojabonen (Williams 82) in een 13 cm pot in de serre omstandigheden lange-dag (16 h licht aan 1.500 µmol m-2 s-1) bij 25 ° C op de bodem van de aangepaste mix voor sojabonen (het 1:1:1 verhouding bodem, perliet en torpedo zand).</li>
</ol>2. voorbereiding van de plasmide DNA
<ol><li>Met behulp van een steriele Pipetteer tip of een tandenstoker, kies een één kolonie of bevroren glycerol voorraad van E. coli die de plasmide met het gen van belang en het in 20 mL Luria Bertani (LB) vloeistof met passende antibiotica in een maatkolf van 50 mL beënten.</li>
	<li>Incubeer de kolf bij 37 ° C's nachts op een shaker. Het verzamelen van de bacteriën door centrifugeren van de opschorting bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en het supernatant te verwijderen. Extraheren en te zuiveren van de plasmide die volgens de procedure van de fabrikant van een plasmide prep kit.</li>
</ol>3. isolatie van de protoplast
<ol><li>Gesneden onlangs uitgebreide unifoliate bladeren van 10 - dagen oude soja zaailingen (Figuur 1). Opmerking: Selectie van bladeren in een passend stadium van ontwikkeling is de sleutel tot het succes voor soja protoplast voorbereiding. Gebruik alleen net uitgebreid bladeren op vroege ontwikkelingsstadia. Laat volwassen, celwanden worden moeilijker te verteren.</li>
	<li>Met een verse scheermesje, de hoofdnerf uit de unifoliate blad en dan knippen de resten in 0,5-1 mm strips te verwijderen. Opmerking: Twee unifoliate bladeren verteerd in 10 mL enzym oplossing krijgt voldoende protoplasten voor meer dan 10 transformaties.</li>
	<li>Met behulp van een paar pincet, overdracht stroken het blad onmiddellijk en zachtjes in 10 mL vers bereide enzym in een tube van 15 mL oplossing (tabel 1). Vacuüm infiltreren het blad strips voor 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer de blad-strips in de enzym-oplossing met zachte agitatie (40 rpm) onder lage licht voor 4-6 uur op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het enzym omslaat naar geel-groen zoals protoplasten zijn vrijgegeven. Controleer de enzym/protoplasten oplossing onder de Microscoop (X10). Opmerking: De vrijgegeven protoplasten zijn bolvormige vorm, terwijl de onverteerd cellen onregelmatige of ovale vorm hebben.</li>
	<li>Breng de 10 mL van enzym/protoplast oplossing in een tube van 50 mL door zachtjes gieten en voeg 10 mL W5 oplossing (tabel 1) bij kamertemperatuur om te stoppen met de spijsvertering. Voorzichtig omkeren de buis een paar keer. Giet voorzichtig het enzym/protoplasten oplossing op een schone 75 µm nylon gaas geplaatst op de top van een tube van 50 mL te verwijderen van de weefsels onverteerd blad.</li>
	<li>Centrifugeer de doorstroming enzym/protoplasten oplossing bij 100 x g in de tube 50 mL voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Zachtjes Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van serologische Pipetteer 10 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet.</li>
	<li>Resuspendeer de protoplasten en Verdun tot een concentratie van 2 x 105 mL-1 in gekoeld W5 oplossing bij 4 ° C door het tellen van de protoplast nummer op een hemacytometer onder de Microscoop (x10). Houd de protoplasten op ijs gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer de schorsing bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de W5-oplossing met behulp van een pipet 1 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet. Resuspendeer de protoplasten in MMG oplossing (tabel 1) bij een concentratie van 2 x 105 mL-1 bij kamertemperatuur.</li>
</ol>4. protoplast transformatie
<ol><li>Breng 100 µL aliquots van protoplasten (2 x 104 protoplasten op 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL lage wrijvingscoëfficiënt microcentrifuge buizen met behulp van Onbesneden 200 µL Pipetteer tips. Één aliquot opzij zetten om te dienen als negatieve controle. Voeg 10 µL van plasmide (10-20 µg) in elk van de rest hoeveelheid protoplasten.</li>
	<li>Voeg langzaam 110 µL van vers bereide oplossing van de PEG (tabel 1) op de binnenwand van de 1,5 mL microcentrifuge buis, en vervolgens voorzichtig omkeren en draai de buis totdat de oplossing homogeen wordt.</li>
	<li>Incubeer de transformatie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>De transformatie stoppen, langzaam Voeg 400 µL van W5 oplossing aan de buis 1,5 mL bij kamertemperatuur en voorzichtig het omkeren van de buis totdat de oplossing homogeen wordt. Centrifugeer de buis bij 100 g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met behulp van een precisiepipet.</li>
	<li>Voeg 1 mL WI oplossing (tabel 1) aan de buis en resuspendeer door zachtjes pipetteren 1 - 2 keer. Voeg 1 mL 5% (vol/vol) steriele kalfsserum in elk putje van de plaat van een 6-well weefselkweek coat het oppervlak te voorkomen dat de protoplasten kleven aan de plaat.</li>
	<li>Na een paar seconden, gooi de met behulp van een precisiepipet kalfsserum. Breng de geresuspendeerde protoplasten in een putje van de plaat van de cultuur. De afdekplaat met een deksel.</li>
</ol>5. protoplast incubatie en oogsten
<ol><li>Incubeer de protoplasten bij kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen in het donker. Opmerking: We vonden dat twee dagen incubatie opbrengsten sterker fluorescerende eiwit signaal in het algemeen ten opzichte van eendaagse incubatie, en dat het signaal fluorescent proteïne kan duren voor maximaal 3-4 dagen.</li>
	<li>Breng de protoplast-oplossing tot een 1,5 mL koker voor de microcentrifuge van de lage wrijvingscoëfficiënt. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur te oogsten protoplasten. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet en overdracht van 10 µL protoplasten op een glasplaatje.</li>
	<li>Observeren fluorescent signaal onder fluorescentie- of confocale microscopie. Gebruik niet-getransformeerd protoplasten als negatieve controle (geen signaal moet worden nageleefd).</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Koop, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li>
<li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003194220089679X">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li>
<li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li>
<li>Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
<li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v335/n6189/abs/335454a0.html">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li>
<li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li>
<li>Cocking, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v187/n4741/abs/187962a0.html">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
<li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00331634">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li>
<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
<li>Grun, P., Chu, L. -J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2442587">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).</li>
<li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+domestication%3A+the+origin%2C+genetic+architecture+and+molecular+bases%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li>
<li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li>
<li>Wu, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGROBEST%3A+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19(2014).</li>
<li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li>
<li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li>
<li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li>
<li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li>
<li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-repeat+MYB+transcription+factor%2C+GmMYB176%2C+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li>
<li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+domain-containing+protein%2C+GmNAC6%2C+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).</li>
<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol voor de isolatie van soja protoplasten en de toepassing op voorbijgaande expressie studies grondig is getest en werkt zeer goed in ons laboratorium. De procedures zijn eenvoudig en gemakkelijk en vereisen gewone apparatuur en minimale kosten. Ons protocol levert grote hoeveelheden van uniforme, hoge kwaliteit protoplasten in vergelijking met de eerder gemelde methoden34,35,,36,,37<...

Protoplasten zijn plantaardige cellen waarin celwanden verwijderd. Als ze beweert dat de meeste functies en activiteiten van plantencellen, protoplasten zijn een goed modelsysteem te observeren en evalueren van de verschillende cellulaire gebeurtenissen, en waardevolle hulpmiddelen te bestuderen van somatische hybridisatie1 en regeneratie2plant. Protoplasten hebben ook op grote schaal gebruikt voor plant transformatie3,4,5, aangezien celwanden zou anders het blokkeren van de passage van DNA in de cel. Protoplasten bezitten sommige van de fysiologische reacties en cellulaire processen van intact planten, vandaar het aanbieden van fundamentele waarde bij het basisonderzoek aan studie eiwit subcellular localisatie6,7,8, eiwit-eiwit interacties9,10, en promotor activiteit11,12,13 in levende cellen.
Het isolement van de plant protoplasten werd voor het eerst gemeld in 196014 en de protocollen voor zowel de isolatie en de transformatie van protoplasten zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd. Een standaardprocedure voor isolatie van de protoplast impliceert het uitsnijden van bladeren en enzymatische vertering van celwanden, gevolgd door een scheiding van vrijgegeven protoplasten van niet-verteerde weefsels puin. Transformatie strategieën bevat electroporation15,16, microinjection17,18, en op basis van polyethyleenglycol (PEG)4,5,19 methoden. Een breed scala van soorten hebben gemeld succes voor isolatie van de protoplast, met inbegrip van Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 en andere sierplanten gezinnen23,24. Terwijl verschillende weefseltypes (HLA) worden gebruikt in verschillende soorten, is een stelsel van meningsuiting van de voorbijgaande in Arabidopsis mesophyl protoplast (TEAMP) van de bladeren van de plant model Arabidopsis thaliana geïsoleerd goed ingeburgerd25 en algemeen aangenomen voor uiteenlopende toepassingen.
Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een van de belangrijkste eiwit en olie gewassen26. In tegenstelling tot Arabidopsis en rijst, is verkrijgen van transgene soja planten bekend nogal moeilijk en lage efficiëntie. Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde infiltratie is volksmond gebruikt voor tijdelijke gen expressie studies in de epidermale cellen in tabak27 en zaailingen in Arabidopsis28,29, overwegende dat Agrobacterium rhizogenes is gebruikt voor transformatie van harige wortels in soja30. Virus-geïnduceerde gene silencing benaderingen hebben gebruikt voor Downregulatie van doel genen31,32 en voorbijgaande expressie33 met systemische. Protoplasten vormen een waardevolle en veelzijdig alternatief voor deze benaderingen. Protoplasten kunnen worden verkregen uit sojabonen van bovengrondse materialen en laat snel en gesynchroniseerde transgenic expressie. Echter sinds de eerste succesvolle isolatie van soja protoplasten in de 198334, zijn er beperkt verslagen over de toepassing van protoplasten in soja35,36,,37,, 38, voornamelijk te wijten aan de relatief lage opbrengst voor sojabonen protoplasten.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor isolatie van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande gen expressie studies. Met behulp van jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen, konden we krijgen van grote hoeveelheden van vitale protoplasten binnen een paar uur. Daarnaast hebben we een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode die is eenvoudig en low-cost te leveren van DNA in soja protoplasten met hoog rendement geoptimaliseerd.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pectolyase Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELLULASE "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plates</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>hemacytometer</td><td>hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>EZNA plasmid miniprep kit</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>eppendorf</td><td>5811000827</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Jencons Powerpette Plus Pipet Controller</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 710 Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge Tubes</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Ingram's Nursery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perlite</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Torpedo Sand</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox (Powder)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie analyses

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een belangrijk gewas soorten en geworden een peulvrucht model voor de studies van genetische en biochemische trajecten. Daarom is het belangrijk om een efficiënte voorbijgaande gen expressie systeem in soja. Wij rapporteren hier een eenvoudig protocol voor de bereiding van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande functionele analyses. We vonden dat de jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen in grote hoeveelheden hoogwaardige protoplasten resulteerde. We bereikt door het optimaliseren van een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode, hoge transformatie efficiëntie met behulp van soja unifoliate protoplasten. Dit systeem biedt een efficiënte en veelzijdige model voor onderzoek van complexe regelgeving en signalering mechanismen in levende soja cellen en kan helpen om beter begrijpen divers cellulaire-, ontwikkelings- en fysiologische processen van peulvruchten.

Verschillende organen van het 10 - dagen oude sojabonen werden getest voor protoplast voorbereiding (Figuur 1) en de opbrengsten werden waargenomen onder de Microscoop (Figuur 2). Celwanden van hypocotyl en epicotyl werden nauwelijks verteerd, en sommige cellen bleef vasthouden aan elkaar (figuur 2B, 2 C). In zaadlob (figuur 2D) en wortel (<strong class=...

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Het algemene doel van deze methode is om hoogwaardige protoplastcellen uit sojabonen te verkrijgen om regulerende en signaleringsmechanismen in levende sojacellen te onderzoeken. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in regulatoire netwerken te beantwoorden, zoals wat hun directe doelgen is, de transfusiefactor openen en wat hun interacterende partner is, een eiwit openen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is kunst.Het produceert grote hoeveelheden uniforme sojaprotoplastcellen, en het is eenvoudig en gemakkelijk. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het erg moeilijk is om mooie protoplasten uit sojabladeren te verkrijgen, tenzij je unifoliaat in een specifiek stadium. De selectie van bladeren in een geschikt ontwikkelingsstadium is de sleutel tot een succesvolle sojaprotoplastvoorbereiding.Snijd nieuw uitgebreide unifoliate bladeren van 10 dagen oude sojaplantjes af. Om ervoor te zorgen dat wanneer een monster een hoog protoplastopbrengst geeft, verzamel ten minste drie monsters van unifoliate bladeren in licht verschillende ontwikkelingsstadia. Verwijder met een nieuw scheermesje de middennerf van elk unifoliaat blad en snijd de restanten vervolgens in stroken van 0,5 tot één millimeter.Gebruik een tang om de bladstroken onmiddellijk voorzichtig over te brengen in 10 milliliter vers bereide enzymoplossing in een buisje van 15 milliliter. Vacuüm infiltreer de bladstroken gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de bladstroken in de enzymoplossing met zachte roering onder zwakke verlichting gedurende vier tot zes uur bij kamertemperatuur.Terwijl protoplasten vrijkomen, zal de enzymoplossing geelgroen van kleur worden. Controleer de enzymprotoplastoplossing onder de microscoop bij 10x vergroting om het monster met de beste protoplastvertering te selecteren. De vrijgekomen protoplasten zijn bolvormig, terwijl de onverterde cellen onregelmatige of ovale vormen hebben.Om de vertering te stoppen, giet de 10 milliliter enzymprotoplastoplossing met de beste protoplastvertering voorzichtig in een buisje van 50 milliliter en voeg 10 milliliter W5-oplossing bij kamertemperatuur toe. Draai het buisje een paar keer voorzichtig om. Giet vervolgens de enzymprotoplastoplossing voorzichtig in een schone nylon gaas met een maaswijdte van 75 micron die op een buisje van 50 milliliter is geplaatst om de onverterde bladweefsels te verwijderen.Centrifugeer vervolgens de doorstromende enzymprotoplastoplossing gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G. Gebruik vervolgens een serologische pipet van 10 milliliter om voorzichtig het supernatant te verwijderen zonder de protoplast-pellet te verstoren. Breng de protoplast weer op schok in gekoelde W5-oplossing en bewaar het buisje van 50 milliliter op ijs.Na het tellen van het aantal protoplasten op een hemocytometer onder de microscoop, verdun tot een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde protoplasten per milliliter in gekoelde W5-oplossing. Bewaar de protoplast 30 minuten op ijs. Centrifugeer de suspensie gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G.Gebruik vervolgens een pipet van één milliliter om voorzichtig de W5-oplossing te verwijderen zonder de protoplast-pellet te verstoren. Breng de protoplast weer op schok in MMG-oplossing bij kamertemperatuur bij een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde protoplasten per milliliter. Gebruik om de protoplast voor transformatie voor te bereiden, ongesneden 200 microliter pipettentips om 100 microliter aliquoten van protoplasten in 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes met lage hechting te maken.Leg een aliquot opzij om als negatieve controle te dienen. Voeg aan het resterende aliquot van protoplasten 10 microliter plasmide-DNA toe. Voeg langzaam 110 microliter vers bereide peg-oplossing toe aan de binnenwand van het microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter.Draai vervolgens voorzichtig om en draai het buisje tot de oplossing homogeen wordt. Incubeer de transformatiemixtures gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Om de transformatie te stoppen, voeg langzaam 400 microliter W5-oplossing toe aan elk buisje van 1,5 milliliter bij kamertemperatuur en draai voorzichtig om tot de oplossing homogeen wordt.Centrifugeer de buisjes gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G. Gooi het supernatant weg. Voeg een milliliter WI-oplossing toe aan elk buisje.Bedek het welboppervlak van een zes-wels weefselkweekplaat om te voorkomen dat de protoplasten aan de plaat blijven kleven. Voeg een milliliter vijf procent steriel runder serum toe aan elke wel en verwijder na een paar seconden het runder serum met een pipet. Breng de opgeschokte protoplasten over in de wels van de kweekplaat en dek de plaat af met een deksel.Incubeer de protoplasten voor het oogsten gedurende twee dagen bij kamertemperatuur in het donker. Breng na twee dagen de protoplastsuspensie over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met lage hechting. Centrifugeer de buisjes gedurende één tot twee minuten bij kamertemperatuur bij 100 keer G.Verwijder het supernatant met een pipet. Breng 10 microliter protoplast over op een glasplaatje. Observeer fluorescerende signalen onder fluorescentie- of confocale microscopie met niet-getransformeerde protoplasten als negatieve controle.Protoplastcellen werden bereid uit verschillende organen van 10 dagen oude sojabonen en werden onder de microscoop waargenomen. Celwanden van hypocaudaal en epicaudaal werden nauwelijks verteerd. En sommige cellen bleven aan elkaar vastzitten.In het caudale loden en wortel werden celwanden slechts in een klein deel van de cellen verwijderd. In tegenstelling daarmee werden een groot aantal protoplasten waargenomen wanneer unifoliaat werd gebruikt. De plantjes in deze foto van links naar rechts illustreren unifoliate bladeren die niet uitgebreid zijn, net uitgebreid of volledig uitgebreid zijn.Terwijl zowel de niet-uitgeb

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont een procedure voor het isoleren van intacte protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis. Gezien het feit dat de geïsoleerde protoplasten intact blijven gedurende minstens 96 uur en worden geïsoleerd van zaailingen in plaats van een-maand-oude volwassen planten, deze procedure versnelt assays die intact protoplasten.

Isolatie van Protoplasten uit weefsels van 14-dagen-oude zaailingen van Arabidopsis thaliana</em

We brengen verslag uit een methode voor de introductie, tracking en kwantitatieve analyse van de GFP expressie in plantencellen. Deze methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen robotica systeem voor semi-continue foto collectie van grote aantallen monsters, in de tijd. We tonen ook aan het gebruik van ImageJ en ImageReady voor de analyse van foto-serie.

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Planten bieden een nieuw systeem voor de productie van farmaceutische eiwitten op commerciële schaal die is beter schaalbaar, kostenefficiënte en veilige dan de huidige expressie paradigma. In deze studie, rapporteren we een eenvoudig en handig, toch schaalbare aanpak van target-gen-bevattende...

Efficiënte Agroinfiltration van planten voor High-level Tijdelijke expressie van recombinante eiwitten

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

Bestaande methoden voor het modificeren van planten hebben een beperkte toepasbaarheid. De nieuwe peptide-afgeleide technologie die hier wordt voorgesteld, belooft zowel eenvoud als efficiëntie in de introductie van exogeen eiwit of genen in de gewenste intracellulaire compartimenten van intacte planten.

-Peptide afgeleide methode om genen en eiwitten Across Cellulaire en organellen Barriers in Planten Transport

Plant intercellulaire verbindingen, de plasmodesmata (Pd), spelen een centrale rol in plant fysiologie en plant-virus interacties. Kritische Pd vervoer zijn signalen dat rechtstreekse eiwitten aan Pd sorteren. Onze kennis over deze sequenties is echter nog in de kinderschoenen. Beschrijven we een strategie om te identificeren Pd lokalisatie signalen in Pd-gerichte eiwitten.

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Leer een eenvoudige methode voor het isoleren van soja-protoplasten om regulerende en signaalmechanismen in levende plantencellen te bestuderen. Dit protocol produceert grote hoeveelheden uniforme cellen voor genexpressie-analyses.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Meer video's verkennen