Name: Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Leer hoe je menselijke chondrocyten kweekt in 3D-peptidesteigers met RAD16-I voor weefselengineering. Deze methode bevordert differentiatie naar kraakbeenachtig weefsel en heeft toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het onderzoek uitgevoerd door de auteurs was gedeeltelijk gesteund door subsidies van de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder Grant overeenkomst nr. 229239, en van de AO Foundation, verkennend onderzoek Collaborative Research programma Acute Kraakbeen schade/letsel/Defect (CRP ACI) onder het project Bioactive en biomimetische steigers voor de regeneratie van de kraakbeen (BIOCART).

1. zelfassemblerende Peptide steiger (SAPS) voorbereiding
<ol><li>Bereid een 0,5%-oplossing van peptide RAD16-ik in sacharose bevat 20% (m/v), in een micro-centrifuge buis. Bewerk ultrasone trillingen ten de peptide oplossing gedurende 20 minuten in een ultrasoonbad bij het maximumvermogen en bij kamertemperatuur (RT) om een homogeen mengen. Opmerking: Het volume van de oplossing worden voorbereid zal afhangen van het aantal Encapsulaties gewenst. RAD16-ik peptiden afbraak onder deze omstandigheden ultrasoonapparaat niet de dupe worden.</li>
	<li>Verdun de peptide-oplossing bereid in stap 1.1 met het nodige volume van 10% (m/v) sacharose te verkrijgen van de gewenste eindconcentratie. Opmerking: Een belangrijke factor rekening te houden is de aanpassing van de initiële peptide concentratie omdat de stijfheid van de uiteindelijke matrix van deze parameter afhangen zal. De RAD16-ik peptide oplossing moet 2 x meer geconcentreerd dan de gewenste eindconcentratie van de 3D constructie. Normaal gesproken de laatste RAD16-ik gebruikte peptide concentraties zijn tussen 0,15 – 0,5% (w/v).</li>
	<li>Plaats de micro-centrifuge buis met de peptide-oplossing in het ultrasoonbad bij RT voor 20 min om homogeen mengen. Opmerking: De peptide oplossing, als niet onmiddellijk, gebruikt kan worden opgeslagen voor enkele maanden bij 4 ° C.</li>
</ol>2. cel schorsing voorbereiding
<ol><li>Centrifugeer de celsuspensie (verkregen na trypsine behandeling) bij 60 x g en RT gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een pipet van Pasteur aangesloten op een vacuüm lijn en Suspendeer de pellet cel in 3-5 mL 10% (m/v) sacharose met behulp van een micropipet. Ga naar cellen met behulp van een handmatige of automatische cel counter tellen. Opmerking: De sacharoseoplossing van 10% (m/v) is een isotone en niet-ionogene medium dat voorziet in de cel onderhoud en vermijdt peptide gelering tijdens het mengen.</li>
	<li>Centrifugeer de celsuspensie op 60 x g en RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en opschorten van de cel pellet opnieuw in het benodigde volume van 10% (m/v) sacharose te verkrijgen van dubbele de gewenste uiteindelijke cel concentratie (aan te bevelen ongeveer 4 x 106 cellen / mL).</li>
	<li>Plaats een gewenste aantal weefselkweek inzetstukken in elk putje van de plaat van een 6-well (één insert per inkapseling).</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de peptide oplossing bereid in stap 1 op maximumvermogen en RT gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Pipetteer en 40 µL van de celsuspensie (verkregen in punt 2.3) plaats voor elke gewenste plus ongeveer 10-15% extra volume in een standaard micro-centrifuge buis inkapseling.</li>
</ol>3. 3D cel inkapseling in sappen
<ol><li>Meng een gelijk deel van de RAD16-ik oplossing in 10% sucrose (g/v) (40 µL per inkapseling) met een gelijk volume van de celsuspensie (40 µL per inkapseling) bereid in stap 2 te verkrijgen van een suspensie van cellen in de gewenste peptide concentratie (in 10% sucrose). Meng door pipetteren langzaam op en neer ongeveer 10 keer. Vermijd zeepbel formatie tijdens het mengen. Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang en moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd omdat cellen vijandige omstandigheden als gevolg van de lage pH peptide (ongeveer 3.5-4.0 zijn).</li>
	<li>Met behulp van een micropipet, zorgvuldig laad 80 µL van de schorsing in elke toevoeging.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL voedingsbodems naar de bodem van de put te bevochtigen het invoegen membraan, waardoor media verspreiding te bevorderen van peptide zelf-assemblage en hydrogel vorming. Laat de gel gedurende ongeveer 20 minuten in het kabinet-stroom peptide. Opmerking: De manipulatie van de monsters tijdens het instellen van de tijd kon beëindigen in gel breken.</li>
	<li>Heel langzaam Voeg 40 µL van medium naar de invoegen en laat het glijden van de binnenwand aan de gel. Opmerking: Normaal, het laden van dit volume moet duren tussen 20-30 s.</li>
	<li>Plaats de plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer) voor 20 min. Deze stap en de opeenvolgende middellange toevoegingen zal gunst uitspoeling van de sucrose en evenwichtsinstelling van cellen met kweekmedium.</li>
	<li>Voeg 60 µL van medium aan de binnenwand van de insert, zodat het stromen van de muur. Het medium van de put, die rijk aan sacharose is, gecombineerd en Voeg 0,5 mL van verse medium.</li>
	<li>Voeg 60 µL van medium langzaam het invoegen en plaatsen van de plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer) gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Het medium van de put gecombineerd en toevoegen van 2.5 mL verse voedingsbodem in de put. Voeg 200 µL van medium in het insert. Plaats de plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer) te houden van de cellen onder de juiste voorwaarden.</li>
	<li>Het veranderen van het medium elke dag. Verwijder het oude medium uit de bodem van de put. 2,5 mL verse voedingsbodem aan het goed en 200 µL de invoegen toevoegen. Opmerking: Als celdifferentiatie blijft, de specifieke inducerend media zal worden toegevoegd aan de culturen, wat resulteert in de gewenste cel type verbintenis (zie hieronder, cel differentiatie).</li>
</ol>4. levensvatbaarheid in 3D-sappen
<ol> <li>Opmerking: De cel levensvatbaarheid bepaling staat bekend als de Live/Dead — levensvatbaarheid/cytotoxiciteit assay ook.</li>
	<li>In een tube van 15 mL, bereiden de nodige hoeveelheid een verse oplossing van 2 µM calceïne AM en 2 µM van ethidium homodimer-1 (EthD-1) in PBS met vortexing voor 10 s. houden in het donker. Opmerking: Het volume moet worden gebruikt voor elk monster zal afhangen van het goed formaat volgens het volgende: 2 mL voor elk putje van een 6-multiwell plaat; 1 mL voor elk goed van een 12-multiwell plaat en 0,5 mL voor elk putje van een 24-multiwell plaat.</li>
	<li>Met behulp van een micropipet, spoel de 3D-sappen monsters 3 keer met 2 mL PBS, en vervolgens het deksel met de oplossing bereid in stap 4.1. Na het bebroeden bij RT gedurende 40 min. in het donker.</li>
	<li>Met behulp van een micropipet, spoel de constructies met 2 mL PBS 5 keer.</li>
	<li>Visualiseer de monsters onder een fluorescentie Microscoop met behulp van 10 X of 20 X vergroting.</li>
</ol>5. de celdifferentiatie
<ol><li>Een aanvulling op cultuur cellen (37 ° C, 5% CO2, bevochtigde sfeer) in chondrocyten basaal Medium (CBM) met groei. Opmerking: De voorbereiding van het medium wordt beschreven in de fabrikanten instructies (Zie Materialen tabel).</li>
	<li>Induceren van celdifferentiatie op dag 2 met chondrogenic middellange met recombinante menselijke groeifactor-b1 [TGFb1] transformeren (10 ng/mL), L-ascorbinezuur 2-fosfaat [AA2P] (25 µg/mL) en dexamethason (100 nM).</li>
	<li>De cultuur gedurende 4 weken in een couveuse met een bevochtigde atmosfeer bij 37 ° C en 5% CO2. Wijzigen chondrogenic medium om de andere dag.</li>
</ol>6. toluïdine Blue (TB) kleuring
<ol><li>Wassen van de 3D-sappen culturen tweemaal door toevoegen en vervolgens het verwijderen van 2 mL PBS met een micropipet. Corrigeren door toevoeging van 2 mL van 2% (g/v) p-formaldehyde in PBS voor 2 h op RT.</li>
	<li>Was tweemaal met 2 mL 0,1% Triton X-100 in PBS (PBST).</li>
	<li>Incubeer met 2 mL 0,05% TB in water gedurende 20 minuten op RT.</li>
	<li>Was meerdere malen (minstens 3 maal) met 2 mL PBS totdat de PBS oplossing verwijderd duidelijk is.</li>
	<li>Het analyseren van monsters met visuele inspectie uit hoofde van een stereoscopische Microscoop11,13,14. Opmerking: TB vormt complexen met anionogene glycoconjugates op de extracellulaire matrix, zoals proteoglycans (PG) en glycosaminoglycanen (GAG), die voornamelijk door chondrocyten-achtige cellen worden uitgescheiden. Positieve monsters zijn blauw gekleurd.</li>
</ol>7. westelijke vlek
Opmerking: De procedure die in dit protocol werd eerder in verwijzing11beschreven.
<ol><li>Lyse 3D-constructies in RIPA buffer met proteaseinhibitor cocktail door pipetteren.</li>
	<li>Bereiden van acrylamide gel volgens de vereisten van de gel-volume (van de lopende apparatuur van specifieke gel) en draaien van de cel lysates voor 90 min op 150 V16. Opmerking: Acrylamide gel is meestal bereid in een concentratie tussen 7,5-10% (m/v), afhankelijk van het molecuulgewicht van het eiwit.</li>
	<li>Overdracht van de kaaseiwitten in de gel in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan door toepassing van 40 V voor 2 h op RT.</li>
	<li>Incubeer het membraan PVDF op RT gedurende 2 uur in de blokkeerbuffer (4% (m/v) nonfat melkpoeder in PBST) in een aparte container met genoeg volume ter dekking van het membraan.</li>
	<li>Incubeer het membraan bij RT voor 1 h met primaire antilichamen bij een eindconcentratie van 1 mg/mL in PBST. Zie materialen tabel.</li>
	<li>Voeg de secundaire antilichamen bij een concentratie van 1 mg/mL. Zie de tabel van de materialen.</li>
	<li>Het membraan voorbereiden op hP detectie met een chemiluminescentie substraat16. Zie materialen tabel.</li>
	<li>Neem chemiluminescentie beelden16.</li>
</ol>

<ol><li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9069283">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric β-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Can we build artificial stem cell compartments?</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li>
<li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization%3A+implications+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li>
<li>Genové, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li>
<li>Garreta, E., Genové, E., Borrós, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li>
<li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li>
<li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptides%3A+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li>
<li>Hernández Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li>
<li>Castells-Sala, C., Martínez-Ramos, C., Vallés-Lluch, A., Monleón Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li>
<li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile%2C+soft%2C+self-assembling%2C+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abellà, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+%28%CE%B5-Caprolactone%29%2FSelf-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (ε-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472(2016).</li>
<li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603(2016).</li>
<li>Aloy-Reverté, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+blotting+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eerder, onze fractie en anderen hebben beschreef het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur platformen met uiteenlopende cel systemen3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15. In het huidige werk, beschrijven we een gemakkelijke en betrouwbare methode voor het verkrijgen van 3D cultuur systemen die gelden voor elk type van zoogdiercellen met inbegrip van elk type van functionele cel, embryonaal of volwassen stamcellen, of uiteindelijk disfunctionele cellen geïsoleerd uit Biopten of tumoren, enzovoort. Daarnaast zelfstandig, zouden als stamcellen van embryonaal of volwassen oorsprong zijn zij hebben een betere lineage inzet capaciteit in de 3D-omgeving dan in klassieke 2D cultuur gerechten10,11,,12, 13,14,15. Daarom is de celcultuur in dit systeem zou leiden tot differentiatie in functionele weefsel-achtige structuren die kunnen worden gebruikt in verschillende toepassingen, gaande van herstellend of regeneratieve biologie naar toxicologische en farmacologische platformen.
Omdat de cellulaire communicatie vergelijkbaar met die van natuurlijke weefsels in termen van de basisstructuur en biomechanische, biofysische en biologische parameters is, hebben wij een duidelijke winst aangetoond in functie van de cel. Niettemin, aangezien het systeem steeds complexer, het aantal parameters die moeten worden geregeld ook toeneemt, waarin de noodzaak van een externe ondersteunende platform (zoals een actieve perfusie-systeem om massaoverdracht verschijnselen-geassocieerde problemen te voorkomen ). Ruimtelijk gekweekte cellen presteren beter op het gebied van de regulering van de essentiële activiteiten, zoals migratie, de proliferatie en differentiatie. Ze kunnen complexe netwerken waardoor verbeterde cellulaire Overspraak, die is veruit een onontbeerlijk gevolg van groeiende en differentiëren in 3D vormen. Het feit dat sappen kan leiden tot voorwaarden in vitro soortgelijk aan de extracellulaire matrix eiwitten vertegenwoordigt een voordeel sinds een rationele studie van het effect geproduceerd voor elk onderdeel toegevoegd aan de steiger (groeifactor, polysaccharide of signalering peptide) kan gemakkelijk plaatsvinden.
De duidelijke voordelen van het gebruik van sappen in vergelijking met andere natuurlijke steigers, zoals collageen type I en Matrigel, zijn de volgende: 1) sappen is een synthetische biomaterial met minimale variatie van batch tot batch productie; 2) sappen heeft het vermogen om te worden matiemaatschappij met specifieke peptide motieven; en 3) sappen presenteert lage biologische afbreekbaarheid in vitro, die het mogelijk het onderhoud van de 3D constructie met dezelfde biofysische, biomechanische en structurele eigenschappen na verloop van tijd maakt. Echter, de beperking van het gebruik van sappen versus andere steigers wordt gevonden tijdens de stap van de inkapseling, waar cellen in een vijandig milieu als gevolg van de lage pH. Daarom is dit een cruciale stap in de beschreven methodologie. Bovendien is het belangrijk om de concentratie van de sappen voor elke specifieke celtype vóór het begin van elke proef. Dit is in feite essentieel wanneer cellen worden gekweekt op of in deze biomaterialen, aangezien elke bepaald celtype optimale biomechanische groei omstandigheden zal presenteren.
Tenslotte menen wij dat het ontwerp en de fabricage van dit soort biomaterial steiger zou verbetering van de ontwikkeling van meer fysiologische en betrouwbare 3D weefsel modellen om te helpen de farmaceutische industrie te ontwikkelen beter therapeutische benaderingen voor regeneratieve geneeskunde, kanker of een medische behandeling.

Voor vele decennia lang werd zoogdiercellen cultuur uitgevoerd onder proefomstandigheden met behulp van klassieke tweedimensionale (2D) cultuur systemen als gevolg van praktische en economische kwesties ongeacht de niet-fysiologische aspecten. Hoewel dit cultuur-systeem helpt te bestuderen en begrijpen van meest moleculaire en cellulaire mechanismen, weten we vandaag dat nieuwe cel cultuur paradigma's te bestuderen van meer complexe cellulaire systemen nodig zijn. Daarom zijn driedimensionale (3D) cultuur systemen nodig om opnieuw een communicatie thats biofysisch, biomechanisch en biologisch meer vergelijkbaar met dat van natuurlijke weefsels. In de afgelopen jaren 3D cultuur systemen, in het algemeen, zijn uitgegroeid tot vaker tussen onderzoekers en industrie omdat zij een nieuw model van studie vertegenwoordigen of screening in welke cellen kunnen groeien in de ruimte, maken van cel naar cel of cel-naar-matrix interacties, migreren en uiteindelijk onderscheiden in specifieke cel geslachten.
Het algemene doel van deze methodiek is om opnieuw een in vitro cellulaire communicatie dat dichter bij de communicatie in vivo . In het bijzonder is de synthetische zelfassemblerende peptide steiger (SAPS) een soort biomaterial met unieke eigenschappen; het vormt een netwerk van nanometer-sized poriën gemaakt van zwakke interacties tussen peptiden met mechanische en structurele eigenschappen vergelijkbaar die van natuurlijke extracellulaire matrices. Met andere woorden, de rationaliteit achter het gebruik van dit materiaal is dat het creëert een echt 3D-omgeving die is ideaal voor het verkrijgen van pseudo-3D weefsels of orgelunits. Maar bovenal de 3D context kan de 3D-structuur te krijgen nieuwe biologische functies die normaal niet aanwezig in 2D cultuur platformen, zoals eigenschappen die betrekking hebben tot weefsel architectuur, massaoverdracht verschijnselen, cel patronen en uiteindelijk weefsel morfogenese, die zijn de belangrijkste factoren in toekomstig onderzoek en ontwikkeling van functionele weefsels en organen1,2. Bovendien, een voordeel van sappen over hun natuurlijke tegenhangers (collageen, Matrigel) is dat ze zeer stabiel bij kamertemperatuur zijn en geen bijzondere voorwaarden voor postproductie, distributie of opslag3,4, vereisen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sappen is gemakkelijk te hanteren, wanneer gewenst; 3D gels kunnen eenvoudig worden verkregen doordat de Ionische sterkte of door aanpassing van de pH tot neutraliteit1,2. Tot slot, de hier beschreven methode is uitgebreid gebruikt in vitro ter bevordering van onderhoud, groei en differentiatie van een aantal celtypes, met inbegrip van chondrocyten hepatocyten endotheliale cellen, botcellen, neuronale cellen zo goed als embryonale en somatische stamcellen3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. in het huidige werk, beschrijven we het gebruik van een 3D-cultuur-systeem om te onderscheiden van menselijke uitgebreide articulaire chondrocyten (hACh) in kraakbeen-achtig weefsel als eerder beschreven11.
Hier is een methode cultuur cellen in een 3D-systeem met behulp van sappen beschreven. In deze synthetische biomaterial, worden cellen eerst gemengd met een peptide-oplossing, die vervolgens wordt geïnduceerd zelf monteren, oprichting van een netwerk van nanometric afmetingen rond de cellen en dus het creëren van een echt 3D omgeving (Figuur 1). Het is belangrijk om te overwegen dat cellulaire gedrag wordt beïnvloed door stijfheid matrixwaarden (dat wil zeggen, proliferatie, migratie en differentiatie). Daarom is een gemeenschappelijke methodologische besturingselement naar cultuur cellen op de top van de peptide steiger met de dezelfde waarden van de stijfheid (cultuur in twee dimensies).

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&beta;1 (TGF-&beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

kweken van zoogdiercellen in driedimensionale peptide steigers

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Een handige techniek voor het kweken van cellen in een zelfassemblerende nanofiber driedimensionale (3D) steiger wordt beschreven. Dit systeem van cultuur herschept een omgeving die nauw samen van de Nabootsers van de structurele kenmerken van niet-gepolariseerd weefsel. Anderzijds maakt de specifieke intrinsieke nanofiber structuur van de steiger het transparant om visueel licht, die het mogelijk voor eenvoudige visualisatie van het monster onder microscopie maakt. Dit voordeel werd grotendeels gebruikt voor het bestuderen van cel migratie, organisatie, proliferatie, en differentiatie en dus elke ontwikkeling van hun bijzondere cellulaire functie door kleuring met specifieke kleurstoffen of sondes. Bovendien, in dit werk beschrijven we de goede prestaties van dit systeem gemakkelijk de redifferentiation van uitgebreide menselijke articulaire chondrocyten studeren in kraakbeenachtige weefsel. Cellen werden ingekapseld in het zelf monteren van steigers van peptide en gekweekt onder bepaalde voorwaarden ter bevordering van chondrogenesis. Driedimensionale culturen toonde goede levensvatbaarheid in de 4 weken van het experiment. Zoals verwacht, monsters met chondrogenic-inductoren (vergeleken met niet-geïnduceerde besturingselementen) gekweekte gekleurd sterk positief voor toluïdine blue (die vlekken glycosaminoglycanen (GAGs), die zeer aanwezig in de extracellulaire matrix kraakbeen zijn) en uitgedrukt specifieke moleculaire markers, met inbegrip van collageen type I, II en X, volgens de analyse van de Western Blot. Dit protocol is gemakkelijk te voeren en kan worden gebruikt op onderzoekslaboratoria, industrieën en voor educatieve doeleinden in laboratorium cursussen.

In het huidige werk, wordt een eenvoudige en sneller protocol naar cultuur cellen in 3D met sappen beschreven om betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve gegevens te verkrijgen. SAPS creëert een 3D communicatie met unieke eigenschappen die het mogelijk maken van gekweekte cellen onder de gewenste voorwaarden over te gaan tot de cel onderhoud, verspreiding en/of differentiatie3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. in onze fractie, een aantal studies zijn uitgevoerd met behulp van menselijke adipeus weefsel afgeleid voorlopercellen (hAPC), uitgebreide menselijke articulaire chondrocyten (hACh) en menselijke normale dermale fibroblasten (hNDF) tot cultuur, uit te breiden en onderscheid hen in kraakbeen-achtig weefsel10,11,12. Hier beschrijven we de 3D cultuur en opnieuw differentiatie van uitgebreide hACh in kraakbeen-achtig weefsel, zoals eerder beschreven11. Vandaar, wij kapselen cellen in 3D-sappen en cultuur hen in chondrogenic inductie medium, zoals beschreven in Figuur 1 (en in het Protocol). Na 24u, werden monsters beoordeeld voor leefbaarheid met de Live/Dead levensvatbaarheid/cytotoxiciteit Assay. De resultaten wijzen erop dat een paar procent van de cellen dood waren (rood) na 5 dagen voor de inkapseling en bijna geen dode cellen werden waargenomen na 4 weken van cultuur (Figuur 2). Vervolgens gekleurd wij hen voor glycosaminoglycaan (GAG) afzetting op de extracellulaire matrix met behulp van de toluïdine blauw kleuring methode. Zoals verwacht, reageerde deGroep op inductie goed op de behandeling, waaruit blijkt sterke kleuring (Figuur 2).
Ten slotte, moleculaire merkers van markeringen van chondrogenesis en hypertrofie, met inbegrip van collageen type I, II en X, werden geanalyseerd door westelijke vlek (Figuur 3). Collageen type die ik (Kol1) werd waargenomen in de 2D- en 3D-systemen, maar een lagere band van ~ 130 kDa (namens de volwassen Kol1 eiwitten om te worden gemonteerd op de extracellulaire matrix) werd alleen waargenomen in 3D. Dit resultaat geeft duidelijk aan cellen ondergaan differentiatie in drie dimensies realiseert in een meer fysiologische manier. Opmerkelijk, collageen type II (COL2) werd ontdekt - als een enkele band met de verwachte molecuulgewicht aanwezig op de extracellulaire matrix - alleen in 3D constructies gekweekt onder chondrogenic omstandigheden. Ten slotte, collageen type X (COL10) werd ontdekt in zowel in 2D als in 3D constructies gekweekt onder chondrogenic omstandigheden, die een zekere mate van hypertrofie aangeeft na 4 weken van cultuur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Figuur 1: schematische weergave van cel inkapseling in 3D-SAPS. Schematische weergave van de hACh inkapseling wordt beschreven om het verkrijgen van cellen willekeurig verspreid binnen het 3D-sappen. 1. zelf monteren peptide steiger (SAPS) voorbereiding; 2. cel schorsing voorbereiding; en 3. 3D-cel inkapseling in sappen. Merk op dat het schema alleen stappen 3.1-3.4 toont.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Figuur 2: cel differentiatie van de prestaties en chondrogenic in 3D-sappen culturen. Cel levensvatbaarheid kleuring trad op 5 dagen en 4 weken voor cultuur gedetecteerd onder een fluorescente microscoop (levende cellen in groene en dode cellen in het rood). Schaal bars = 200 µm. algemene chondrogenesis inzet beoordeeld door toluïdine blauw kleuring (sulfated glycosaminoglycanen in blauw) van 3D-sappen constructies gekweekte in controle en chondrogenic media. Schaal bars = 500 µm. Dit cijfer is gewijzigd van L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Figuur 3: collageen I, II en X uitdrukking van hACh ondergaan chondrogenesis. hACh gekweekt in een 2D-enkelgelaagde en in 3D-sappen na 4 weken in chondrogenic media en controles werden beoordeeld voor de expressie van collageen type I (Kol1), collageen type II (COL2) en collageen type X (COL10). Actin expressie werd gebruikt als een interne controle. Dit cijfer is gewijzigd van L. Recha-Sancho et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een protocol voor 3D-cultuur systemen bij het zelf monteren van peptide steigers ter bevordering van de differentiatie van dedifferentiated menselijke articulaire chondrocyten in kraakbeen-achtig weefsel.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, zoals hoe cellen zich gedragen in een 3D-micro-omgeving, cel-cel en cel-matrix interactie, hoe ze zich vermenigvuldigen, migreren, differentiëren en functionele weefsels vormen. Deze techniek is voordelig, omdat het een cellulaire micro-omgeving creëert die dichter bij fysiologische omstandigheden ligt. Het demonstreren van de procedure zal Nausika Betriu, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zijn.De implicaties van de methode strekken zich uit naar de therapie van beschadigde weefsels, aangezien het kan worden gebruikt om weefselequivalenten te verkrijgen voor reparatieve of regeneratieve geneeskunde. De methode kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals tumormodellen, diabetes of neurodegeneratieve ziekten. Om te beginnen, bereid 500 microliter van een 0,5%-oplossing van peptide RAD16-I in 20% gewicht per volume sucrose in een microcentrifugebuis.Soniciteer de oplossing in een ultrasoon bad op maximaal vermogen gedurende 20 minuten. Verdun vervolgens 300 microliter van de eerder bereide peptide-oplossing met 200 microliter van 10% sucrose om 500 microliter van een 0,3%-oplossing van peptide RAD16-I te verkrijgen. Plaats vervolgens de microcentrifugebuis met de peptide-oplossing in een ultrasoon bad op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.Centrifugeer vervolgens de eerder bereide celsuspensie. Vervolgens, gebruik een Pasteur-pijpje verbonden met een vacuümlijn, verwijder het supernatant. Voeg twee milliliter van 10% sucrose toe aan het celpelletje.Gebruik vervolgens een handmatige celteller om de cellen te tellen. Na het opnieuw suspenderen van de cellen, centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en suspendeer het celpelletje in het nodige volume van 10% sucrose om de gewenste concentratie van vier miljoen cellen per milliliter te verkrijgen.Soniciteer vervolgens de eerder bereide peptide-oplossing in het ultrasoon bad op maximaal vermogen gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Plaats een weefselcultuurinzet in elke put van een zes-putsplaat. Meng vervolgens 120 microliter van RAD16-I-oplossing met een gelijk volume celsuspensie in een microcentrifugebuis.Meng langzaam, het vormen van bubbels vermijdend, door op en neer te pipetteren. Een belangrijke factor om in overweging te nemen is het mengen van cellen met peptide-oplossing. Het is cruciaal om voorzichtig te zijn tijdens het mengen, langzaam, om het vormen van bubbels te voorkomen, door op en neer te pipetteren.Laad vervolgens, met behulp van een micropipet, 80 microliter van het RAD16-I en celsuspensie mengsel in elke inzet. Het laden van 80 microliter van het RAD16-I en celsuspensie mengsel in elke inzet moet snel worden uitgevoerd. Voeg 500 microliter media toe aan de bodem van elke put om het inzetmembraan te bevochtigen.Laat het peptide 20 minuten gelen in de laminaire stromingskast. Het toevoegen van 500 microliter media aan de bodem van elke put om het inzetmembraan te bevochtigen zal de gelvorming en 3D-cultuur-equilibratie met media bevorderen. Na 20 minuten, voeg heel langzaam 40 microliter medium toe aan de inzet en laat het langs de binnenwand naar het gel glijden.Vervolgens, incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Nadat de incubatie voltooid is, voeg 60 microliter medium toe aan de binnenwand van de inzet en laat het langs de wand stromen. Aspibeer vervolgens het sucrose-rijke medium uit de put en voeg 500 microliter vers medium toe.Voeg vervolgens 60 microliter medium toe aan de inzet. Incubeer de plaat gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Aspibeer vervolgens het medium uit de put.Voeg 2,5 milliliter vers medium toe aan de put en 200 microliter medium in de inzet. Incubeer de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius. Om de celviabiliteitstest uit te voeren, bereid een oplossing van twee micromolar calcein AM en twee micromolar ethidium homodimer-1 in PBS in een 15-milliliter buis voor.Vortex gedurende 10 seconden en bedek de buis met aluminiumfolie. Gebruik vervolgens een micropipet om de 3D-SAPS-monsters drie keer met twee milliliter PBS te spoelen. Voeg de calcein/ethidium homodimer-oplossing over de monsters toe.Dek vervolgens de monsters af met aluminiumfolie en incubeer ze gedurende 40 minuten op kamertemperatuur. Nadat de incubatie voltooid is, spoel de constructies vijf keer met twee milliliter PBS. Visualiseer tenslotte de monsters onder een fluorescentiemicroscoop met 20X vergroting.In dit protocol wordt een eenvoudige en snelle methode beschreven om cellen in 3D te kweken met behulp van SAPS. De celviabiliteitstest na de vorming van 3D-constructen toont weinig dode cellen, zoals geïllustreerd door cellen die na vijf dagen inkapsling rood gekleurd zijn. Na vier weken kweek zijn er bijna geen dode cellen waargenomen.Moleculair markers voor chondrogenese en hypertrofie worden geanalyseerd door western blot. De collageen type één band wordt waargenomen in zowel 2D- als 3D-systemen. De lagere band die het verwerkte, volwassen collageeneiwit vertegenwoordigt, wordt echter alleen in het 3D-systeem waargenomen, wat aangeeft dat differentiatie in 3D op een meer fysiologische manier verloopt.Bovendien wordt collageen type twee alleen in 3D-constructen gedetecteerd. Collageen type 10 wordt gedetecteerd in zowel 2D- als 3D-constructen, wat indicatief is voor een zekere mate van hypertrofie na vier weken kweek. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.Volgend op deze procedure kunnen andere methoden zoals collageen type één driedimensionale cel-incapsulatie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals celgedrag in een natuurlijk afbreekbaar scaffold. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw driedimensionale kweek van uw gewenste celtype

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.

Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

This video showcases the creation of a 3D polarized neural tissue model utilizing silk-collagen scaffolds. It details the process of seeding neuronal cells on porous silk scaffolds, incubating for cell attachment, embedding the scaffold with collagen, and underscores the significance of the supportive collagen matrix in forming a 3D polarized neural tissue model.

Developing an Engineered Silk-Collagen-Based 3D Model of Polarized Neural Tissue

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

Inzicht in de complexe werkingen van de hersenen vereist geavanceerde onderzoeksinstrumenten. Hier demonstreren we een nieuwe op zijde-collageen gebaseerd 3D-geengineerd model van zenuwweefsel dat lijkt op een hersen-achtige architectuur. Het model kan worden gebruikt om de assemblage van neuronale netwerken, axongeleide, cel-cel interacties en elektrische activiteit te bestuderen.

Engineered 3D Silk-collageen-gebaseerde model van de gepolariseerde zenuwweefsel

Driedriedimensionaal kweeksel in alginaatbolletjes, vanwege zijn eenvoud en reproduceerbaarheid, werd gekozen om de adenoomcellen van de hypofyse te onderhouden. De procedures omvatten een initiële enzymatische vertering en mechanische dissociatie van het tumorweefsel, en de daaropvolgende celsuspensie werd ingekapseld in alginaatbolletjes.

Driedimensionale alginaat-bead cultuur van de mens hypofyseadenoom Cells

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Het minimaliseren van de variabiliteit in de deeltjesfractie binnen korrelige steigers vergemakkelijkt reproduceerbare experimenten. Dit werk beschrijft methoden voor het genereren van granulaire steigers met gecontroleerde deeltjesfracties voor in vitro weefselmanipulatietoepassingen.

Deeltjesfractie regelen in microporeuze gegloeide deeltjessteigers voor 3D-celcultuur

Hier laten we zien hoe epitheelcellen gekweekt met fibroblasten in het nanovezelige membraangebaseerde tweelaagse systeem stabiel kunnen hechten aan en groeien op het membraan.

Het opzetten van een driedimensionale cocultuurmodule van epitheelcellen met behulp van nanovezelmembranen

Leer hoe je menselijke chondrocyten kweekt in 3D-peptidesteigers met RAD16-I voor weefselengineering. Deze methode bevordert differentiatie naar kraakbeenachtig weefsel en heeft toepassingen in regeneratieve geneeskunde.

Kweken van zoogdiercellen in driedimensionale Peptide steigers

Meer video's verkennen