Isolatie en karakterisatie van cardiale mesenchymale stromale cellen uit de Bioptic monsters Endomyocardial van Arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten
28 februari 2018
In dit artikel wordt een methode om te isoleren van de cardiale mesenchymale stromale cellen uit de bioptic monsters endomyocardial van arrhythmogenic cardiomyopathie patiënten verstrekt. Hun karakterisering en het protocol bij het stimuleren van hun adipogenic differentiatie worden beschreven.
De algemene doelen van dit protocol zijn om cardiale mesenchymale stromale cellen te isoleren van patiënten met aritmogene cardiomyopathie, hun adipogeen differentiatiepotentie te testen en hun oppervlaktemarkers te fenotyperen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van aritmogene cardiomyopathie te beantwoorden, zoals de betrokkenheid van cardiale stromale cellen bij adipo-substitutie en onderliggende moleculaire mechanismen. Het grote voordeel van deze techniek is dat de isolatie van stoma-cellen kan worden uitgevoerd met een paar eenvoudige passages uit zeer kleine hartspecimens.
Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de studie van aritmogene cardiomyopathie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals de studie van hart- en vaatziekten waarvoor een endomyocardial biopsie is geïndiceerd. We bestudeerden het idee voor deze methode voor het eerst toen we begrepen dat we de procedure voor het isoleren van stoma-cellen konden schalen om deze toe te passen op cardiale biopsies en de elektrofysiologie die deze ons zou kunnen bieden.
Voor dit protocol, verzamel een endomyocardial biopsie van de rechter ventrikel van een ACM-patiënt met behulp van geïntegreerde elektro-anatomische mapping en cardiale fluoroscopie. Neem ongeveer vijf gram weefsel en stuur het naar het lab in TMES-medium. In het lab, zet de biologische veiligheidskast op zoals nodig is om de procedure uit te voeren tot de ensomatische spijsvertering.
Breng vervolgens de biopsie over naar een plaat en was het twee keer met PBS. Op dit punt kan de biopsie onder een microscoop worden gedocumenteerd. Breng vervolgens de biopsie over in een twee milliliter buisje met één milliliter van de collagenase-oplossing.
Snijd vervolgens het monster in kleine fragmenten, tussen de 0,5 en één millimeter breed. Bewaar vervolgens het weefsel gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius met continue roterende agitatie. Centrifugeer vervolgens de gedigesteerde oplossing, verwijder het supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter PBS.
Centrifugeer vervolgens de buis opnieuw, verwijder het supernatant en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter TMES. Bewaar nu de suspensie op een 60 millimeter plaat en vul de plaat op tot drie milliliter met behulp van TMES, maar niet verder. Vervolgens cultiveer en breid de cellen uit volgens het tekstprotocol.
Voordat u begint, maak het celdissociatiereagens, de wasbuffer en de vereiste antilichamen klaar voor gebruik. Wanneer het geschatte aantal cellen in de cultuur drie miljoen bereikt, was de 100 millimeter plaat twee keer met 10 milliliter steriele PBS. Voeg vervolgens vijf milliliter celdissociatiereagens toe aan de cellen en incubeer de plaat gedurende zeven tot 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen los te maken.
Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg 15 milliliter PBS toe aan de cellen en breng de suspensie over in een 50 milliliter buisje. Centrifugeer vervolgens de cellen en suspendeer het pellet opnieuw in één milliliter wasbuffer. Tel vervolgens de cellen en breng drie miljoen over naar een nieuw buisje in een eindvolume van 1,5 milliliter wasbuffer.
Deel vervolgens de suspensie op in 12 faxbuisjes. Voeg in elke buis antilichamen toe die worden gebruikt om CMSC's te karakteriseren bij de aanbevolen concentraties. Zorg ervoor dat u de isotype-controles opneemt.
Nadat ze zijn voorbereid, incubeer de buisjes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Voeg later één milliliter wasbuffer toe aan elke buis om de reacties te stoppen. Centrifugeer vervolgens de cellen, verwijder het supernatant en suspendeer de pellets opnieuw in 250 microliter wasbuffer.
Ga nu door met het karakteriseren van de cellen met behulp van flowcytometrie. Na adipogeen differentiatie van de cellen, gebruik ORO-kleuring om te testen op lipide-accumulatie. Zorg ervoor dat u ORO-werkoplossing hebt voordat u begint.
Voor het kleuren van de cellen, verwijder het medium en was de cellen twee keer met twee milliliter PBS. Bedek vervolgens de cellen met 4% paraformaldehyde en laat ze vijf minuten bij kamertemperatuur fixeren. Gooi vervolgens de paraformaldehyde weg en was de cellen twee keer met twee milliliter PBS.
Na de tweede wassing voegt u voldoende ORO-werkoplossing toe om de cellen te bedekken. Bewaar vervolgens de plaat een uur bij kamertemperatuur. Deze incubatie moet worden uitgevoerd in een omgeving waar de auto-oplossing niet zal werken, dus volledige kamers worden niet aanbevolen.
Na de incubatie, aspireer de ORO-oplossing en was de cellen meerdere keren met twee milliliter PBS totdat de kleuring niet meer zichtbaar is in de PBS-was en totdat, wanneer bekeken onder de microscoop, niet-specifieke kleuring niet wordt gedetecteerd. Gebruik nu een omgekeerde weefselcultuur fasecontrastmicroscoop om 20 beelden van elke put op 20x vergroting vast te leggen. Details worden gegeven in het tekstprotocol.
CMSC's werden geïsoleerd uit endomyocardial biopsies zoals beschreven. Om hun mesenchymale lijn te bevestigen, werden cellen geïncubeerd met geschikte florofour-geconjugeerde antilichamen en geanalyseerd door flowcytometrie. De CMSC's waren positief voor de specifieke mesenchymale oppervlakte-antigenen CD29, CD44 en CD105.
De fractie van CD90-positieve cellen is bekend als variabel. De markers voor endotheel-erfgoed, monocyten- of macrofagen-erfgoed, onomatopoetisch erfgoed en voor het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex werden niet tot expressie gebracht. Vervolgens werden de CMSC's gekweekt in T.ADIPO-medium voor adipogeen differentiatie en gekleurd met ORO om naar intracellulaire lipidedruppels te zoeken.
CMSC's van patiënten met aritmogene cardiomyopathie accumuleerden meer lipidedruppels dan cellen van gezonde controles. Deze verschillen werden gemeten onder differentiatieomstandigheden bij 72 uur en bij zeven dagen. Eenmaal onder de knie, kan de celresolutie in drie uur worden gedaan, de kleuring kan in twee uur worden gedaan en de fax-analyse kan in drie uur worden voltooid.
Volgens deze procedure kunnen andere methoden
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van cardiale mesenchymale stromale cellen (CMSC's) uit endomyocardbiopten van patiënten met aritmogene cardiomyopathie. Het beschrijft in detail de karakterisering van deze cellen en een protocol om hun adipogene differentiatie te bevorderen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Hartbiologie
- Stamcelonderzoek
- Adipogene differentiatie
Achtergrond
- Arrhythmogene cardiomyopathie is een hartaandoening die wordt gekenmerkt door de vervanging van hartspierweefsel door fibreus of vetweefsel.
- Het begrijpen van de rol van cardiale stromale cellen bij deze aandoening kan inzicht verschaffen in de ziektemechanismen.
- De isolatie van CMSCs uit kleine hartmonsters is essentieel voor het bestuderen van hun eigenschappen.
- Deze methode kan ook worden aangepast voor andere cardiovasculaire aandoeningen waarbij endomyocardiale biopten vereist zijn.
Doel van de studie
- Om CMSCs te isoleren van patiënten met aritmogene cardiomyopathie.
- Om hun adipogene differentiatiepotentieel te evalueren.
- Om de oppervlaktemarkers van deze cellen te karakteriseren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van endomyocardiale biopten uit de rechterventrikel.
- Vertering van weefselmonsters met behulp van collagenase.
- Flowcytometrie voor karakterisering van oppervlaktemarkers.
- Oil Red O-kleuring om lipide-accumulatie na differentiatie te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- CMSCs zijn succesvol geïsoleerd en gekarakteriseerd.
- De cellen vertoonden positieve markers voor mesenchymale lineage.
- CMSCs van patiënten accumuleerden meer lipidedruppels in vergelijking met gezonde controles.
- De methodologie maakt een snelle verwerking en analyse van cellen mogelijk.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het isoleren van CMSCs uit hartbiopten.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van aritmogene cardiomyopathie verbeteren.
- Potentiële toepassingen strekken zich uit tot andere cardiovasculaire onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
De isolatie van cardiale mesenchymale stromale cellen van patiënten met aritmogene cardiomyopathie maakt een mechanische risicoanalyse mogelijk van de stromale betrokkenheid bij adipocyt-depositie, een kenmerk van de ziektepathologie. Dit primaire celmodel ondersteunt targetvalidatie door cellulaire fenotypes te koppelen aan ziektemechanismen, wat het voorspellend vertrouwen in vroege discovery verbetert. De methode biedt een schaalbaar, reproduceerbaar systeem voor het bestuderen van stromale bijdragen aan de progressie van cardiovasculaire aandoeningen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de betrokkenheid van stromale cellen bij adipocytenaccumulatie en fibrose.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van de mesenchymale lijn mogelijk via karakterisering van oppervlaktemarkers (CD29, CD44, CD105).
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt fenotypische screening van de adipogene differentiatiecapaciteit als een ziekterelateerde readout.
Screening & Assayontwikkeling
- Operationele waarde: Genereert gestandaardiseerde, uitbreidbare primaire celpopulaties uit minimaal biopsiemateriaal voor assay-gereedheid.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve output van adipogene differentiatie via Oil Red O-kleuring en kwantificering van lipidedruppels.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde immunofenotypering mogelijk voor consistente celkarakterisering over experimenten heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Waarde: Maakt gebruik van patiëntafgeleide cellen om de ziekte-specifieke adipogene neiging te modelleren die wordt waargenomen in harten met aritmogene cardiomyopathie.
- Translationele Waarde: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door stromale reacties onder differentiecondities te testen.
- Translationele Waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door ziekte-geassocieerde lipide-accumulatie te kwantificeren ten opzichte van controles.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelhypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, waarbij biologisch relevante cellulaire modellen worden geboden voor mechanistische analyse.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetesten mogelijk met betrekking tot de bijdragen van stromale cellen aan adipocytenafzetting en myocardiale remodellering.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve assays voor adipogene differentiatie die geschikt zijn voor compound-screening en studies naar padmodulatie.
- Analytics: Genereert multiparametrische readouts, waaronder expressie van oppervlaktemarkers (flowcytometrie) en lipideaccumulatie (Oil Red O) voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Maakt gebruik van patiëntafgeleide cellen om ziekte-relevante adipogene fenotypen te modelleren, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het isoleren en karakteriseren van cardiale stromale cellen voor diverse cardiovasculaire indicaties waarvoor een endomyocardiale biopsie vereist is.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door het fenotype en het differentiatievermogen van stromale cellen in een ziektecontext te definiëren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor digestie, expansie en karakterisering vanuit kleine weefselmonsters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het verschaffen van kwantitatieve, ziekte-relevante cellulaire read-outs voor de prioritering van targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde vooruitgang mogelijk door cellulaire fenotypes te koppelen aan pathologische kenmerken waargenomen in patiëntenweefsels.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in primaire celkweek, flowcytometrie en histologische kleuringstechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot endomyocardiale biopsie monsters en infrastructuur voor digestie op basis van collagenase.
- Vereist gestandaardiseerde workflows voor immunofenotypering en adipogene differentiatie tussen laboratoria.
- Vereist aanpassing van differentiatiemedia en kleuringsprotocollen voor een consistente kwantificering van lipidedruppels.
- Beperkt door de grootte en viabiliteit van de biopsie monsters, waardoor geoptimaliseerde verwerking noodzakelijk is om de celopbrengst te maximaliseren.
Veelgestelde vragen over biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Cardiac Biopsy Collection and Processing
3:06
Characterizing Cardiac Mesenchymal Stromal Cells (C-MSC) by Flow Cytometry
5:22
Oil Red O (ORO) Staining C-MSC after Adipogenic Differentiation
7:02
Results: Flow Cytometry Analysis and ORO Staining
8:27
Conclusion
