Name: Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Leer stereotaxische chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen in neonatale muizenhersenen. Deze methode met zelfgemaakt apparaat maakt precieze micro-injecties mogelijk voor onderzoek naar neuroontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie verleent MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, de nationale instituten van gezondheid onderzoek subsidie NHRI-EX106-10429NI, en de aanbevolen gebieden Research Center Program grant van het ministerie van onderwijs door Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, en de postdoctorale Fellowship verleent MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 en MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).

De dierlijke protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik comités van nationale Yang-Ming Universiteit.
1. voorbereiding van de houder van de neonatale Pups in het Stereotaxic apparaat
<ol><li>De hoofd lade maken: Snijd de onderkant van een centrifugebuis 1,5 mL (15 mm lang) in de vorm die het hoofd van neonatale pups door het verwijderen van 1/5 van de wand van de buis past.</li>
	<li>Neem een pipet tip doos met de juiste grootte die bij het voetstuk van stereotaxic apparaat past, en verwijder de bovenklep. Brengt het hoofd lade bereid in stap 1.1 en een cassette weefsel insluiten op de basis van tip dienblad met hot-smelten lijm. De hoogte van het weefsel inbedden cassette is 7 mm, die wordt gebruikt ter ondersteuning van de nek en het lichaam van de pup in de hoofd-vaste positie.</li>
	<li>Plaats de hele setup in een standaard stereotaxic apparaat.</li>
</ol>2. voorbereiding van 30G injectie RVS naalden
<ol><li>Vooraf schone 30 G spuit naalden door inweken hen in chloroform voor 3 dagen.</li>
	<li>Gebruik pincet om zorgvuldig en langzaam Trek de naald uit haar polypropyleen hub in een chemische kap.</li>
	<li>Wassen van de naalden met absolute ethanol gedurende 20 minuten, gevolgd door 70% ethanol gespoeld voor 3 × 10 min op een shaker 50 rpm. Laat de naalden lucht droog, en de schone naalden Bewaar in een schone vak bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.</li>
</ol>3. een Adapter voorbereiden door Microinjection Tubing
<ol><li>De spuit microliter verbinden met een naald 30G injectie met een PE10 polyethyleen buis (PE10 buis). Voorbereiden op een PE20 polyethyleen buis (PE20 buis) adapter overbruggen de injectie naald en de spuit microliter. Het gebruik van de adapter is nodig, omdat de diameter van de buis van de PE10 veel kleiner dan die van de naald van de spuit 26G microliter is.</li>
	<li>De buis voor de microliter spuit bereiden: Sluit de vooraf gereinigd 30 G injectie naald met 5 cm van PE20 buis, en verzegel het kruispunt met instant lijm. Deze buis-adapter is herbruikbaar. Opmerking: Als de naald van microinjection spuit is 30G, de voorbereiding (stap 3.1) en het gebruik (stap 3.3) voor deze adapter is niet nodig.</li>
	<li>Sluit de adapter van de buis (bereid in stap 3.1) met een microliter spuit (10 µL).</li>
	<li>Sluit het ene uiteinde van PE10 buis (langer dan 60 cm) op de naald 30G van de PE20 slang adapter. Monteer een nieuwe 30G injectie naald op het andere uiteinde van de buis van de PE10.</li>
</ol>4. Laad de Microinjection buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd Water, kleurstof en virussen
<ol><li>Verwijder de plunjer van de injectiespuit microliter. Gebruik een 25G spuit te laden de microliter spuit en haar verbonden PE buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water te verwijderen van de lucht uit de slang.</li>
	<li>Plaats de zuiger terug naar de microliter spuit, en duw de plunjer tot 2 ÂµL van gedistilleerd water in het vat blijft. Laat niet de hoeveelheid gedestilleerd water lager dan 2 µL worden.</li>
	<li>Mount zorgvuldig de microliter spuit op de micro stroom tarief-spuitpomp.</li>
	<li>Pipetteer van kleine hoeveelheden van 0,1% snel groene kleurstof (bereid in een zoutoplossing 0,9% en gefilterd met 0,22 µm filter) en het virus vloeistoffen op een stuk parafilm.</li>
	<li>Een kleine hoeveelheid lucht een luchtbel zichtbaar maken op de kruising tussen de 30G injectie naald en PE10 buis gevolgd door het laden van 0,7 µL van gefilterde snel groen in de buis om te testen de stroom van vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.</li>
	<li>Een andere kleine hoeveelheid lucht om een tweede luchtbel gevolgd door het laden van de virus vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.</li>
	<li>Hechten en beveiligen van de 30G microinjection naald aan de tak van stereotaxic apparaat.</li>
</ol>5. de verdoving van neonatale muizen door onderkoeling
<ol><li>Plaats de pup in een latex handschoen hoes en dompel het in crushed ijs tot de nek voor 5 min.</li>
	<li>Knijp de pup de voeten met een tang om ervoor te zorgen dat geen reactie van de terugtrekking van zijn voeten.</li>
	<li>Plaats van de pup met latex handschoen mouw in het Dienblad van het hoofd en zet sommige crushed ijs rond de latex mouw te houden koude voor onderkoeling anesthesie.</li>
	<li>Dierenarts zalf toepassen op pup van ogen om indien mogelijk te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.</li>
</ol>6. microinjection
<ol><li>Steriele chirurgie voor te bereiden door af te vegen de stereotaxic instrument grondig met 70% ethanol. Het chirurgische instrument steriliseren door ze onder te dompelen in 70% ethanol.</li>
	<li>Schrobben van de pup hoofd met 70% ethanol. Zoek de landmark lambda op de schedel en de lambda markeren met een viltstift. Doel van de tip van de naald om de lambda, en bepalen de anterior-posterior (AP) en de mediale-en laterale (ML) coördinaten nul.</li>
	<li>Verplaats de injectie arm naar de doelsite volgens de X- en Y-coördinaten van de doelsite. Voor het striatum van postnatale dag (P) 2 pups, de coördinaten zijn: AP, +2.4 mm anterior to de lambda; ML, ±1.0 mm lateraal van de middellijn; dorsal-ventrale (DV), −1.7 mm van de schedel. Markeer de positie van snel groene kleurstof in PE10 buis met een pen.</li>
	<li>Neerhalen van de 30G injectie naald langzaam te dringen via de huid en de schedel, en dan breng omhoog de naald tip totdat het stopt bij het oppervlak van de schedel. De DV-coördinaat ingesteld als nul.</li>
	<li>Omlaag brengen de 30G injectie naald langzaam totdat zij de DV-coördinaat van de doelsite tot. Wacht 1 minuut om het parenchym hervatten van de normale vorm. Voer het programma van microinjection (100 nL/min).</li>
	<li>Zorg ervoor dat het merk van snel groene kleurstof zich beweegt in de PE-buis om ervoor te zorgen dat de virus vloeistof wordt geïnjecteerd in de hersenen.</li>
	<li>1 min wachten na de beëindiging van de microinjection, en dan langzaam en geleidelijk breng omhoog de naald tot 1/2 hoogte van DV diepte binnen 30 s. Na 30 s, langzaam het terugtrekken van de naald uit de pup het hoofd.</li>
	<li>Herhaal stap 6.2 tot en met 6.7 totdat de microinjections van alle gerichte sites zijn voltooid.</li>
</ol>7. post-chirurgisch herstel van de Pup
<ol><li>Opwarmen van de pup voor 20 min in een incubator 33 ° C. Controleer de terugwinning van de pup uit hypothermie verdoving elke 5 minuten totdat de pup heeft herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.</li>
	<li>De pup terug terug naar de dam, nadat de pup volledig is hersteld.</li>
</ol>

<ol><li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+for+neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li>
<li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+of+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li>
<li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+neurodevelopmental+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li>
<li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+circuits%2C+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li>
<li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Bull%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li>
<li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatal+mosaic%3A+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li>
<li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neural+Circuit%22%5BJournal%5D)">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de huidige studie, we laten zien een eenvoudige en betrouwbare stereotaxic methode voor het injecteren van AAV virussen in het striatum van neonatale muis hersenen. Wij microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in het striatum van Ai14 verslaggever muizen op P2 en vervolgens de verslaggever genexpressie bij P14 geanalyseerd. We vonden getransduceerde AAV GFP-positieve cellen in de hele het striatum op rostrocaudal niveau. Bovendien, bijna alle GFP-positieve cellen uitgedrukt samen het tdTomato verslaggever gen in striatale ...

Moderne studies van de structuur en functie van de hersenen vereisen meestal genetische manipulatie van specifieke genen in neuronale cellen. Om de sonde van de functies van verschillende genen, transgene muizen mutant allelen, met inbegrip van uitvoering zijn knock-out en knock-in allelen routinematig gegenereerd. Stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren is een standaardmethode om lokaal drugs, virussen, verklikstoffen en andere reagentia voor specifieke regio's voor knaagdieren hersenen1,2. De stereotaxic hersenoperatie toe te passen op transgene muizen toelaat een om genetisch te manipuleren de genfunctie en de neuronale activiteit in specifieke neuronale populaties van de hersenen van de muis. De manipulatie van de type-specifieke cel biedt een krachtige aanpak om te ontcijferen van neuronale functies in complexe neurale circuits van de hersenen3,4,5.
Neurale ontwikkeling van het zenuwstelsel begint bij vroege embryonale stadia en de ontwikkelings processen blijven na de geboorte tot de jonge periode. Postnatale rijping van het zenuwstelsel omvat de precieze synaptic bedrading van neurale circuits, die is van essentieel belang voor fysiologische en cognitieve functies van de hersenen-6. Daarom studeren developmental gebeurtenissen die in neonatale tijd windows plaatsvinden is niet alleen belangrijk voor het begrijpen van normale neurale ontwikkeling, maar het kan ook inzicht verwerven in de pathogenese van neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen7 ,8. Hoewel de methoden van stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren direct beschikbaar2,9 zijn, zijn paar protocollen beschikbaar op het internet voor stereotaxic hersenoperatie in neonatale muizen10,11. In feite, zijn stereotaxic microinjections van reagentia in de hersenen van neonatale muis pups moeilijk, omdat het hoofd van neonatale pup is te kwetsbaar vast te stellen in de standaard stereotaxic apparaat. Niettemin, de toepassing van stereotaxic hersenoperatie op transgene muizen is haalbaar voor neonatale muizen12. Hier beschrijven we een eenvoudige methode met een zelfgemaakte setup uit te voeren stereotaxic hersenoperatie in pasgeboren muis pups. We laten zien dat deze techniek maakt het mogelijk om voorwaardelijk verwijderen floxed genen door AAV-uiten Cre DNA recombinase microinjecting in het striatum van reporter gene muizen en voorwaardelijk floxed transgene muizen. Deze techniek is ook van toepassing op het leveren van reagentia in de neonatale striatum van wild-type muizen.

```html
<table><tbody><tr><td>30G PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton MICROLITER Syringe</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>80300</td><td>30G-naald past op PE10-buis; 26G-naald heeft een PE20-adapter nodig</td></tr><tr><td>Polyethyleen buis PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buis PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Micro Flow Rate Spuitpomp</td><td>Longer Precision Pump Co.</td><td>TJ-2A (Controller) en L0107-2A (Aandrijfeenheid)</td><td></td></tr><tr><td>25G-spuit</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>Standaard stereotaxische instrumenten</td><td>RWD Life Science</td><td>68037</td><td>Zonder gebruik van 68030 Muis/Neonatale Rat Adaptor</td></tr><tr><td>Anti-FOXP2 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>Konijn polyklonaal voor FOXP2, 1:4.000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Muis monoklonaal voor RFP, 1:1.000</td></tr><tr><td>BX63 microscoop</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 confocale microscoop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn geconjugeerd Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5,506x1013 (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td><td>N/A</td><td>1x1014 (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Labtorary&nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>The Jackson Labtorary&nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2fl/fl</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Corning&nbsp;cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>
```

stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Veel genen in embryonale hersenen zijn uitgedrukt, en sommigen van hen voortdurend worden uitgedrukt in de hersenen na de geboorte. Voor dergelijke aanhoudend uitgedrukte genen werken ze voor het regelen van de ontwikkelingstoxiciteit proces en/of de fysiologische functie in neonatale hersenen. Om te onderzoeken neurobiologische functies van specifieke genen in de hersenen, is het essentieel om de inactivering van genen in de hersenen. Hier beschrijven we een eenvoudige stereotaxic methode om de inactivering van genexpressie in het striatum van transgene muizen op neonatale tijd windows. AAV-eGFP-Cre virussen werden microinjected in het striatum van Ai14 reporter gene muizen op postnatale dag (P) 2 door stereotaxic hersenchirurgie. De tdTomato verslaggever genexpressie werd ontdekt in P14 striatum, hetgeen wijst op dat een succesvolle Cre-loxP gemedieerde DNA recombinatie bij AAV-getransduceerde striatale cellen. We verder gevalideerd deze techniek door AAV-eGFP-Cre virussen in P2Foxp2fl/fl muizen microinjecting. Dubbele etikettering van GFP en Foxp2 bleek dat GFP-positieve cellen ontbrak Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggereert het verlies van Foxp2-eiwit in de AAV-eGFP-Cre getransduceerde striatale cellen. Samen genomen, tonen deze resultaten een effectieve genetische schrapping door stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in specifieke neuronale populaties in de neonatale hersenen van floxed transgene muizen. Kortom, biedt onze stereotaxic techniek een gemakkelijk en eenvoudig platform voor genetische manipulatie in neonatale muis hersenen. De techniek kan niet alleen worden gebruikt om te verwijderen van de genen in bepaalde gebieden van neonatale hersenen, maar het kan ook worden gebruikt om te injecteren farmacologische drugs, neuronale verklikstoffen, genetisch gemodificeerde optogenetics en chemogenetics eiwitten, neuronale activiteit indicatoren en andere reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen.

Voor de eerste reeks van experiment, microinjected wij 200 nL van AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virussen (AAV-eGFP-Cre, 1/10 verdunning in de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing) die uitdrukking geven aan de Cre DNA recombinase gesmolten met GFP in P2 striatum van Ai14 muizen. De muizen Ai14 express tdTomato verslaggever gen op Cre-gemedieerde schrapping van loxP-geflankeerd (floxed) STOP cassette (figuur 2F). De hersenen werden voor immunokleurin...

We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de genetische en neuro-ontwikkeling, zoals tijdens de postnatale ontwikkeling. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige techniek is met een zelfgemaakt apparaat. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat het maken van gerichte injecties in de hersenen volledige aandacht voor details vereist.Om te beginnen, maak een houder om neonatale pups in een stereotactische inrichting te gebruiken. Maak eerst de hoofdbak. Snijd ongeveer 1/5 van de bodem van een centrifugeerbuisje van 1,5 milliliter af om een opening te maken voor het hoofd van een neonatale pup.Selecteer vervolgens een lege pipettepuntendoos die past op het voetstuk van de stereotactische inrichting. Gebruik vervolgens hete lijm om de hoofdbak aan de basis van de puntendoos te bevestigen. Lijm vervolgens een weefsel-inbeddingscassette op de doos waar deze de romp van de pup kan ondersteunen terwijl het hoofd vastzit.Bereid nu 30 gauge roestvrijstalen naalden voor voor de injectie. Reinig ze eerst door ze drie dagen in een glazen flacon in chloroform te laten weken. Drie dagen later, verwijder de naalden voorzichtig en was ze 20 minuten lang met absoluut ethanol en met 50 tpm agiteren.Was ze vervolgens drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt met 70% ethanol, ook met agitatie. Laat de naalden na het wassen drogen en bewaar ze in een schone doos bij kamertemperatuur tot gebruik. Gebruik voor de micro-injectieassemblage een vijf centimeter segment PE20 polyethyleen slang om de PE10 slang te verbinden met een 26 gauge 10 microliter spuit.Bevestig de verbinding met cyanoacrylaat. Monteer vervolgens de nieuwe 30 gauge injectienaald aan het andere uiteinde van de PE10 buis. Laad nu de 10 microliter micro-injectiespuit.Verwijder de plunjer en gebruik een andere 25 gauge spuit om de assemblage terug te laden met geautoclaveerde gedistilleerd water om lucht uit de slang te verwijderen. Plaats vervolgens de plunjer terug op de microliter spuit en duw de plunjer tot er slechts twee microliters gedistilleerd water in de cilinder achterblijft. Monteer vervolgens voorzichtig de microliterspuit op de microflow spuitpomp.Pipet vervolgens kleine hoeveelheden gefilterde 0,1% Fast Green kleurstof in de experimentele virusvloeistoffen op een stukje parafilm. Zuig nu een kleine hoeveelheid lucht in de spuit totdat er een luchtbel zichtbaar is tussen de injectienaald en de slang. Laad vervolgens 0,7 microliters gefilterde Fast Green oplossing om de stroming van vloeistoffen in de micro-injectieslang te testen.Als de stroming goed is, zuig dan nog een kleine hoeveelheid lucht aan om een tweede luchtbel te maken en volg door de injectieoplossing in de micro-injectieslang te laden. Bevestig en zet de micro-injectienaald vast aan de stereotactische inrichting en ga verder met de micro-injectie van de neonatale muizen. Maak in voorbereiding op de operatie het stereotactische instrument grondig schoon met 70% ethanol en steriliseer de chirurgische instrumenten met 70% ethanol.Vervolgens verdoof een neonat met hypothermie. Plaats de pup in een latex handschoen en dompel hem vijf minuten lang in geplet ijs tot aan zijn nek. Knijp vervolgens in de voeten van de pup met een pincet om er zeker van te zijn dat er geen pedaalreflex is.Positioneer vervolgens de pup met de handschoen in de hoofdbak en doe wat geplet ijs rond de latex manchet om de hypothermieanesthesie te handhaven. Schrob vervolgens het hoofd van de pup met 70% ethanol en lokaliseer het lambda-landmerk. Markeer het met een marker.Richt vervolgens het naaldpunt op het lambda en stel de anterieure/posterior en mediale/laterale coördinaten op nul. Raadpleeg vervolgens een hersenatlas, beweeg de injectiearm naar de doelplaats. Bijvoorbeeld, het striatum van P2 pups is 2,4 millimeter anterieure ten opzichte van het lambda, 1,0 millimeter aan beide kanten van de middenlijn, en 1,7 millimeter ventraal.Markeer vervolgens de positie van de Fast Green kleurstof op de PE10 buis met een pen. Begin vervolgens langzaam de naald door de huid en schedel te prikken tot het naaldpunt het oppervlak van de schedel raakt. Stel de dorsaal/ventraal coördinaat op nul.Laat vervolgens de naald langzaam zakken naar de doelplaats. Eenmaal op positie, wacht u een minuut om het parenchym te laten terugkeren naar zijn normale vorm. Voer vervolgens het micro-injectieprogramma uit met 100 nanoliter per minuut.Tijdens de injectie, kijk naar de Fast Green kleurstof die in de PE slang beweegt. Het is cruciaal om langzaam de naald door de huid en schedel te prikken tot het naaldpunt het oppervlak van de schedel raakt. Tijdens de injectie, is het van essentieel belang om de Fast Green kleurstof te bekijken die in de PE slang beweegt.Nadat de injectie is voltooid, wacht u een minuut en brengt u de naald langzaam omhoog tot 1/2 van de doorgedrongen DV-diepte. Wacht vervolgens nog 30 seconden voordat u doorgaat met het langzaam terugtrekken van de naald uit het hoofd van de pup. Na voltooiing van de injectie, is het belangrijk om een minuut te wachten voordat u de naald langzaam omhoog brengt tot 1/2 van de doorgedrongen DV-diepte.Wacht vervolgens nog 30 seconden voordat u de naald langzaam uit het hoofd van de pup terugtrekt. Nadat alle doelplaatsen zijn geïnjecteerd, verwarmt u de pup gedurende 20 minuten in een incubator van 33 graden Celsius. Controleer elke vijf minuten of de pup weer op zijn borst ligt.Breng vervolgens de pup terug naar zijn moeder. 200 nanoliters virus dat Cre DNA recombinase tot expressie brengt, gefuseerd met GFP, werden geïnjecteerd in het P2 striatum van Ai14 muizen. Deze muizen tot expressie brengen van het tdTomato reportergen bij Cre-gemedieerde deletie van een loxP geflankeerde stopcassette.De hersenen werden gehaald op P14 voor immunokleuring van GFP en tdTomato. Veel AAV getransduceerde GFP positieve cellen waren aanwezig in het gehele striatum

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gerichte ablatie van specifieke gebied van de hersenen (en) via een infuus van een excitotoxin gebruik van stereotaxische coördinaten beschreven. Deze techniek kan ook worden aangepast voor infusie van andere stoffen in de rat.

Stereotaxische Chirurgie voor excitotoxische laesie van specifieke hersengebieden in de Adult Rat

Regelen van de groei van somatische stamcellen is een belangrijke factor die de studie en het gebruik in therapie. Hier beschrijven we een systeem tijdelijk controle neurale stamcellen expansie en volwassen, die kunnen worden gebruikt om het aantal neuronen gegenereerd in muizenhersenen verhogen.

Uitbreiding van embryonale en adulte neurale stamcellen door<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation of Viral stereotactische injectie

Source: Porlan, E., et al. Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stable genetic modification of neural stem cells (NSCs) in the ventricular-subventricular zone (V-SVZ) through stereotaxic injection of a virus-carrying therapeutic gene in a mouse model. The virus enters NSCs, undergoes reverse transcription, integrates into the genome, and...

Stereotaxic Injection of Viruses for Stable Genetic Modification in a Mouse Model

This video describes an efficient technique to induce glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate, and generate tumors with histopathological characteristics of human GBM.

Glioblastoma Induction Using SB Mediated Transposition: A Technique for Generating Novel Mouse Model Using Transposon Mediated Integration of SB Plasmid into Neonatal Mouse Brain

Source: Chen, S., et al., Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the stereotaxic injection of a viral vector encoding Cre recombinase and green fluorescence protein or GFP into the striatum of a genetically modified mouse pup to achieve gene manipulation by excising a loxP-flanked STOP cassette, activating red fluorescence protein or RFP as a reporter.

Stereotactic Microinjection of a Viral Vector for Gene Manipulation in a Mouse Pup Striatum

Source: Fricano-Kugler, C. J., et al. Designing, Packaging, and Delivery of High Titer CRISPR Retro and Lentiviruses via Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates stereotaxic viral injection for precise neuronal gene editing in the mouse brain. The protocol ensures accurate virus delivery to the dentate gyrus, enabling fluorescent labeling and CRISPR-mediated gene knockout to study neural circuits, gene function, and disease mechanisms in vivo.

Stereotaxic Viral Injection for Targeted Neuronal Gene Editing in the Mouse Brain

Source: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the Early Postnatal Mouse Hippocampus to Mitigate Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the stereotaxic injection of human-derived interneuron precursor cells into the hippocampus of a genetically modified mouse pup with reduced inhibitory interneurons, aiming to restore excitatory-inhibitory balance.

Transplantation of Human-Derived Interneuron Precursor Cells into the Mouse Pup Hippocampus

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

We presenteren een lentivirale techniek voor genetische manipulatie en visualisatie van een olfactorische sensorische neuron axon en de terminal...

Lentivirus-gemedieerde genetische manipulatie en visualisatie van olfactorische sensorische neuronen In vivo</em

Stereotaxische operatie aan knaagdieren zorgt voor doelgerichte toediening van geneesmiddelen of elektrische stimulatie en opnamen in wakker gedragen dieren. In deze video presentatie zullen we zien de laatste procedurele verfijningen aan deze langdurige procedure die met succes een verbeterde overleving en verminderde post-operatieve gewichtsverlies.

Knaagdier stereotaxische Chirurgie en Dierenwelzijn Outcome Verbeteringen voor Behavioral Neuroscience

Leer stereotaxische chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen in neonatale muizenhersenen. Deze methode met zelfgemaakt apparaat maakt precieze micro-injecties mogelijk voor onderzoek naar neuroontwikkeling.

Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen

Meer video's verkennen