Name: Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Leer de onderdompelings- en orientatortechniek voor biobankvarkensweefsel om betrouwbare volumetrie en onbevooroordeelde morfologische analyse uit te voeren. Deze methoden verbeteren de kwaliteit van weefselmonsters in neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedanken Lisa Pichl voor uitstekende technische bijstand.

<ol><li>Aigner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+pigs+as+models+for+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Transgenic pigs as models for translational biomedical research.</a> J Mol. Med. 88, 653-664 (2010).</li>
<li>Blutke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Munich+MIDY+Pig+Biobank%3A+A+unique+resource+for+studying+organ+crosstalk+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">The Munich MIDY Pig Biobank: A unique resource for studying organ crosstalk in diabetes.</a> Mol Metab. 6, 931-940 (2017).</li>
<li>Klymiuk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-deficient+pigs+provide+new+insights+into+the+hierarchy+of+physiological+derangements+of+dystrophic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle.</a> Hum Mol Genet. 22, 4368-4382 (2013).</li>
<li>Klymiuk, N., Seeliger, F., Bohlooly, Y. M., Blutke, A., Rudmann, D. G., Wolf, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+pig+models+for+preclinical+efficacy+and+safety+testing+of+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tailored pig models for preclinical efficacy and safety testing of targeted therapies.</a> Toxicol Pathol. 44, 346-357 (2016).</li>
<li>Renner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+neonatal+diabetes+in+INSC94Y+transgenic+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Permanent neonatal diabetes in INSC94Y transgenic pigs.</a> Diabetes. 62, 1505-1511 (2013).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+first+pig+biobank%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inside the first pig biobank.</a> Nature. 519, 397-398 (2015).</li>
<li>Albl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+sampling+guides+for+porcine+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissue sampling guides for porcine biomedical models.</a> Toxicol Pathol. 44, 414-420 (2016).</li>
<li>Gundersen, H. J. G., Mirabile, R., Brown, D., Boyce, R. W. Stereological principles and sampling procedures for toxicologic pathologists. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGundersen%2C+HJG+%22Haschek+and+Rousseaux%27s+Handbook+of+Toxicologic+Pathology%22">Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology</a>. Haschek, W. , 3rd ed, Academic Press. London. 215-286 (2013).</li>
<li>Howard, C. V., Reed, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+CV+%22Unbiased+Stereology%3A+Three-Dimensional+Measurement+in+Microscopy%22">Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy</a>. , 2nd ed, Garland science/Bios Scientific Publishers. Oxford. 1-277 (2005).</li>
<li>Mattfeldt, T., Mall, G., Gharehbaghi, H., Moller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+surface+area+and+length+with+the+orientator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Estimation of surface area and length with the orientator.</a> J Microsc. 159, 301-317 (1990).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2818.1992.tb01497.x/abstract">The isector: A simple and direct method for generating isotropic, uniform random sections from small specimens.</a> J Microsc. 165, 427-431 (1992).</li>
<li>Tschanz, S., Schneider, J. P., Knudsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology%3A+Planning%2C+volumetry+and+sampling+are+crucial+steps+for+a+successful+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology: Planning, volumetry and sampling are crucial steps for a successful study.</a> Ann Anat. 196, 3-11 (2014).</li>
<li>Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+shrinkage+and+unbiased+stereological+estimation+of+particle+number+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size.</a> J Microsc. 204, 232-246 (2001).</li>
<li>Mattfeldt, T. Stereologische Methoden in der Pathologie [Stereologic methods in pathology]. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattfeldt%2C+T+%22Normale+und+pathologische+Anatomie%22">Normale und pathologische Anatomie</a>. Doerr, W., Leonhardt, H. , Georg Thieme Verlag. Stuttgart-New York. (1990).</li>
<li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> J Microsc. 147, 229-263 (1987).</li>
<li>Scherle, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+volumetry+of+organs+in+quantitative+stereology%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopie%22%5BJournal%5D)">A simple method for volumetry of organs in quantitative stereology.</a> Mikroskopie. 26, 57-60 (1970).</li>
<li>Nielsen, K. K., Andersen, C. B., Kromann-Andersen, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7500483">A comparison between the effects of paraffin and plastic embedding of the normal and obstructed minipig detrusor muscle using the optical disector.</a> J Urol. 154, 2170-2173 (1995).</li>
<li>Schneider, J. P., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mouse+lung+tissue+dimensions+during+processing+for+morphometry%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L341-L350 (2014).</li>
<li>von Bartheld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+particles+in+the+z-axis+of+tissue+sections%3A+Relevance+for+counting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroQuantology%22%5BJournal%5D)">Distribution of particles in the z-axis of tissue sections: Relevance for counting methods.</a> NeuroQuantology. 10, 66-75 (2012).</li>
<li>Baddeley, A. J., Gundersen, H. J., Cruz-Orive, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+surface+area+from+vertical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+microsc%22%5BJournal%5D)">Estimation of surface area from vertical sections.</a> J microsc. 142, 259-276 (1986).</li>
<li>Blutke, A., Schneider, M. R., Wolf, E., Wanke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+hormone+%28GH%29-transgenic+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF1%29-deficient+mice+allow+dissociation+of+excess+GH+and+IGF1+effects+on+glomerular+and+tubular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Growth hormone (GH)-transgenic insulin-like growth factor 1 (IGF1)-deficient mice allow dissociation of excess GH and IGF1 effects on glomerular and tubular growth.</a> Physiol Rep. 4, e12709(2016).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Hermanns, W., Liebig, K., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembedding+immunohistochemical+demonstration+of+antigen+in+experimental+polyarthritis+using+plastic+embedded+whole+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Postembedding immunohistochemical demonstration of antigen in experimental polyarthritis using plastic embedded whole joints.</a> Histochemistry. 73, 439-446 (1981).</li>
<li>Böck, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aB%C3%B6ck%2C+P+%22Romeis+Mikroskopische+Technik%22">Romeis Mikroskopische Technik</a>. , Urban und Schwarzenberg. München, Wien, Baltimore. 17. Auflage 1-697 (1989).</li>
<li>Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuvarna%2C+KS+%22Bancroft%27s+theory+and+practice+of+histological+techniques%22">Bancroft's theory and practice of histological techniques</a>. Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone. 1-654 (2013).</li>
<li>Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+estimates+of+alveolar+number+and+size+and+capillary+length+and+surface+area+in+mice+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs.</a> Anat Rec (Hoboken). 292, 113-122 (2009).</li>
<li>Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://err.ersjournals.com/content/15/101/107">Sampling for stereology in lungs.</a> Eur Respir Rev. 15, 107-114 (2006).</li>
<li>Junatas, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereological+analysis+of+size+and+density+of+hepatocytes+in+the+porcine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Stereological analysis of size and density of hepatocytes in the porcine liver.</a> J Anat. 230, 575-588 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Generatie van biobank monstercollecties van varkens diermodellen vereist robuuste technieken en protocollen voor de bepaling van orgaan/weefsel volumes, de reproduceerbare generatie van vertegenwoordiger, redundante weefselsteekproeven geschikt voor een breed scala aan verschillende analysemethoden, en voor randomisatie van de oriëntatie van monster secties voor kwantitatieve stereological analyses. De in dit artikel beschreven methoden zijn aangepast aan de grootte van varkens organen en weefsels, en hebben ontwikkeld o...

Translationeel geneeskunde, varkens zijn steeds vaker voorkomende voor gebruik als groot dier1,2,3,4,5, als gevolg van verschillende voordelige overeenkomsten tussen de varkens modellen en menselijke anatomie en fysiologie, en de beschikbaarheid van gevestigde moleculaire biologische methoden toestaan voor generatie op maat, genetisch gemodificeerde varken modellen voor een breed scala van1,4van de voorwaarden van de ziekte.
Ten opzichte van knaagdier modellen, is het aantal dieren van een respectieve varken model dat kan worden voorzien voor experimenten op elk gewenst moment echter beperkt. Dit is te wijten aan de varkens generatie interval van ongeveer een jaar, en de financiële en tijdrovende inspanningen die nodig zijn voor de generatie van varkens modellen en de veehouderij. Daarom, individuele dieren van een varkens model, evenals de voorbeelden die kunnen worden gegenereerd op basis van deze varkens, zijn zeer waardevol, vooral als genetisch gemanipuleerde varkens modellen en/of lange termijn experimentele problemen (bijvoorbeeld, late complicaties van chronische ziekten) worden in leeftijd individuen2,6,7onderzocht.
In de loop van een studie, prestaties van aanvullende analyses die had niet gepland in de eerste opzet van de studie kan later blijken te worden betrokken, bijvoorbeeldnaar adres verschillende vragen die voortvloeien uit eerder ontdekt onverwachte bevindingen. Als geschikt monsters voor dergelijke aanvullende experimenten niet beschikbaar zijn, mogelijk onevenredig hoge kosten en tijdrovende uitgaven noodzakelijk voor het genereren van extra varkens en weefselmonsters worden. Als u wilt worden voorbereid dergelijke, generatie van biobank collecties van geconserveerde reservekopie monsters van de verschillende organen, weefsels of bio-vloeistoffen, kwantitatief als in kwalitatief opzicht geschikt zijn voor een breed scala van latere analyses, wordt beschouwd als een belangrijk 2,6,7te benaderen. Optimale voordelen uit een varkens diermodel voortvloeiende, de beschikbaarheid van voldoende biobank monsters biedt ook de unieke mogelijkheid voor het uitvoeren van een breed spectrum van verschillende analysemethoden op identieke monster materialen op het niveau van een multi-orgel in de precies dezelfde individuele dieren, bijvoorbeelddoor verdeling van de monsters aan wetenschappers van verschillende werkgroepen georganiseerd in een onderzoek netwerk2,6,7. De '' toekomstgerichte '' bemonsteringsstrategie in biobanking draagt bovendien ook bij aan een vermindering van het aantal dieren in een studie nodig. De voordelen van varkens model biobanking zijn onlangs aangetoond in een multi orgel, multiomics onderzoek, onderzoek van orgel cross talk in een genetisch gemanipuleerde varkens model van lange termijn diabetes mellitus, met behulp van specimens van de München MIDY varken Biobank 2.
Er zijn een aantal verplichte eisen biobank monsters in het algemeen voldoen moeten om de betrouwbaarheid en interpretability van de resultatenvan de later uitgevoerde analyses. De monsters moeten reproducibly worden gegenereerd, en ze moet voldoende representatief, dat wil zeggen, als gevolg van de interesse morfologische en moleculaire kenmerken van het weefsel/orgel de monsters werden genomen uit7. Om zijn geschikt voor een breed scala van soorten downstream analyse, moeten de monsters worden genomen in voldoende hoeveelheden en verwerkt volgens de eisen (met inbegrip van tijd- en temperatuurdisplays voorwaarden) van de verschillende analysemethoden, met inbegrip van beschrijvende histopathologische analyses, zoals cryohistology, paraffine en kunststof histologie, immunohistochemistry, in situ hybridisatie, ultrastructurele elektronen microscopische analyses en klinisch laboratorium diagnostische analyses, evenals als moleculaire analyses van DNA, RNA, eiwitten en metabolieten.
Als u wilt toestaan voor de beoordeling van een breed scala aan verschillende kwantitatieve morfologische parameters zoals cijfers, volumes, lengtes, of oppervlakten van verschillende weefsel structuren door kwantitatieve stereological analyses, gerandomiseerde sectie vliegtuigen van de histologische monsters van de respectieve organen/weefsels moeten worden voorbereid7,8,9,10,11. In kwantitatieve morfologische studies, de nauwkeurige bepaling van het totale volume van het weefsel, orgel of orgel compartiment, de monsters werden genomen uit (dat wil zeggen, de verwijzing ruimte) is van cruciaal belang7,9 , 12 om de absolute hoeveelheden van de betrokken parameters binnen de respectieve orgaan, weefsel of organisme te berekenen. Uiteindelijk heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de voorbereiding van de histologische secties te worden bepaald en in rekening13genomen. Daarom, kwantitatieve stereological analyses, met name van gearchiveerde monsters (vaste weefselsteekproeven ingesloten weefsel blokken, histologisch secties, etc.) uit eerdere studies zijn soms ernstig beperkt of zelfs onmogelijk12, met name indien volumetrie van de respectieve organen/weefsels is niet uitgevoerd, als geen passende bemonstering ontwerpen werden toegepast om te rechtvaardigen representatieve monsters, wanneer de aantallen en bedragen van de beschikbare afzonderlijke monsters ontoereikend zijn, of als de verwerking van de monsters is incompatibel met de raming van de kwantitatieve morfologische parameter (s) van belang. Vanwege de vele mogelijke factoren, de geschiktheid van archief-monster materialen voor analyses van afzonderlijke kwantitatieve morfologische parameters ondubbelzinnig kan niet worden beantwoord, maar hangt af van de zorgvuldige beoordeling van ieder individueel geval.
Dus, zoals de locatie, grootte, aantal, verwerking, trimmen richting en afdrukstand van monsters zullen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de latere analyses, deze factoren zijn van groot belang en moeten worden beschouwd in het experimentele ontwerp van een onderzoek. Met betrekking tot deze aspecten en de specificiteit van de varkens anatomie, uitgebreide, gedetailleerde, grootschalige bemonstering richtsnoeren aangepast aan varkens dierlijke modellen zijn onlangs vastgesteld, bieden een robuuste verwijzing naar gestandaardiseerde, reproduceerbare , en efficiënt genereren van redundante, adequaat verwerkt, kwalitatief hoogwaardige monsters van meer dan 50 verschillende varkens organen en weefsels6,7.
De methodologische beschrijvingen en de video-tutorial weergegeven in dit artikel bieden gedetailleerde, illustratieve, begrijpelijk, stap-by stap-instructies voor de praktische uitvoering van een verscheidenheid van technieken voor volumetrie, bemonstering van varkens weefsels en organen, en verwerking van weefselmonsters voor verschillende downstream analysemethoden. De aanbevolen technieken omvatten methoden voor bepaling van orgaan/weefsel volumes en dichtheden gebaseerd op de beginselen van Archimedes en Cavalieri9, met inbegrip van de bepaling van de afmetingen van driedimensionale krimp van weefsel gerelateerde aan de insluiten in verschillende insluiten media14 tijdens de verwerking voor histopathologisch onderzoek, toepassing van uitvoerbaar volume-gewogen systematische steekproeven nadert, verwerking van gesamplede weefsel specimens voor verschillende latere analyses7,,8,,9,15, generatie op passende wijze georiënteerd en verwerkt monsters voor potentiële kwantitatieve stereological analyses7,8, 9,10,11. Naast hun toepassing in varkens biobank projecten zijn de bewezen methoden over het algemeen geschikt voor alle studies kwantitatieve histo-morfologische eigenschappen van organen/weefsels te onderzoeken. Bovendien, systematische steekproeven ontwerpen zijn vooral gunstig voor generatie van representatieve monsters in experimenten moleculaire analysemethoden gebruiken voor het detecteren van overvloed wijzigingen van, bijvoorbeeld, RNAs, eiwitten of metabolieten in verschillende organen en weefsels.
De volgende paragrafen bieden een korte inleiding op deze methoden, terwijl hun praktische prestaties wordt beschreven in de sectie protocol.
Bepaling van orgaan/weefsel volumes Bepaling van orgel gewichten en volumes is belangrijk in verschillende experimentele instellingen, zoals deze factoren kunnen wijzen op veranderingen, potentieel aan experimenteel gerelateerde onderzocht factoren van belang. Het totale volume van een orgaan/weefsel is ook vaak nodig voor het berekenen van de absolute kwantitatieve parameters (bijvoorbeeld, het nummer van de cel totaal), van stereologically geschatte numerieke volume dichtheden (dat wil zeggen, het aantal cellen per volume-eenheid van weefsel)7,12. Afgezien van technieken met behulp van complexe technische apparatuur, zoals computer tomografie, zijn er in principe drie praktische methoden die gewoonlijk worden gebruikt om te bepalen van het absolute volume van een orgaan of weefsel. Het volume van een orgaan kan worden bepaald door de "directe volumetrische meting" volgens het beginsel van Archimedes, dat wil zeggen, het meten van de hoeveelheid water of zoutoplossing dakloos geraakt door de structuur als volledig ondergedompeld. Voor relatief grote varkens organen zijn deze benaderingen echter onpraktisch en gevoelig voor onnauwkeurigheid, aangezien ze zeer grote volumetrische/meten kolven vereist. Meer gemakshalve, het volume van een orgaan/weefsel kan worden berekend op basis van haar gewicht en dichtheid7,12,16, die efficiënt kan worden bepaald met behulp van de "methode van de onderdompeling"7,12 ,16 (protocol stap 1.1.). Orgaan/weefsel volumes kunnen ook worden geschat met behulp van volumetrie benaderingen gebaseerd op het "principe van Cavalieri" (1598-1647). In eenvoudige termen, het principe van Cavalieri stelt, als twee objecten zijn gesegmenteerd in vlakken evenwijdig aan een massaplaat, en de profielen van de secties door de twee objecten op overeenkomt gesneden afstanden van de massaplaat zijn dezelfde regio's, de twee objecten hetzelfde volume hebben. Dus, het volume van willekeurig gevormde objecten kan worden ingeschat als het product van hun sectie profiel gebieden in parallelle, even verre sectie vliegtuigen en de afstand tussen de vlakken van de sectie. Dit is begrijpelijk met de volgende analogie: overwegen twee stapels bestaande uit hetzelfde aantal identieke munten staan naast elkaar, een stapel met de munten ordelijke gestapeld bovenop elkaar opbrengst van een cilindrische vorm van de munt-stack, en de andere stapel van munten met uit het midden geplaatst munten (figuur 3A). Hoewel de vormen van zowel munt-stapels anders zijn, hun volumes zijn hetzelfde, sinds de gebieden van de munten op overeenkomstige niveaus van beide stapels (dat wil zeggen, het gebied van profielen van parallelle secties snijden door beide stapels van de munt in op gelijke afstand van de gemalen) identiek zijn. Schatting van de volumes van varkens organen en weefsels met behulp van de12,voor Cavalieri principe7,15 wordt beschreven in stap 1,2.
Bepaling van de omvang van weefsel krimp aan histologische insluiten gerelateerde In analyses van verschillende kwantitatieve morfologische parameters gemeten in histologische weefselsecties, heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking voor histologie weefsel te worden bepaald en in aanmerking genomen. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp variabele kan worden, en is afhankelijk van zowel op het weefsel, de verwerking en het insluiten middellange8,13,17,18,19. In het algemeen, insluiten-gerelateerde veranderingen van het volume van een sample van het weefsel (dat wil zeggen, meestal krimp) optreden in alle drie de dimensies van ruimte, en dus, is van invloed op alle dimensionale parameters geschat door kwantitatieve stereological analyses8 . Kortom, de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp, uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor (fS), kan worden geraamd zoals aangegeven in stap 1.3. en gebruikt voor correctie van de kwantitatieve morfologische parameters (krimp-gevoelig)14.
Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van organen/weefsels Voor vestiging van een biobank collectie van varkens orgel/weefselsteekproeven, hebben systematische steekproeven volume-gewogen benaderingen zoals beschreven in stap 2 bewezen praktische tijdbesparende en efficiënte technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multi purpose weefsel monsters7,8,9,15.
Generatie van isotroop uniforme Random secties en verticale uniforme Random secties voor kwantitatieve stereological analyses Biobank weefselsteekproeven moeten geschikt zijn voor een breed scala van verschillende kwantitatieve stereological analysemethoden voor schatting van een maximum van parameters die kon niet worden vastgesteld zonder een adequaat bereid exemplaar. Bijna alle kwantitatieve stereological parameters kunnen worden bepaald, met behulp van "isotrope (onafhankelijke) uniforme willekeurige (IUR) secties"8,9. In IUR secties, is de driedimensionale oriëntatie van het sectievlak van het weefsel monster gerandomiseerde. Dit kan worden bereikt door randomisatie van de positie van het weefsel monster ten opzichte van de positie van het sectievlak, zoals toegepast in de "Isector" methode11 (protocol stap 3.1), of door randomisatie van de oriëntatie van het sectievlak ten opzichte de weefsel monster, zoals in de "Oriënteringsapparaten" methode10 (protocol stap 3.2). In weefselmonsters, zoals huid of mucosa specimen weergeven een nature aanwezig, of gedefinieerde en goed herkenbaar verticale as, voorbereiding van de "verticale uniforme willekeurige (VUR) secties" (protocol stap 3.3.) gesegmenteerd strikt binnen het vlak van hun verticale as is de voordeligste8,20. Voor een volledige discours van de theoretische grondslagen van IUR/VUR bemonstering en een uitgebreide bespreking van potentiële downstream kwantitatieve stereological analyses, wordt de geïnteresseerde lezer verwezen naar de schoolboeken van kwantitatieve stereology in het leven Wetenschappen8,9.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Carl Roth GmbH, Germany</td><td>Agar (poeder), Cat.: 5210.3</td><td>Los ongeveer 1 g agar op in 10 ml koud water in een glazen of plastic beker, verwarm in magnetronoven op 700 W, kook de oplossing twee keer met krachtig roeren. Giet in mal terwijl het nog warm is en laat het stollen. Let op: draag beschermende veiligheidsbril en handschoenen bij het hanteren van hete vloeibare agar.</td></tr><tr><td>Calliper</td><td>Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany</td><td>Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902</td><td>Elke soort calliper (mechanisch of elektronisch) kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Gietblokjes (metaal)</td><td>Engelbrecht Medizin &amp; Labortechnik, Edermünde, Germany</td><td>Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b</td><td>Elk ander type metalen gietblokje dat gebruikt wordt voor paraffine-inbedding kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Sjablonen van kruisrasters (5mm - 6 cm)</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>Sjablonen van kruisrasters (5mm - 6 cm) worden gegeven in het aanvullende databestand van Albl et al.&nbsp; Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)</td></tr><tr><td>Sjablonen van gelijkhoekige en cosinus-gewogen cirkels</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>Sjablonen van gelijkhoekige en cosinus-gewogen cirkels worden gegeven in Nyengaard &amp; Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) en in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux’s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).</td></tr><tr><td>Klapklemmen (YIHAI binderclips, 15 mm en 19 mm)</td><td>Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China</td><td>Y10006 en Y10005</td><td>Elk ander type standaard kantoorklapklem kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Pincet (anatomisch)</td><td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811</td><td>Elk type anatomisch pincet kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Formaldehyde-oplossing 4%</td><td>SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany</td><td>Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005</td><td>Verdun tot 4% uit de geconcentreerde oplossing. Breng naar neutraal pH. Draag geschikte oog-, hand- en ademhalingsbescherming. Bewerk weefselmonsters die gefixeerd zijn in formaldehyde-oplossing onder een afzuigkap en draag beschermende veiligheidsbril en laboratoriumhandschoenen.</td></tr><tr><td>Millimeterpapier (voor kalibratie)</td><td>Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td><td>Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514</td><td>Elk type millimeterpapier kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Laboratoriumbekers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)</td><td>NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>Becherglas SIMAX&reg;, niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036</td><td>Elk type glazen- of plastic beker met een volume van 5 &ndash; 100 ml kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Laboratoriumweegschaal(en)</td><td>Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany</td><td>PM6000</td><td>Elke standaard laboratoriumweegschaal met meetbereiken tussen 0,1 mg tot ongeveer 20 g, respectievelijk tussen 100 mg tot ongeveer 500 g kan hiervoor worden gebruikt</td></tr><tr><td></td><td>Sartorius AG, Göttingen, Germany</td><td>BP61S</td><td></td></tr><tr><td>Microtoommessen</td><td>Engelbrecht Medizin &amp; Labortechnik, Edermünde, Germany</td><td>FEATHER Microtoom messen S35, Cat.:14700</td><td>Elk type microtoommessen voor eenmalig gebruik kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Morphometrie/planimetrie software/systeem</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>ImageJ</td><td>Downloaden van https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).</td></tr><tr><td>Zeiss-Kontron, Eching, Germany</td><td>VideoplanTM beeldanalyse systeem</td><td>Uit voorraad</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Nikon</td><td>D40</td><td>Elk type digitale fotocamera dat op een statief kan worden gemonteerd kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Kunststof transparanten</td><td>Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany</td><td>Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:&nbsp; 3562</td><td>Elk (laser)-printbaar kunststof transparant kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Willekeurige getallentabellen</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>Willekeurige getallentabellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd (met een gedefinieerd aantal willekeurige getallen en binnen gedefinieerde intervallen), met behulp van willekeurige getallengeneratoren, zoals: https://www.random.org/</td></tr><tr><td>Schermessen</td><td>Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>T5016</td><td>Elk type scheermes kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Liniaal</td><td>Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de</td><td>Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30</td><td>Elk type cm-mm-geschaalde liniaal kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Zoutoplossing (0,9%)</td><td>Carl Roth GmbH, Germany</td><td>Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1</td><td>Om 0,9% zoutoplossing te bereiden, lost u 9 g NaCl op in 1000 ml gedistilleerd water bij 20&deg;C.</td></tr><tr><td>Mesjes</td><td>Aesculap AG &amp; Co KG, Tuttlingen, Germany</td><td>BRAUN Surgical mesjes N&deg;22</td><td>Elk type mesjes kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Scanner</td><td>Hewlett-Packard</td><td>hp scanjet 7400c</td><td>Elk type standaard kantoorscanner die kan scannen met resoluties van 150-600 dpi kan hiervoor worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Snijapparaten</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>Voorbeelden van zelfgebouwde snijapparaten zijn te vinden in Knust, et al. Anatomical record

bemonsteringsstrategie en verwerking van biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

Translationeel medisch onderzoek, varkens modellen steeds populairder geworden. Gezien de hoge waarde van individuele dieren, met name van genetisch gemodificeerde varken modellen, en de vaak beperkte aantal beschikbare dieren van deze modellen, oprichting van (biobank) collecties van voldoende verwerkte weefselsteekproeven geschikt voor een breed spectrum van latere analyses methodes, inclusief analyses niet opgegeven op de tijdstip van monsterneming, vertegenwoordigen zinvolle benaderingen ten volle te profiteren van de translationeel waarde van het model. Met betrekking tot de eigenaardigheden van varkens anatomie, zijn onlangs uitgebreide richtsnoeren opgesteld voor gestandaardiseerde generatie representatief, kwalitatief hoogwaardige monsters van andere varkens organen en weefsels. Deze richtsnoeren zijn essentiële voorwaarden voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en hun vergelijkbaarheid tussen de verschillende studies en onderzoekers. De opname van basisgegevens, zoals orgel gewichten en volumes, de bepaling van de locaties van de bemonstering en de nummers van weefselmonsters moeten worden gegenereerd, evenals hun geaardheid, grootte, verwerking en trimmen richtingen, zijn relevante factoren het bepalen van de dan en de bruikbaarheid van het model voor moleculaire, kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Hier, een illustratieve, praktische, stapsgewijze demonstratie van de belangrijkste technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multifunctionele biobank specimen van varkens weefsels wordt gepresenteerd. De hier beschreven methoden bepaling te omvatten van orgaan/weefsel volumes en dichtheden, de toepassing van een systematische steekproeven volume-gewogen procedure voor parenchymal organen door punt-tellen, bepaling van de omvang van weefsel krimp aan de histologische inbedding van monsters en generatie van willekeurig georiënteerde monsters voor kwantitatieve stereological analyses, zoals isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties die zijn gegenereerd door de "Oriënteringsapparaten" en "Isector" methoden en verticale uniform gerelateerde willekeurige (VUR) secties.

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel
Figuur 12A -B toont de representatieve bepaling van de dichtheid en het volume van een varkens nier met behulp van de onderdompeling techniek beschreven in stap 1.1 (Figuur 1, Figuur 2). Meer representatieve resultaten van metingen van de dichtheid...

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Deze video toont twee belangrijke technieken voor het bemonsteren en verwerken van varkensweefselspecimens uit biobanken. De onderdompeling-techniek schat betrouwbaar het totale orgaan- en weefselvolume en de oriëntatie-techniek genereert willekeurige isotrope weefselsecties voor een onbevooroordeelde schatting van kwantitatieve morfologische parameters. Het grote voordeel van de onderdompeling-techniek voor weefseldichtheidsbepaling is dat deze op elk type weefsel kan worden toegepast en dat deze betrouwbare resultaten oplevert voor zowel kleine als grote monsters.De voordelen van de oriëntatie-techniek zijn dat deze zeer efficiënt is en ook werkt met grote weefselmonsters. Om de volumetrie voor een groot orgaan te beginnen, snijdt u een passend gedimensioneerd stuk weefsel uit het orgaan. Veeg het monster voorzichtig schoon met een papieren handdoek om overtollig bloed en weefselvocht te verwijderen.Weeg vervolgens het monster op een nauwkeurige schaal en noteer het gewicht van het monster. Voeg 0,9%zoutoplossing toe aan een beker van geschikte grootte. Vul de beker niet helemaal om overstroming tijdens het weefselonderdompelen te voorkomen.Plaats de beker op de weegschaal en dom

sampling-strategies-processing-biobank-tissue-samples-from-porcine

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit is een protocol voor de optimale weefsel voorbereiding voor genomische, transcriptomische en proteomische analyses van vleermuizen die in het wild zijn gevangen. Het omvat de protocollen voor de inname van vleermuis en dissectie, weefsel conservering, en celculturing van vleermuis weefsel.

Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur

In dit protocol werden varkensspecifieke primers ontworpen, werden plasmidenhoudende varkensspecifieke DNA-fragmenten geconstrueerd en werden standaardkrommen voor kwantificering vastgesteld. Met behulp van soortspecifieke primers werd cpsDNA door qPCR gekwantificeerd in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en varkens-tot-aap slagaderpatch transplantatiemodellen.

Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van een Xenotransplantatie Model

Dit protocol beschrijft de techniek voor verwijdering van het varkensbrein in zijn geheel en dissectie van verschillende hersengebieden die vaak in de neurowetenschappen worden bestudeerd.

Extractie en dissectie van het gedomesticeerde varkensbrein

In het volgende werk beschrijven we de opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de oprichting van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker.

Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

Karakterisering van bloeduitgroei endotheelcellen (BOEC) uit perifeer bloed van varkens

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Dit protocol beschrijft een methode om het verzamelen van monsters van radicale prostatectomiemonsters te vergemakkelijken. Het doel is om weefselmonsters van de monsters in kaart te brengen, te karakteriseren en micro-macro te ontleden op basis van anatomopathologische criteria voordat ze in een biobank worden opgeslagen.

Verbetering van de betrouwbaarheid van biobanking van prostaattumoren met verbeterde bemonsteringstechniek en histologische karakterisering

Dit protocol beschrijft het uitvoeren van een craniectomie met behulp van een pneumatische boor met hoge snelheid op een 3 maanden oud Deens Landras-varken. De toegang wordt gemaakt door het voorhoofdsbeen en onthult de ventrale dura mater en de onderliggende hersenhelften. Deze procedure geeft toegang tot een groot deel van de varkenshersenen.

Toegang tot het varkensbrein via high-speed pneumatische boorcraniectomie

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

In de volgende paragrafen beschrijven we procedures voor de bereiding van alginaat die voor toepassing in biomedische toepassingen. We specifiek illustreren een techniek voor het maken van meerdere lagen alginaat microsferen voor het tweeledige doel van de cel en eiwitten inkapseling als een potentiële behandeling voor diabetes type 1.

Genereren van alginaat Microspheres voor biomedische toepassingen

Leer de onderdompelings- en orientatortechniek voor biobankvarkensweefsel om betrouwbare volumetrie en onbevooroordeelde morfologische analyse uit te voeren. Deze methoden verbeteren de kwaliteit van weefselmonsters in neurowetenschappelijk onderzoek.

Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Meer video's verkennen