Name: Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Leer lymfocyten isoleren uit Peyer's patches, mesenteriale lymfeklieren en lamina propria van muizen. Deze methode levert zuivere, levensvatbare cellen op voor mucosale immunologieonderzoek naar infecties en ontstekingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

B.S.S. wordt ondersteund door NIH grant (R01 AI076457) en fondsen geboden door Stony Brook University. Z.Q. wordt ondersteund door de NIH verlenen (K12 GM102778).

Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het National Institute of Health en goedgekeurd door de Stony Brook University institutionele Animal Care en gebruik Comité.
Opmerking: Zorg ervoor dat alle goedkeuringen zijn verleend voordat u procedures uitvoert.
1. oplossing voorbereiding
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-glutamine, penicilline/streptomycine en gentamycine), 100 ×
	<ol>
<li>Meng 59.6 g HEPES (500 mM definitieve), 14.6 g L-glutamine (200 mM in finale), 1 × 106 U penicilline (2.000 U/mL definitief), 1 g streptomycine (2 mg/mL final) en 2,5 mg gentamicine (5 µg/mL definitief). Toevoegen van RPMI 1640 tot 500 mL. Breng pH 7.5 met NaOH (vóór aanpassing, de buffer is geel/oranje met een pH rond 6.0). Filter steriliseren met behulp van een 0,45 µm filter. Aliquot en winkel bij-20 ° C voor maximaal 1 jaar of bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HEPES-bicarbonaat buffer, 10 x
	<ol>
<li>
Meng 23.8 g HEPES (100 mM definitieve), 21 g NaHCO3 (250 mM definitieve) en voeg water tot 1000 mL. Breng pH op 7,2 met HCl. Filter steriliseren met behulp van een filter 0,45 micrometer. Bewaren bij kamertemperatuur. De pH verandert na verloop van tijd. Breng opnieuw de pH regelmatig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oogsten van media (~ 1 fles/2 muizen)
	<ol>
<li>500 mL RPMI 1640, toevoegt 25 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (5% laatste) en 5 mL 100 × HGPG. Opslaan van maximaal 6 maanden bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dithioerythritol (DTE) oplossing (40 mL/kleine darm)
	<ol>
<li>Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bicarbonaat buffer en 50 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (10% laatste). Voeg 350 mL H2O en 15,4-inch mg dithioerythritol/100 mL (1 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (50 mL/kleine darm)
	<ol>
<li>Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis met 5 mL 100 × HGPG. Toevoegen van 445 mL H2O. toevoegen 260 µL 0.5 M EDTA/100 mL (1.3 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collagenase oplossing (30 mL/LP)
	<ol>
<li>Tot 500 mL RPMI, voeg 50 mL FBS (10% FBS def.), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM definitieve) en 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM definitieve). Toevoegen van collagenase, Type I (100 U/mL def.). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dichtheid kleurovergang (DG) oplossingen
	<ol>
<li>1 × DG stockoplossing bereiden door het mengen van 90 mL DG stockoplossing (Zie de Tabel van materialen) met 10 mL 10 × PBS. Steriele bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>Bereid 44% DG oplossing (8 mL/IEL, 8 mL/LP) door het mengen van 44 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 56 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.</li>
		<li>67% DG oplossing (5 mL/IEL, 5 mL/LP) voor te bereiden door het mengen van 67 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 33 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolatie van de mesenterische lymfklieren, darmen, en Peyer van Patches
<ol><li>De muis met behulp van kooldioxide versuffing en secundaire cervicale dislocatie euthanaseren. Plaats de muis op de rug en spray met 70% ethanol. Schaar gebruik te maken van een incisie middellijn en open de huid en de buikwand de peritoneale holte bloot te stellen.</li>
	<li>Zoek het caecum en gebruik van pincet voorzichtig het caecum om neer te trekken. Pincet gebruiken om de dunne darm zorgvuldig naar het recht, bloot de hele keten van MLN, die is afgestemd op de dikke darm. Opmerking: De kaart van de mesenterische lymfeklieren ketting en lymfatische drainage van de darmen voorheen afgebeeld13.</li>
	<li>Identificeren van het knooppunt van de bodem in de keten, dichtst gelegen aan de blindedarm. Één set pincet gebruiken om te begrijpen het mesenterium/vet eromheen en het zachtjes verwijdert de MLN keten onder naar de top van het vet uit rond de lymfeklier met een andere set van verlostang pincet.</li>
	<li>Leg de ketting MLN op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media. Verwijder mesenterium/vet door rollen van de keten op de toren van papier en trekken het vet af met twee sets van de verlostang. Plaats de MLN in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie. Opmerking: (i) rechtstreeks te worden aangeraakt van de knooppunten wordt afgeraden. In plaats daarvan begrijpen het mesenterium/vet om hen heen. (ii) het is cruciaal voor het verwijderen van zo veel mesenterium/vet mogelijk ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen.</li>
	<li>Gesneden van de dunne darm onder de pyloric sphincter en boven de blindedarm met behulp van schaar. Trek de darm langzaam uit het ileum aan twaalfvingerige darm met behulp van een set van verlostang tijdens het verwijderen van het bijgevoegde mesenterium/vet met behulp van een andere set van verlostang.</li>
	<li>Plaats de darm op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media en plagen van alle resterende mesenterium/vet af met twee sets van de verlostang. Opmerking: (i) moet zoveel mesenterium/vet verwijderen als mogelijk is voor optimale cel opbrengst en levensvatbaarheid. (ii) houden de darm bevochtigd in dit en de volgende stappen door oogst media regelmatig toe te passen.</li>
	<li>Verzamelen van Peyer patches door ze te verwijderen uit de darm met gebogen schaar. Gebruik een ontleden scope of Vergrootglas indien nodig (beginners); de meeste Peyer patches moeten worden weergegeven voor de getrainde oog. 5-11 (typische) Peyer patches verzamelen uit de dunne darm. Plaats Peyer patches in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie. Opmerking: Peyer de patches zijn kleine, voornamelijk ronde uitstulpingen in de buitenste darmwand tegenover de lijn van mesenterium bijlage.</li>
	<li>Gebruik de platte kant van pincet en zachtjes dia van twaalfvingerige darm naar ileum tot uitzetting van fecale inhoud en slijm. Herhaal deze stappen eenmaal te verwijderen van de meeste van het slijm. Opmerking: Onvolledige verwijdering van slijm kan verlagen van de levensvatbaarheid van de cellen en opbrengst. Toch moet u Schuif de darm voorzichtig om te voorkomen dat strippen villi of beschadiging van het membraan van de kelder.</li>
	<li>Fijne schaar gebruiken met een botte uiteinde op één punt, het botte uiteinde invoegen in de darm en opengesneden de darm lengterichting van de twaalfvingerige darm aan ileum. Lateraal de geopende darm in ~ 2 cm stukken gesneden. Leg de intestinale stukjes in een conische buis van 50 mL met 25 mL koude oogst media voor latere stappen van de isolatie. Opmerking: De schaar bevochtigd met media houden zal hen helpen glijden moeiteloos door de darm.</li>
</ol>3. isolatie van lymfocyten van de inductieve Sites
<ol><li>Isoleren lymfocyten van MLN door zachtjes distantiëren door een zeef van 70-µm cel met behulp van de zuiger van een 3-mL spuit. Wassen cel zeef met 5 mL koude oogst media.</li>
	<li>Pellet MLN-cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw. Opmerking: rode bloedcellen lysis-buffermengsel kan worden gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen, als het bloeden opgetreden tijdens het verwijderen.</li>
	<li>Isoleren lymfocyten van Peyer van patches door Peyer van patches in een conische buis van 15 mL, 5 mL voorverwarmde collagenase oplossing bij 37 ° C en 220 rpm voor 30 min met broeden.</li>
	<li>Vortex voor 15 s bij maximale instelling en filter weefsel en de bovendrijvende substantie in een conische buis van 50 mL verteerd door een zeef van de cel 70-µm. Zachtjes distantiëren van de resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL en wassen van de cel zeef met 5 mL koude oogst media.</li>
	<li>Pellet Peyer de patch cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw. Opmerking: Peyer de patches isolatie wellicht sommige contaminerende lamina propria lymfocyten en geest lymfocyten.</li>
</ol>4. isolatie van geest lymfocyten uit de dunne darm
<ol><li>De stukken van dunne darm driemaal met 25 mL koude oogst media door de buis 10 keer omkeren, laten de intestinale stukken regelen en gieten uit het supernatant wassen. Opmerking: Weefsel stukken moeten gemakkelijk regelen naar de onderkant van de buis. Als dat niet het geval is, is een indicatie dat teveel mesenterium/vet verbonden blijft, of ze geassocieerd met een luchtbel worden.</li>
	<li>Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en overbrengen in een 50 mL gesiliconiseerd conische kolf met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende substantie in een nieuwe 50-mL conische buis door een 70-µm cel zeef voorzichtig om te houden van de stukjes weefsel in de originele buis. Gooi niet het supernatant; de bovendrijvende vloeistof bevat geest lymfocyten. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL koude oogst media en op te slaan op het ijs.</li>
	<li>Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en breng terug naar de 50 mL gesiliconiseerd erlenmeyer met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL. Opmerking: DTE is een reductor die geest lymfocyten verrijkt.</li>
	<li>Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende vloeistof door een zeef van 70-µm cel in de vorige buis met cellen van het supernatans van de eerste behandeling van de DTE (uit stap 4.3). Opmerking: De resterende intestinale stukken worden gebruikt voor het isoleren van lymfocyten van de lamina propria. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de epitheliale cellen aanwezig zijn en de kelder membraan intact is.</li>
	<li>Pellet cellen door centrifugering van het supernatant bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van 44% DG-oplossing bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van RT 67% DG-oplossing. Centrifugeer bij 1600 × g gedurende 20 min op RT zonder gebruik te maken van de rem. Opmerking: Buizen kunnen worden voorbehandeld met boviene serum om te voorkomen dat cellen kleven aan de muren van de buis.</li>
	<li>Merk op dat levensvatbare cellen een band (buffy coat) op het raakvlak van 44 tot 67 vormen %, dode cellen en sommige epitheliale cellen in een mucoid film aan de bovenkant van het verloop zijn en de rode bloedcellen in de pellet zijn. Verwijder de bovenste laag van de kleurovergang binnen ~ 2 cm van de interface van de door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur de buffy coat op het raakvlak van de oogst en hen overbrengen naar een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.</li>
	<li>Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.</li>
</ol>5. isolatie van Lamina Propria lymfocyten uit de dunne darm
<ol><li>Epitheliale cellen verwijderen uit het intestinale weefsel stukken door 25 mL EDTA-oplossing voorverwarmde toe te voegen aan de kolf, met de resterende intestinale stuks. Roer kolf bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 30 min. gebruik een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en zorgvuldig Verwijder het supernatant terwijl intestinale stukken binnen de kolf. Opmerking: (i) EDTA is een calcium-complexvormer die richt zich op calcium-afhankelijke kruispunten en bevordert het losmaken van intestinale epitheliale cellen. (ii) het supernatant moet bewolkt en kan worden gebruikt voor het isoleren van de IEC als hun collectie is gewenst.</li>
	<li>Herhaal stap 5.1. Opmerking: Het supernatant moet minder bewolkt na deze incubatie. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat intestinale epitheliale cellen zijn verwijderd en de kelder membraan intact is. Een monster van het supernatant kan ook worden geëvalueerd door een stroom cytometry om te bevestigen dat leukocyten (CD45+ cellen) afwezig zijn.</li>
	<li>Voeg 50 mL RT oogst media aan op de maatkolf. Roer kort met een magneet. Laat intestinale stukken regelen en zorgvuldig Verwijder het supernatant. Opmerking: Deze stap zorgt u ervoor de verwijdering van EDTA vóór collagenase spijsvertering zoals EDTA collagenase inactiveert door chelaat de calcium die essentieel zijn voor collagenase functie.</li>
	<li>Voeg 30 mL voorverwarmde collagenase oplossing in de kolf en roer intestinale stukken bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 45 min.</li>
	<li>Verteerd weefsel en supernatant overbrengen naar een conische buis van 50 mL door filteren door middel van een 70-µm cel zeef. Zachtjes distantiëren resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL aan beslag door de filter. Was het filter met 10 mL koude oogst media.</li>
	<li>Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van omgevingstemperatuur 44% DG-oplossing.</li>
	<li>Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van omgevingstemperatuur 67% DG-oplossing. Centrifugeer het verlopen bij kamertemperatuur en 1600 × g gedurende 20 minuten met geen rem.</li>
	<li>Verwijder de vetlaag bovenop door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur te oogsten van de buffy coat op de interface en de overdracht aan een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.</li>
	<li>Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.</li>
</ol>

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).</li>
<li>Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminology%3A+nomenclature+of+mucosa-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue.</a> Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).</li>
<li>Lefrancois, L., Lycke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+small+intestinal+intraepithelial+lymphocytes%2C+Peyer%27s+patch%2C+and+lamina+propria+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).</li>
<li>Sheridan, B. S., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+lymphocytes+from+small+intestine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Couter, C. J., Surana, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Flow+Cytometric+Characterization+of+Murine+Small+Intestinal+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Koscso, B., Bogunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+Purification+of+Mouse+Intestinal+Dendritic+Cell+and+Macrophage+Subsets+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).</li>
<li>Goodman, T., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+gamma-delta+T-cell+receptor+on+intestinal+CD8%2B+intraepithelial+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes.</a> Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).</li>
<li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2+integrins+and+ICAM-1+are+involved+in+establishment+of+the+intestinal+mucosal+T+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment.</a> Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).</li>
<li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+exhibit+multifunctional+and+protective+memory+in+intestinal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues.</a> Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).</li>
<li>Sheridan, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+infection+drives+a+distinct+population+of+intestinal+resident+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+with+enhanced+protective+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function.</a> Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).</li>
<li>Romagnoli, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+distinct+long-lived+memory+CD4+T+cells+in+intestinal+tissues+after+oral+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).</li>
<li>Houston, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lymph+nodes+draining+the+small+intestine+and+colon+are+anatomically+separate+and+immunologically+distinct%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct.</a> Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).</li>
<li>Lorenz, R. G., Newberry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+lymphoid+follicles+can+function+as+sites+for+induction+of+mucosal+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+migration+of+CD8+T+cells+in+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa.</a> J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).</li>
<li>Huleatt, J. W., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-driven+induction+of+CD11c+on+intestinal+intraepithelial+lymphocytes+and+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo.</a> J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).</li>
<li>Van Damme, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+agents+and+enzymes+used+for+the+extraction+of+gut+lymphocytes+influence+flow+cytometric+detection+of+T+cell+surface+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers.</a> J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van lymfocyten van de intestinale mucosa inductieve (MLN en PP) en effector (LP en IEL compartiment) sites. Het protocol is ontwikkeld om het evenwicht van de input (keer) en output (levensvatbaarheid en rendement) naar maximalisering van productiviteit en resultaten. Het protocol zorgt er ook voor minimale compartimentaire kruisbesmetting tussen LP en IEL compartimenten.
Verschillende protocollen voor de isolatie van immuun celle...

Het maag-darmkanaal (GI) heeft vele plooien en uitsteeksels die vertegenwoordigt de grootste interface scheiden van het interne lichaam en de externe omgeving. De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het GI-darmkanaal. Het is voortdurend blootgesteld aan dieet antigenen, commensale bacteriën en pathogene microben. Zo moet het verdraagzaam aan voedsel antigenen en commensale bacteriën blijven met behoud van het vermogen om snel genereren een effectieve immuunrespons op enteropathogenic microben1. De intestinale immuunsysteem kan anatomisch worden onderverdeeld in inductieve sites, waar naïef lymfocyten worden geactiveerd door antigeen presentatie van cellen dragen antigenen van de intestinale mucosa, en effector, waar de geactiveerde lymfocyten specifieke uitoefenen Effector functies2. De inductieve sites omvatten de georganiseerde lymfoïde structuur van Peyer van patches (PP) die enquêtes de intestinale lumen rechtstreeks via het optreden van gespecialiseerde cellen van de M en de regionale zuig mesenterische lymfklieren (MILJ.). De effector sites bestaan uit de lamina propria (LP), oftewel het bindweefsel onder de kelder-membraan en het intestinaal epitheel, een eencellige laag gelegen boven de kelder membraan dat geest lymfocyten (IEL) bevat. Lymfocyten zijn belangrijke spelers van adaptieve immuniteit die bemiddelen bescherming tegen infecties en kanker en kunnen ook bijdragen aan Immunopathologie in ontstekingsziekten. Het is belangrijk en zeer relevant voor de studie van lymfocyten in deze verschillende anatomische mucosal compartimenten beter begrijpen hun inductie en effector functies.
Een relatief eenvoudige en uniforme protocol voor de isolatie van lymfocyten van deze compartimenten is nodig omdat het aantal onderzoekers het verkennen van immuun gebeurtenissen die zich in de darm zijn versnellen. Verschillende onderzoeksgroepen hebben gepubliceerd protocollen die delen van verschillende soortgelijke processen voor het isoleren van immuuncellen van de muis kleine intestinale compartimenten3,4,5,6,7 . Er zijn echter verschillende technische onderling verschillen afhankelijk van de focus van het individuele protocol. Bijvoorbeeld, met de focus op het isoleren van immuuncellen van de LP, onderzoekt één protocol de impact van verschillende enzymatische spijsvertering op de levensvatbaarheid van de cellen, cel-oppervlakte marker expressie en de samenstelling van geïsoleerde immuuncellen5. Een ander protocol wijst op een snelle en reproduceerbare methode voor isolatie van lymfocyten zonder dichtheid centrifugeren6. Tot slot, specifieke protocollen bestaan ook met het oog op het isoleren van mononucleaire fagocyten uit weefsel van de verschillende lagen van de dunne darm7. Hier, wordt een zeer reproduceerbaar protocol waarmee sequentiële Isolatievan lymfocyt populaties van de MLN, PP, LP en IEL compartiment van de dunne darm gepresenteerd.
Wij focussen op het isoleren van hoogst gezuiverde populaties van de LP en IEL compartimenten, die grotendeels vrij is van contaminanten in andere intestinale compartimenten. Dit gebruikte protocol produceert een hoog rendement van maximaal zuiver en levensvatbare lymfocyten binnen acceptabele tijd beperkingen4,8,9,10,11,12. Dit protocol zorgt er ook voor de isolatie van lymfocyten van de LP en IEL compartiment met minimale compartimentaire kruisbesmetting, waardoor een bonafide mogelijkheid om te studeren van lymfocyten in deze afzonderlijke compartimenten. De geïsoleerde lymfocyten kunnen worden onderworpen aan verdere manipulaties zoals flow cytometrische analyse of functionele analyse. Dit protocol is met succes toegepast, tot de isolering van lymfocyten uit de muis dunne darm en dikke darm tijdens bacteriële infecties zoals Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumen Yersinia pseudotuberculosis infecties en inflammatoire aandoeningen zoals chemische - en pathogen-geïnduceerde colitis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te isoleren van de ingeboren immune cellen zoals dendritische cellen, macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten van de muis dunne darm en dikke darm.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G3126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>10x Hanks' gebalanceerde zout oplossing</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H4641-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA, pH 8.0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-aldrich</td><td>21108-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>DG-gradiënt stockoplossing (Percoll)&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcel lysis buffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>70-&micro;m celstrainer&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropyleen Ronde Bodembuis</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer kolf&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>26500R-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Magneetschudden</td><td>Thermo Fisher</td><td>50094596</td><td></td></tr><tr><td>Roerbalk</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-148</td><td></td></tr></tbody></table>

isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het maag-darmkanaal door het genereren van tolerant reacties op dieet antigenen en commensale bacteriën terwijl montage effectieve immuun reacties op enteropathogenic microben. Bovendien is het duidelijk dat lokale intestinale immuniteit een diepgaande invloed op immuniteit van verre en systemische heeft geworden. Daarom is het belangrijk om te bestuderen hoe een intestinale immuunrespons wordt geïnduceerd en wat de immunologische uitkomst van de reactie is. Hier, een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van dunne darm inductieve sites zoals de gut-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren en effector sites zoals de lamina propria wordt beschreven en de intestinale epitheel. Deze techniek zorgt voor isolatie van een groot aantal lymfocyten van kleine intestinale weefsels met optimale zuiverheid en levensvatbaarheid en minimale compartimentaire kruisbesmetting binnen acceptabele tijdsbeperkingen. De technische mogelijkheden om te isoleren van lymfocyten en andere immune cellen van intestinale weefsels kan het begrip van immuunresponsen gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten.

Een schematische voorstelling van het protocol wordt afgebeeld (Figuur 1). Lymfocyten binnen de intestinale mucosa inductieve en effector sites zijn duidelijk georganiseerd. Peyer de patches (PP) en de mesenterische lymfklieren (MILJ.) bevatten lymfocyten in overzichtelijke T-cel-ruimtes en B-cel follikels, terwijl het intestinaal epitheel bevat lymfocyten die meer diffuus verspreid zijn. De lamina propria (LP) bevat zowel diffuus gedistribueerde lymfocyten e...

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Het algemene doel van dit protocol is om lymfocyten te isoleren van intestinale inductieve locaties, inclusief Peyer's patches en mesenteriale lymfeklieren en effectorlocaties, inclusief lamina propria en epitheel. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van mucosale immunologie te beantwoorden, zoals het begrijpen van de immuunresponsen op gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van hoog gezuiverde en levensvatbare lymfocyten uit verschillende compartimenten van de dunne darm verzekert met minimale kruisbevuiling tussen compartimenten.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het een uitdaging is om mesenterische lymfeklieren en Peyer's patches te identificeren en isoleren en om snelheid en precisie in evenwicht te brengen voor optimale opbrengsten. Om het protocol te beginnen, plaatst u een eerder verdoofde muis op zijn rug en besproeit deze met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een middenlijnsnede te maken en open de huid en buikwand om de buikholte bloot te leggen.Loceer vervolgens het blinddarm en gebruik een pincet om het blinddarm

isolating-lymphocytes-from-the-mouse-small-intestinal-immune-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Isolatie van lymfocyten met behulp van de Miltenyi MAC-kit is een betrouwbare manier om cellen van hele lymfeweefsel homogenaten te zuiveren. Cellen gezuiverd met behulp van de Miltenyi systeem zijn meestal ≥ 96% zuiver. Hier tonen we de stappen die zijn genomen om CD4 + T-cellen, een van de vele kits worden aangeboden door Miltenyi isoleren.

Isolatie van CD4 + T-cellen van de muis lymfeknopen Met behulp van Miltenyi MACS Zuivering

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer's patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.

Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Er is een groeiende interesse in de kwantitatieve karakterisering van intestinale lymfocyten vanwege de toenemende erkenning dat deze cellen een cruciale rol spelen bij een verscheidenheid aan intestinale en systemische ziekten. In dit protocol beschrijven we hoe je enkele celpopulaties kunt isoleren uit verschillende compartimenten van de dunne darm voor daaropvolgende flowcytometrische karakterisering.

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

Lymfocyten zijn de belangrijkste spelers in adaptieve immuunresponsen. Hier presenteren we een protocol voor de zuivering van lymfocyten om de fysiologische functies van de gewenste moleculen bij lymfocytenactivatie in vitro en in vivo te bepalen. De beschreven experimentele procedures zijn geschikt voor het vergelijken van functionele capaciteiten tussen controle- en genetisch gemodificeerde lymfocyten.

Isolatie en Activering van Muizen lymfocyten

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

Leer lymfocyten isoleren uit Peyer's patches, mesenteriale lymfeklieren en lamina propria van muizen. Deze methode levert zuivere, levensvatbare cellen op voor mucosale immunologieonderzoek naar infecties en ontstekingen.

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Meer video's verkennen