Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Het algemene doel van dit protocol is om lymfocyten te isoleren van intestinale inductieve locaties, inclusief Peyer's patches en mesenteriale lymfeklieren en effectorlocaties, inclusief lamina propria en epitheel. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van mucosale immunologie te beantwoorden, zoals het begrijpen van de immuunresponsen op gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van hoog gezuiverde en levensvatbare lymfocyten uit verschillende compartimenten van de dunne darm verzekert met minimale kruisbevuiling tussen compartimenten.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het een uitdaging is om mesenterische lymfeklieren en Peyer's patches te identificeren en isoleren en om snelheid en precisie in evenwicht te brengen voor optimale opbrengsten. Om het protocol te beginnen, plaatst u een eerder verdoofde muis op zijn rug en besproeit deze met 70% ethanol. Gebruik een schaar om een middenlijnsnede te maken en open de huid en buikwand om de buikholte bloot te leggen.

Loceer vervolgens het blinddarm en gebruik een pincet om het blinddarm voorzichtig naar beneden te trekken. Gebruik een pincet om voorzichtig de dunne darm naar rechts te verplaatsen en de hele mesenterische lymfeklieren of MLN-keten bloot te leggen, die is uitgelijnd met de dikke darm. Identificeer de onderste knoop in de ketting die het dichtst bij het blinddarm ligt.

Gebruik één set pincetten om het mesenterisch vet rond deze te grijpen en beweeg voorzichtig de MLN-keten van onder naar boven door het vet rond de lymfeknoop met een andere set pincetten te knijpen. Bevochtig vervolgens een handdoek met oogstmedium en leg de MLN-keten op de papieren handdoek. Verwijder het mesenterisch vet door de ketting op de papieren handdoek te rollen en het vet eraf te trekken met twee sets pincetten.

Plaats de MLN in koud oogstmedium voor latere isolatie stappen. Snijd met een schaar de dunne darm onder de pylorussfincter en boven het blinddarm. Trek de darm langzaam uit van ileum naar duodenum met behulp van een set pincetten terwijl u het aangehechte mesenterisch vet verwijdert met een andere set pincetten.

Plaats de darm op een papieren handdoek bevochtigd met oogstmedium en probeer eventueel aanwezig mesenterisch vet eraf te scheuren met twee sets pincetten. Houd de darm gedurende deze stappen vochtig door periodiek oogstmedium aan te brengen. Verzamel Peyer's patches door ze met gebogen schaar uit de darm te verwijderen.

Verzamel 5-11 Peyer's patches uit de dunne darm. Plaats de Peyer's patches in koud oogstmedium voor latere isolatie stappen. Gebruik de platte kant van de pincetten en glijd voorzichtig vanaf het duodenum naar het ileum om fecale inhoud en slijm te verdrijven.

Herhaal deze stap eenmaal om het grootste deel van het slijm te verwijderen. Gebruik een fijne schaar met een stompe punt op één punt, steek het stompe uiteinde in de darm en snijd de darm open van duodenum naar ileum. Snijd de geopende darm lateraal in stukken van twee centimeter.

Plaats de darmstukken in een conische buis van 50 milliliter met 25 milliliter koud oogstmedium voor latere isolatie stappen. Isoleer lymfocyten uit de MLN door ze voorzichtig te dissociëren door een cell strainer van 70 micrometer te gebruiken met de plunjer van een spuit van drie milliliter. Spoel de cell strainer af met vijf milliliter koud oogstmedium.

Bereid de MLN-cellen voor door ze te centrifugeren bij 400 keer de zwaartekracht gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Spuit vervolgens de cellen opnieuw op in één milliliter koud oogstmedium. Spoel de stukken dunne darm drie keer met 25 milliliter koud oogstmedium door de buis 10 keer om te draaien.

Laat de darmstukken bezinken en giet het supernatant af. Voeg vervolgens 20 milliliter voorverwarmde dithioerythritol of DTE-oplossing toe aan de conische buis van 50 milliliter met darmstukken en breng de inhoud over naar een silicóniseerde Erlenmeyer kolf van 50 milliliter met een roerstaaf. Gebruik een grote magneet aan de buitenkant van de kolf om de roerstaaf vast te houden en breng het weefsel en de oplossing terug over naar de conische buis van 50 milliliter.

Vervolgens de buis maximaal 10 seconden schudden. Breng het supernatant over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter door een cell strainer van 70 micrometer, waarbij u voorzichtig moet zijn om de weefselstukken in de oorspronkelijke buis te houden. Bereid de cellen voor.

Spuit de cellen opnieuw op in 10 milliliter koud oogstmedium en bewaar op ijs. Voeg 20 milliliter voorverwarmde DTE-oplossing toe aan de conische buis van 50 milliliter met darmstukken en breng terug over naar de silicóniseerde Erlenmeyer kolf met een roerstaaf. Gebruik een grote magneet aan de buitenkant van de kolf om de roerstaaf vast te houden en breng het weefsel en de oplossing terug over naar de conische buis van 50 milliliter.

Schud de buis maximaal 10 seconden. Breng het supernatant over door een cell strainer van 70 micrometer in de buis met cellen van het supernatant van de eerste DTE-behandeling en centrifugeer de cellen. Spuit de cellen opnieuw op in acht milliliter 44% dichtheidsgradiënt of DG-oplossing op kamertemperatuur.

Breng de acht milliliter 44% DG-oplossing en celsuspensie over naar een 17 millimeter bij 100 millimeter 14 milliliter polypropyleen ronde bodembuis. Bedek de cellen met vijf milliliter RT 67% DG-oplossing. Centrifugeer bij 1.600 keer de zwaartekracht gedurende 25 minuten bij RT zonder de rem te gebruiken.

Levensvatbare cellen vormen een buffy coat op de 44% en 67% interface. Verwijder de vetlaag bovenop door middel van vacuüm aspiratie. Gebruik een Pasteur pijpje om de buffy coat op de interface te verzamelen en breng over naar een conische buis van 50 milliliter met 40 milliliter koud oogstmedium.