Name: Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer de isolatie en in vitro cultuur van alveolaire macrofagen uit longen en bronchoalveolaire spoelvloeistof. Deze methode levert een hoogzuivere populatie voor onderzoek naar pulmonale immunologie en ademhalingsziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Clare Prendergast voor hulp bij het bewerken van het manuscript. DKN wordt ondersteund door een onderzoek verlenen (#2095) van de Stichting Flinn en TM wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL056643 en R01HL092514). DKN de methodes ontwikkeld, ontworpen voor de studie en schreef het manuscript; OM bijgestaan met dierstudies en klinische monster aanbestedingen; SB bijgestaan met Flow cytometrische analyse en cel sorteren; TM onder toezicht van de studies en het herzien van het manuscript.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) en de institutionele Review Board (IRB) bij St Joseph's Hospital and Medical Center.
1. isolatie van AMs aan de vloeistof die lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage (BAL)
<ol><li>Anaesthetize een acht-week-oude C57BL/6 muis met ketamine (87,5 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg/kg lichaamsgewicht) via een intraperitoneale injectie cocktail. Gaat u verder wanneer muis chirurgische anesthesie met verlies van reflexen en ontspanning van spieren verkrijgt.</li>
	<li>Plaats de muis op een oppervlak van de dissectie met de ventrale zijde naar boven. Ophthalmic dierenarts zalf toepassen op ogen ter voorkoming van uitdroging en veeg het gehele ventrale oppervlak van muis met steriele alcohol prep pads verzadigd met 70% isopropanol desinfecteren.</li>
	<li>Monteer de muis met alle vier poten worden gefixeerd.</li>
	<li>Voorzichtig open de buikholte met micro dissectie tools. Wees voorzichtig om zo veel gebied open mogelijk zonder een viscerale organen beschadigen of overhangende weefsel te maken.</li>
	<li>Voorzichtig open de borstholte langzaam gebeuren de ribbenkast door middel van het mediastinum door te snijden. In het ideale geval kan de ribbenkast worden weggesneden van kant naar kant. Uiterste zorg moet men niet te verwonden de pleura van de longen tijdens het openen van de borstholte.</li>
	<li>Zoek van de vena cava inferior en maak een incisie te bloeden van de muis. Het gebruik van absorberende katoenen pads voor het opzuigen van bloed.</li>
	<li>Injecteren 10 mL ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in het rechterventrikel (met 10 mL spuit en naald 25G) leeggemaakt circulerende cellen van het bloed. Absorberen van de stroom van bloed met absorberend katoen kussentjes. Zodra het volledig geperfundeerd, de longen geblancheerde zal verschijnen en dan klaar voor lavage.</li>
	<li>Voorzichtig opengesneden van de huid en spieren in de nek om de luchtweg bloot te stellen. Accijnzen zorgvuldig de aangrenzende spieren, kraakbeen en vetweefsel zonder schade aan de luchtpijp.</li>
	<li>Maken van een kleine incisie (< 2 mm) op de luchtpijp posterieure aan het strottenhoofd. Deze incisie moet net genoeg om het invoegen van een katheter in terwijl de luchtpijp nog steeds met het strottenhoofd verbonden is. Plaats een katheter 22G 1-inch zonder een naald in de luchtpijp naar de longen. Beveiligen van de katheter met een zijde gevlochten hechtdraad (4-0; niet-absorbeerbare) met een vierkante knoop. Opmerking: De katheter moet worden bijgesneden op basis van de grootte van de muis. Zeer korte of lange katheters neiging om te lekken en/of de luchtweg tijdens lavage scheuren. Katheter lengte moet zodanig zijn dat wanneer volledig ingevoegd de tip blijft goed binnen de luchtpijp en bereiken niet de primaire bronchiën.</li>
	<li>Koppelt u een 1 mL spuit gevuld met ijskoude BAL buffer (Ca2 + en Mg2 + gratis PBS + 1 mM ethyleendiamminetetra zuur, EDTA) om de katheter en langzaam het indruppelen van de buffer in de longen. Dit zal het opblazen van de longen. Houd de injectiespuit toegevoegd aan de katheter van vijf seconden en vervolgens gecombineerd de lavage vloeistof door zachtjes te trekken van de zuiger. Dit zal laten leeglopen van de longen. Het verzamelen van de vloeistof in een conische tube van 15 mL geplaatst op ijs.</li>
	<li>Herhaal stap 1.10 voor negen vaker en bundelen de lavage vloeistof. Overschrijd niet 1 mL buffer per spoeling, als dat kan hoger zijn dan de longcapaciteit en tot haar breuk leiden.</li>
	<li>De muis met CO2 overdosis euthanaseren door IACUC goedgekeurde protocol.</li>
	<li>De vloeistof 10 mL BAL bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten centrifugeren. De cel pellet bevat BAL cellen. Let op: De pellet kan zeer klein, dus wees voorzichtig bij het aspirating van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen van de BAL in 100 μl van de stroom/sorteren buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic zuur (HEPES)).</li>
	<li>De niet-specifieke antilichaam dat aan Fc receptor bindt blokkeren door het toevoegen van muis Fc blok (kloon 2.4G2, 10 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.</li>
	<li>Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met fluorescentie min één (FMO) en single-vlek besturingselementen11,25. Evalueren van de BAL cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door passende analysesoftware (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>AMs isoleren door een cel fluorescentie-geactiveerde sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL muis ben kweekmedium wanneer AMs bestemd zijn voor in vitro cultuur of in vivo cel overdracht. Als alternatief (Zie Tabel van materialen) soort AMs in 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol voor RNA extractie.</li>
</ol>2. isolatie van AMs van muis Long, eencellige schorsing
<ol><li>Anaesthetize een acht-week-oude C57BL/6 muis met ketamine (87,5 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (12,5 mg/kg lichaamsgewicht) via een intraperitoneale injectie cocktail. Gaat u verder wanneer muis chirurgische anesthesie met verlies van reflexen en ontspanning van spieren verkrijgt.</li>
	<li>Plaats de muis op een oppervlak van de dissectie met de ventrale zijde naar boven. Ophthalmic dierenarts zalf toepassen op ogen ter voorkoming van uitdroging en veeg het gehele ventrale oppervlak van muis met steriele alcohol pads verzadigd met 70% isopropanol desinfecteren.</li>
	<li>Monteer de muis met alle vier poten worden gefixeerd.</li>
	<li>Voorzichtig open de buikholte met micro dissectie tools. Wees voorzichtig om zo veel gebied open mogelijk zonder een viscerale organen beschadigen of overhangende weefsel te maken.</li>
	<li>Voorzichtig open de borstholte langzaam gebeuren de ribbenkast door middel van het mediastinum door te snijden. In het ideale geval kan de ribbenkast worden weggesneden van kant naar kant. Uiterste zorg moet men niet te verwonden de pleura van de longen tijdens het openen van de borstholte.</li>
	<li>Zoek van de vena cava inferior en maak een incisie te bloeden van de muis. Het gebruik van absorberende katoenen pads voor het opzuigen van bloed.</li>
	<li>10 mL ijskoud PBS injecteren met het rechterventrikel (met 10 mL spuit en naald 25G) leeggemaakt circulerende cellen van het bloed. Zodra het volledig geperfundeerd, de longen geblancheerde zal verschijnen en zijn klaar voor oogst.</li>
	<li>Ontleden uit de longen door doorsnijden omvat van de luchtpijp, de bloedvaten en de ligamenten in een conische tube van 15 mL met 5 mL koude Dulbecco van bewerkt Eagle's medium (DMEM). Handhaven op ijs tot de volgende stap.</li>
	<li>De muis met CO2 overdosis euthanaseren door IACUC goedgekeurde protocol.</li>
	<li>Breng de perfused longen in een steriele en pyrogeen-gratis 60 mm cultuur schotel met 3 mL DMEM. Met hulp van de ontrafeling van de verlostang plagen uit de luchtwegen en andere harde, niet op premie-of longweefsel materiaal, indien aanwezig. Het longweefsel met een scalpel tot gehakt < 1 mm grootte.</li>
	<li>Voeg 300 µg/mL Liberase TL en 5 U/mL DNase ik, Meng door pipetteren en Incubeer bij 37° C in een broedstoof gedurende 25 minuten. Meng voorzichtig eens door pipetteren na 10 minuten.</li>
	<li>De gedissocieerde longen passeren een 100 µm cel zeef geïnstalleerd op een conische buis van 50 mL. Gebruik de achterkant van een zuiger uit 1 mL spuit aan beslag op cel bosjes op het filter. Was het filter met 20 mL was buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugeer bij 500 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 20 mL was buffer.</li>
	<li>Herhaal stap 2.12 en 2.13 tweemaal, het filter en de buis veranderen elke keer. Vooraf het filter onderdompelen in was buffer voor meer dan vijf minuten verhoogt het rendement van de AM. Maak van eencellige suspensie door toevoeging van 100 μl stroom/sorteren buffer naar de cel-pellet.</li>
	<li>De niet-specifieke antilichaam binding aan de receptor Fc blokkeren door het toevoegen van muis Fc blok (kloon 2.4G2, 10 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.</li>
	<li>Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met FMO en single-vlek besturingselementen11,25. Evalueren van de longen cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door analyse software.</li>
	<li>Soort AMs door een cel sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL muis ben kweekmedium wanneer AMs bestemd zijn voor in vitro cultuur of in vivo cel overdracht. U kunt ook sorteren AMs in 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol voor RNA extractie.</li>
</ol>3. isolatie van AMs van menselijke BAL vloeistof
<ol><li>Regelen van de overdracht van de menselijke BAL vloeistof uit de kliniek naar het laboratorium bij 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer de BAL vloeistof (10-50 mL) bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. De pellet cel bevat BAL cellen11.</li>
	<li>Wassen van de pellet met 20 mL was buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 2 mM EDTA) en centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen BAL in 100 μl zijn van de stroom/sorteren buffer (PBS + 2% warmte geïnactiveerd FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).</li>
	<li>De niet-specifieke antilichaam binding aan de receptor Fc blokkeren door toevoeging van menselijke Fc blok (kloon Fc1.3070, 25 μg/mL) en incubatie gedurende 20 minuten op het ijs.</li>
	<li>Uitvoeren van antilichaam kleuring samen met FMO en single-vlek besturingselementen11,24. Evalueren van de BAL cellen door een cel analyzer (Zie Tabel van materialen) gevolgd door eencellige stroom cytometry analyse door analyse software.</li>
	<li>Soort AMs door een cel sorter (Zie Tabel van materialen) direct in 1 mL menselijke AM kweekmedium of 1 mL Lysis-buffermengsel aangevuld met 10 μl/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. in vitro cultuur van AMs
<ol><li>Na de cel sorteren, oogsten de cellen door centrifugatie bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Resuspendeer menselijke AMs in 1 mL menselijke AM kweekmedium [Roswell Park Memorial Instituut middellange (RPMI) 1640 aangevuld met 10% FBS, 20% L-929 cultuur supernatant (als een bron van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF), 100 eindconcentratie van U/mL), 1 mM natrium pyruvaat 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic zuur (HEPES) en 1 x penicilline/streptomycine (optioneel)]. Evenzo resuspendeer muis AMs in 1 mL muis AM kweekmedium [DMEM aangevuld met 10% FBS, 20% L-929 cultuur supernatant (als een bron van M-CSF, 100 eindconcentratie van U/mL), 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM HEPES en 1 x penicilline/streptomycine (optioneel )].</li>
	<li>Inventariseren van de trypan blauw-exclusief levensvatbare cellen door een cel teller en pas de levensvatbare cellen concentratie aan 1 x 106/mL. Opmerking: in het ideale geval van 5 x 105 AMs kunnen worden geïsoleerd aan de BAL vloeistof verzameld uit een 8-10 week oud C57BL/6 mannelijke muis. De AM-opbrengst van de muis Long digest is variabel en kan worden iets minder dan die van de muis BAL vloeistof. AM opbrengst van menselijke BAL vloeistof is afhankelijk van het volume van de vloeistof van de BAL, de totale hoeveelheid zoutoplossing gebruikt in de lavage en klinische toestand van de patiënt.</li>
	<li>Op basis van het rendement en de experimentele noodzaak, seed cellen in kamer dia's, cultuur gerechten of cultuur kolven. In het ideale geval Beënt de AMs op 1 x 105/mL met 10 mL medium in een maatkolf van T25 weefselkweek.</li>
	<li>Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator van 37 ° C met 5% CO2 sfeer. Opmerking: AMs zal groeien als Adherente cellen en zijn uiterst langzaam groeiende (verdubbeling tijd > 7 dagen).</li>
	<li>24 uur na zaaien, AMs moet aanhanger en zal niet worden losgemaakt door een zachte verandering van kweekmedium. Verwijder het medium door aspiratie van de ene kant en vullen met vers medium vooraf opgewarmd tot 37 ° C. Opmerking: De cellen kunnen nu worden gebruikt om AM Fysiologie of de effecten van stimuli te beoordelen. AMs gegroeid in kamer dia's gemakkelijk kunnen worden gekleurd met passende antilichamen en zijn ideaal voor microscopische visualisatie. Voor de evaluatie van de cytometrische van de stroom, worden AMs geoogst door incubatie met niet-enzymatische cel distantiëren van de oplossing.</li>
	<li>Het kweekmedium gecombineerd en distantieert oplossing genoeg om te dekken van het oppervlak van de cultuur (ongeveer 2 mL per T25 kolf) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten toe te voegen. Geen schrapen nodig zal zijn, en het wordt niet aanbevolen om de cellen mechanisch schrapen. Tik zachtjes op de zijkanten, voeg 1-2 mL buffer stroom/sorteren en Pipetteer voorzichtig omhoog en omlaag als u wilt loskoppelen van de meerderheid van de Adherente cellen.</li>
	<li>Lyse de cellen direct op de schotel van cultuur door het toevoegen van Lysis buffer voor RNA studies.</li>
</ol>

<ol><li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li>
<li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140(2017).</li>
<li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li>
<li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053(2014).</li>
<li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li>
<li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li>
<li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li>
<li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection%3A+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha%2C+T+helper+1%2FT+helper+2+cytokines%2C+IgG+subclasses%2C+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li>
<li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+Rev%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li>
<li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+alveolar+proteinosis%3A+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113(2014).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li>
<li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li>
<li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li>
<li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li>
<li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li>
<li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li>
<li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li>
<li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.

AMs zijn lang-leven Long-ingezeten macrofagen die bevolken de longen beginnen bij de geboorte en blijvende over de gehele levensduur26. Hun rol in de pulmonaire fysiologie7 en pathologie12 en hun potentieel voor het voorspellen van pulmonaire autoimmuniteit24 zijn bekroond. Omdat AMs een langdurige aanwezigheid in longen11,27 hebben en omdat zij betrokken bij de active...

De Long-communicatie is een uniek complex ecosysteem met een uitgebreide lucht conduit en therapieën. De ingeademde lucht reist via de luchtpijp en vele vertakkingen van de bronchiën en bronchioli alvorens de longblaasjes, waar het bloed-lucht gasuitwisseling plaatsvindt. Als gevolg van directe interactie met de atmosfeer vereist het respiratoire oppervlak bescherming tegen de potentieel schadelijke effecten van deeltjes in de lucht en verontreinigende stoffen. Een aantal fysieke, chemische en immunologische belemmeringen beschermen de longen. Implementatie van fagocyten aan de luchtwegen oppervlakte dient met name een belangrijke eerste regel verdedigingssysteem. Alveolaire macrofagen (AMs) zijn een soort Long-ingezeten fagocyten, en ze vormen de overgrote meerderheid van de longkanker macrofaag zwembad. Zoals hun naam al doet vermoeden, AMs zijn voornamelijk gelokaliseerd op de alveolaire lumen en optreden als sessiele cellen die voortdurend de omgevingsklimaat proeven en communiceren met de alveolaire epitheel1. In stationaire toestand longen zijn meer dan 95% van de fagocyten in de alveolaire ruimte AMs2, waarvan de samenstelling als gevolg van ontsteking, infectie of chronische blootstelling aan verontreinigende stoffen wijzigen kan.
AMs deelnemen aan een breed scala van functies die mogelijk lokale naar de longen en/of systemische belang. Bijvoorbeeld, zijn AMs van essentieel belang in de ontwikkeling en de optimale werking van de longen; immuun toezicht; en de ontmijning van cellulaire puin, invasie van ziekteverwekkers, en geïnhaleerde deeltjes3,4,5,6,7. Gerichte uitputting van AMs heet schade kunnen toebrengen aan de goedkeuring van de respiratoire virussen en bacteriën4,8. Naast hun rol als fagocyten en een verdedigers van de eerste regel van de pulmonaire homeostase, AMs zijn gekend om te functioneren als antigeen-presenteren cellen in het opwekken van T cel immuniteit9, potentiating van de werkzaamheid van intranasale vaccin10 en Long-beperkte autoimmuniteit na Long transplantatie11,12te beïnvloeden. Tekort aan AM functie is gekoppeld aan de pulmonaire alveolaire proteinosis (PAP), een aandoening als gevolg van een genetische mutatie, maligniteit of infectie die Goedkeuringvande pulmonaire oppervlakteactieve stoffen13,14 schaadt. Transplantatie van AMs is nu onderzocht als een therapeutische benadering voor de behandeling van PAP 15,16.
AMs zijn bekend ontstaan tijdens de embryogenese en te volharden in de longen gedurende het hele leven zonder verdrongen door het circuleren van leukocyten2,17. Hoewel, AM omzet is niet detecteerbaar in homeostatische longen, zijn verschillende niveaus van AM omzet gemeld in bepaalde klinische voorwaarden met inbegrip van infectie door het influenza virus4, myeloablative bestraling18, blootstelling aan endotoxinen 19en20van de ouderdom. AMs worden verondersteld zelf vernieuwen via een low-grade proliferatie17,21, maar sommige recente studies beweren dat monocyten aanleiding kunnen geven tot een bevolking intravasculaire Long macrofagen22,23 onder experimentele omstandigheden, maar de functionaliteit van deze nieuwe geconverteerde pulmonaire macrofagen moeten nog worden omschreven in longziekten. Bovendien begrijpen de drempel van stimulus in het kader van de activering van de AM is een potentieel interessant gebied, zoals de Long probeert te behouden een evenwicht tussen de inflammatoire signalen en de immunoregulerende machines.
De fysiologische of pathologische veranderingen die tot verlies van immuunregulatie leiden zijn belangrijk om te evalueren in verschillende klinische settings (bijvoorbeeld infecties van de luchtwegen, inflammatoire longziekte en fibrotische longziekte). AMs zijn echter steeds meer erkend als indicatoren of zelfs determinanten van de gezondheid van de pulmonaire11,24. Momenteel zijn er geen uniforme protocollen beschikbaar voor oogsten, karakteriseren, en/of onderhouden AMs van mens en preklinische lymfkliertest modellen. Ontbreken van een consensus op AM precursoren en fenotypes en het ontbreken van een gedetailleerde methodologie hadden de grote wegversperring in ontcijferen rol(len) van AM bij pulmonaire gezondheid en ziekte. Het volgende protocol biedt een definitieve identificatie, isolatie en in vitro cultuur strategie die sterk zal verder van het begrijpen van AM gedrag en AM-gerichte diagnostische en therapeutische studies te vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>Non-enzymatic cell dissociating solution</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catheter&nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Non-absorbable silk braided suture&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s phosphate buffered saline&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&mu;m cell strainer&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&nbsp;CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Tissue culture flask</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>60 mm culture dish&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa cell analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Human)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

isolatie en in vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolaire macrofagen zijn terminaal gedifferentieerde, Long-inwoner van macrofagen van prenatale oorsprong. Alveolaire macrofagen zijn uniek in hun lange levensduur en hun belangrijke rol in de ontwikkeling van de Long en functie, evenals hun Long-gelokaliseerde reacties op infecties en ontstekingen. Tot op heden bestaat er geen uniforme methode voor de identificatie, isolatie, en behandeling van de alveolaire macrofagen van mensen en muizen. Deze methode is nodig voor studies over deze belangrijke aangeboren immuun cellen in verschillende experimentele instellingen. De methode die hier beschreven, die kan gemakkelijk door elk laboratorium worden aangenomen, is een vereenvoudigde aanpak voor het oogsten van de alveolaire macrofagen uit bronchoalveolar lavage vloeistof of longweefsel en onderhouden hen in vitro. Omdat alveolaire macrofagen voornamelijk als Adherente cellen in de longblaasjes optreden, is de focus van deze methode op hen verjagend voorafgaand aan de oogst en identificatie. De Long is een zeer gevacuoliseerd orgaan, en verschillende celtypes van myeloïde of lymfoïde oorsprong bewonen, interactie en worden beïnvloed door de communicatie van de longen. Met behulp van de set van oppervlakte markers beschreven hier, kunnen onderzoekers gemakkelijk ondubbelzinnig alveolaire macrofagen onderscheiden van andere leukocyten en zuiveren ze voor downstream toepassingen. De methode van de cultuur ontwikkeld hierin ondersteunt beide mens muis alveolaire macrofagen in vitro groeimogelijkheden en is compatibel met cellulaire en moleculaire studies.

De stroom cytometrische aanpak om te identificeren muis AMs is afgebeeld in Figuur 1. Dit omvat analyse van een minimumpakket van oppervlakte markers in AMs onderscheiden van andere Long-ingezeten of Long-infiltreren fagocyten noodzakelijk. Differentiële analyse is vereist AMs positief kan identificeren van interstitiële macrofagen, dendritische cellen, neutrofiele granulocyten, monocyten en monocyt-afgeleide pulmonaire macrofagen die zich in de longen voordo...

Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane en muizen alveolaire macrofagen te isoleren uit longen en bronchoalveolaire lavagevloeistof en de methode te ontwikkelen voor hun in vitro-kweek. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van enkele sleutelvragen op het gebied van pulmonale immunologie, zoals de rol van alveolaire macrofagen bij respiratoire infecties, ontsteking en auto-immuniteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om alveolaire macrofagen te kunnen onderscheiden van de andere longleukocyten en een populatie van hoog gezuiverde alveolaire macrofagen te verkrijgen voor experimentele doeleinden.Plaats een verdoofde muis op een dissectieoppervlak met de ventrale zijde naar boven. Breng oogzalf voor dieren aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Veeg de volledige ventrale oppervlakte van de muis af met steriele alcohol pads, verzadigd met 70% isopropanol, om te desinfecteren.Monteer de muis met alle vier de poten vastgehouden. Open voorzichtig de buikholte met microdissectie-instrumenten. Er moet voorzichtig gehandeld worden om zoveel mogelijk oppervlakte te openen zonder enige viscerale organen te beschadigen of overhangend weefsel te creëren.Open voorzichtig de borstholte door langzaam in de ribbenkast in te snijden via het mediastinum. Ideaal is het om de ribbenkast van zij naar zij te verwijderen. Er moet uiterst voorzichtig gehandeld worden om de pleura van de longen niet te beschadigen tijdens het openen van de borstholte.Lokaliseer de inferieure vena cava en maak een incisie om de muis te laten bloeden. Gebruik absorberende watten om het bloed op te vangen. Injecteer 10 milliliter ijskoud fosfaat gebufferde zoutoplossing in de rechterventrikel om de circulerende bloedcellen weg te spoelen.Absorbeer de bloedstroom met absorberende watten. Zodra volledig geperfundeerd, zullen de longen er uitgebloed uitzien en zijn dan klaar voor lavaged. Snijd voorzichtig de huid en spier in de nek open om de luchtweg bloot te leggen.Verwijder voorzichtig de aangrenzende spieren, kraakbeen en vetweefsel zonder de luchtpijp te beschadigen. Maak vervolgens een kleine incisie in de luchtpijp, achter de larynx. Deze incisie moet net groot genoeg zijn om een katheter in te brengen terwijl de luchtpijp nog aan de larynx is bevestigd.De meest cruciale stap bij het verzamelen van BAL-vloeistof is om een katheter stevig aan de luchtpijp te bevestigen die lekken tijdens de lavaged minimaliseert. Breng een een inch 22 gauge katheter zonder naald in de luchtpijp naar de longen. Bevestig de katheter met een gevlochten zijden naad en een vierkante knoop.Met stevige handen en door voorzichtig te handelen tijdens deze stap, voorkomt u breuk van de luchtpijp en longen. Bevestig een een milliliter spuit, gevuld met ijskoud BAL-buffer, aan de katheter en breng de buffer langzaam in de longen. Dit zal de longen opblazen.Houd de spuit vijf seconden aan de katheter vast en zuig vervolgens de lavagedvloeistof op door voorzichtig aan de zuiger te trekken. Dit zal de longen laten leeglopen. Verzamel de vloeistof in een 15 milliliter kegelbuis, geplaatst op ijs.Herhaal de opblazing en leeglopen nog negen keer en verzamel de lavagedvloeistof. Overschrijd niet meer dan één milliliter buffer per spoeling, omdat dit de longcapaciteit kan overschrijden en tot scheuring kan leiden. Centrifugeer de 10 milliliter BAL-vloeistof bij 250 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.De celpellet bevat BAL-cellen. Breng de BAL-cellen opnieuw op in 100 microliter flow sorting buffer. Ga verder met het kleuren en sorteren van de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.Bereid een verdoofde muis voor voor dissectie, voer incisies uit en laat de muis bloeden zoals eerder. Injecteer 10 milliliter ijskoud PBS in de rechterventrikel om de circulerende bloedcellen weg te spoelen. Zodra volledig geperfundeerd, zullen de longen er uitgebloed uitzien en klaar zijn voor oogst.Dissecteer de longen door de luchtpijp, bloedvaten en ligamenten door te snijden in een 15 milliliter kegelbuis, met vijf milliliter koude DMEM. Bewaar het op ijs tot de volgende stap. Breng de geperfundeerde longen over in een steriele en pyrogeenvrije 60 millimeter kweekschaal met drie milliliter DMEM.Met behulp van dissectiepincetten, verwijder de luchtwegen en ander hard niet-longweefsel, indien aanwezig. Snijd het longweefsel met een scalpel tot minder dan één millimeter groot. Voeg 300 microgram per milliliter Liberase TL toe, en vijf eenheden per milliliter DNAse één.Meng door te pipetteren en incubeer bij 37 graden Celsius in een incubator gedurende 25 minuten. Na 10 minuten, meng voorzichtig eenmaal door te pipetteren. Laat de gedissocieerde longen door een 100 micron celzeef lopen die op een 50 milliliter kegelbuis is geïnstalleerd.Gebruik de achterkant van een zuiger van een een milliliter spuit om celklonten op de zeef te pletten. Was de zeef met 20 milliliter wasbuffer. Centrifugeer bij 500 keer g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Gooi het supernatant weg en breng de celpellet opnieuw op in 20 milliliter wasbuffer. Herhaal de zeefstap en centrifugeer twee keer, waarbij u de zeef en buis elke keer verwisselt. Bereid ten slotte de enkele celsuspensie voor door 100 microliter flow sorting buffer toe te voegen aan de celpellet.Voer antilichaamkleuring en celsortering uit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Na de celsortering, verzamel de cellen door te centrifugeren bij 250 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de muis AM's opnieuw op in één milliliter muis AM-kweekmedium.Op basis van de opbrengst en experimentele noodzaak, zaai de cellen in kamerslides, kweekschalen of kweekflacons. Zaai de AM's idealiter in een hoeveelheid van 100.000 per milliliter met 10 milliliter medium in een T 25 weefselkweekflacon. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% kooldioxide

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

Wij presenteren een eenvoudig en efficiënt protocol voor het genereren van humane macrofagen. Buffy coats worden door dubbele dichtheidsgradiënt centrifugatie en geïsoleerde monocyten worden vervolgens gedifferentieerd macrofagen in met Teflon beklede celkweek zakken. Dit maximaliseert macrofaag opbrengst en vergemakkelijkt cel oogsten voor volgende experimenten.

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

Beendermergcellen gekweekt met granulocyte macrophage colony stimulerende factor (GM-CSF) genereren een heterogene cultuur die macrofagen en dendritische cellen (DC's) bevat. Deze methode benadrukt het gebruik van MHCII en hyaluronan (HA) binding om macrofagen te onderscheiden van de DC's in de GM-CSF cultuur. Macrofagen in deze cultuur hebben veel overeenkomsten met alveolaire macrofagen.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Er wordt een protocol gepresenteerd voor celcultuur van macrofaagkoloniestimulerend factor (M-CSF) gedifferentieerde humane monocyt-afgeleide macrofagen. Het protocol maakt gebruik van cryopreservatie van monocyten gekoppeld aan hun bulkdifferentiatie in macrofagen. Vervolgens kunnen de geoogste macrofagen worden gezaaid in kweekputjes bij de vereiste celdichtheden voor het uitvoeren van experimenten.

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Hier gepresenteerd is een protocol voor primaire menselijke bloed monocyten isolatie evenals hun differentiatie in macrofagen en dendritische cellen en assemblage met epitheliale cellen in een meercellige menselijke long model. Biologische reacties van coculturen bestaande uit immuuncellen onderscheiden van vers geïsoleerde of ontdooide monocyten, bij blootstelling aan pro-inflammatoire stimuli, worden vergeleken.

Meercellige human alveolaire model samengesteld uit epitheelcellen en primaire immuuncellen voor hazard assessment

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en kweek van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen.

Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Leer de isolatie en in vitro cultuur van alveolaire macrofagen uit longen en bronchoalveolaire spoelvloeistof. Deze methode levert een hoogzuivere populatie voor onderzoek naar pulmonale immunologie en ademhalingsziekten.

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Meer video's verkennen