Een methode om te studeren het C924T polymorfisme van het Thromboxaan A2-Receptor gen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het trombose- en hemostaseveld met kenmerken die gevoeliger zijn voor atherothrombotische processen, met name patiënten met een hoog risico die met aspirine worden behandeld. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het goedkoop, eenvoudig te gebruiken, handig, heeft een hoge efficiëntie en maakt een snelle identificatie van de C924T polymorfismen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in het atherothromboseveld, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals polymorfismen waarbij gepersonaliseerde geneeskunde of specifieke geneesmiddelen betrokken zijn om de farmacologische individuele respons te begrijpen.

Het aantonen van de procedure zal Doctor Sebastiano Ursi, een technicus van ons laboratorium. Om de Tris EDTA-buffer bij pH 8.0 voor te bereiden, voeg je 200 microliter edta van 0,5 molar en één milliliter van één molaire Trischloride in een bekerglas toe en pas het volume aan op 100 milliliter met steriel water en bewaar je op kamertemperatuur. Bereid vervolgens een liter 10X voorraadoplossing van elektroforese buffer door alle reagentia toe te voegen en bewaar de buffer vervolgens bij kamertemperatuur.

Bereid vervolgens de gel laden kleurstof door het toevoegen van alle reagentia breng het volume tot 100 milliliter met steriel water. Eenmaal voorbereid, bewaar de kleurstof op vier graden Celsius voor een paar maanden. Voeg 450 milliliter water toe aan 50 milliliter 10X TBE buffer om een oplossing van 1X TBE buffer voor te bereiden.

Voeg vier gram agarose in 200 milliliter 1X TBE buffer samen in een 600 milliliter beker om 200 milliliter van 2%agarose gel voor te bereiden. Gestolde agarose gel opgeslagen bij kamertemperatuur kan worden opgelost over een kokend waterbad op 60 graden gedurende 15 tot 20 minuten of in een magnetron gedurende 35 minuten door het toevoegen van een klein volume water om de toename van de agarose concentratie te compenseren. Blijf roeren het bekerglas op een magnetische mixer gedurende ongeveer vijf minuten tot de agarose wordt opgehangen dan verwarm de agarose op een hete plaat voor ongeveer 10 minuten of in een magnetron gedurende drie minuten voor het volledig op te lossen.

Meng na de zuivering van DNA de verse DNA-monsters voorzichtig door buizen meerdere keren te pipetten. Het is verplicht om 10 tot 50 nanogram van een goede kwaliteit sjabloon DNA gewonnen uit menselijke monsters te verkrijgen. Daarom gebruiken we liever een geautomatiseerde DNA-zuivering dan een semi-geautomatiseerde of handmatige.

Om te beginnen met zuiveren, eerst kwantificeren en berekenen van de zuiverheid van het DNA door het meten van de absorberenden op 260, 280 en 320 nanometer, dan verdunnen van de monsters met behulp van steriel water. Kalibreer vervolgens de spectrofotometer. Om de PCR-reactie te vormen, voeg alle reagentia toe om 25 microliter pcr-mastermix voor te bereiden in een 0,2 milliliter microamplificatiebuis.

Plaats vervolgens de PCR-buizen in een geautomatiseerde thermocycler en versterk de gezuiverde DNA-monsters. Zodra het programma is voltooid, stop de reactie door het verlaten van de buizen op vier graden Celsius. Voeg 10X enzymbuffer vijf eenheden per microliter beperkingsenzym toe in dna's vrij water aan een volume van 22,5 microliter.

Voeg vervolgens 2,5 microliter PCR-product toe aan een nieuwe PCR-buis en voeg vervolgens de 22,5 microliter van de beperkingsverteringsmix toe aan het PCR-product. Incubeer de PCR product beperking spijsvertering master mix op 37 graden Celsius gedurende vier uur, voeg dan 0,5 microgram per milliliter Ethidium bromide om de gel vlek gedurende 10 minuten. Giet de gel op de gellade met de putkam op zijn plaats om de gel te stollen.

Giet nu de geldoos met 1X TBE buffer tot de gel bedekt is. Gebruik fijne tips om zes microliters van het versterkte verteerde DNA te laden in de putten die in de gel zijn gevormd en voeg vervolgens ook een DNA-marker toe in een aparte put parallel aan het monster. Schakel vervolgens de elektroforese-eenheid in.

Om het C924T genetische polymorfisme in het TBXA2R-gen te identificeren, wordt RFLP-analyse uitgevoerd. In de gel, het toont twee banden op 395 en 144 basisparen voor de wild-type versie van de grote allel, terwijl een enkele band op 539 basisparen voor de mutant versie van de kleine allel wordt gezien die wijst op geen cut door de beperking enzym. Interessant is dat drie bands op 395, 144 en 539 basisparen aanwezig zijn voor het heterozygoot.

Vervolgens wordt het C924T polymorfisme bevestigd aan de hand van sequentieanalyse. De gemarkeerde sequentie vertegenwoordigt het polymorfisme. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gedaan in ongeveer acht uur als het goed wordt uitgevoerd.

Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat deze methode alleen kan worden gebruikt voor een klein aantal knipsels en de voor enkele monsters in een werksessie. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals knipanalyse worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het belang van andere trajecten met atherothrombotische processen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van moleculaire biologie om genetische variaties te onderzoeken die uitstekend uitblinken in deze beginnende ontwikkeling en progressie.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe de Thromboxane A2 receptor genotype te evalueren met betrekking tot de C924T polymorfisme met behulp van gel elektroforese analyse van de PCR-RFLP monsters. Vergeet niet dat het werken met Ethidium bromide en UV-lichtbronnen zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals handschoenen, veiligheidsbril, of een gezichtsmasker en andere beschermende apparaten moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.