Name: Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer endocardiale cellen volgen tijdens hartklepvorming in levende zebravisembryo's met behulp van Kaede-fotoconversie. Deze methode overwint beperkingen van traditionele tijdverloopmicroscopie door de snelle hartslag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wil Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli en Basile Gurchenkov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en maken van de mal beschreven in dit protocol. Dit werk werd gesteund door de ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), de EMBO jonge onderzoeker programma, FRM (DEQ20140329553), de EUROPESEGEMEENSCHAP, ERC CoG N ° 682938 Evalve en door de subsidie ANR-10-LABX-0030-INRT, een Franse staat Fonds beheerd door het Agence Nationale de la Recherche onder het frame programma Investissements d'Avenir label ANR-10-IDEX-0002-02.

1. voorbereiden van mallen en monteren van agarose
<ol><li>Maak een mal met de afmetingen weergegeven in Figuur 1 met behulp van een 3D-printer of traditionele mechanische werkplaatsgereedschap.</li>
	<li>Pipetteer ongeveer 1,5 mL gesmolten 1% agarose in een 35-mm kunststof ophangsysteem schotel. Plaats de plastic mal in de vloeibare agarose, verzorgen om te voorkomen dat de lucht van de overlapping tussen de schimmel en de agarose. Zet de schotel bij 4 ° C, wachten tot de agarose verhardt (dit duurt ongeveer 5 minuten) en deze vervolgens verwijdert de plastic mal.</li>
	<li>De montage schotel voor later gebruik opslaan, dekking van de schotel met het deksel, dan wikkel zowel de schaal als het deksel strak met parafilm. De montage schotel kan vervolgens worden opgeslagen deksel kant naar beneden tot maximaal 5 dagen bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereiden 1 mL aliquots van 0,7% lage smeltpunt agarose in 1,5 mL Eppendorf buizen te gebruiken op de dag van montage. Opmerking: De agarose putten van de montage-schotel zal vervormen na verloop van tijd als water verdampt als parafilm niet strak om de gerechten is gewikkeld.</li>
</ol>2. het verkrijgen van embryo's voor de Photoconversion
<ol><li>In de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) lijn en groeien ongeveer 200 embryo's in embryo medium in het donker bij 28,5 ° C. Raadpleeg voor meer informatie over hoe te steken zebrafish lijnen, de JoVE Science Education Database-11.</li>
	<li>Na 5 h maar vóór 24u, behandeling van embryo's met 1-fenyl-2-thioureum (FTU) pigment vorming te voorkomen (0.003% FTU in embryo medium).</li>
	<li>Ongeveer 1 uur vóór het begin van de photoconversion, scherm embryo's onder een fluorescente stereoscoop en selecteer 5 gezonde embryo's die lijken te uiten de helderste groene fluorescentie. Het gebruik van lage-intensiteit licht bij het visualiseren van embryo's wordt aanbevolen om Vermijd blootstelling van de embryo's aan omgevingslicht om te voorkomen dat photoconverting Kaede in niet-specifieke cellen.</li>
</ol>3. insluiten
<ol><li>10 mL van de montage van de media voor te bereiden: 0.02% tricaïne en 50 mM BDM embryo medium.</li>
	<li>Voeg van 2 mL van montage medium aan de montage schotel en laat 15-30 min. voor de oplossing te verspreiden in de agarose.</li>
	<li>In de tussentijd smelt een hoeveelheid van 1 mL van 0,7% lage smeltpunt (LMP) agarose door het plaatsen van de buis in een blok warmte 70 ° C gedurende ongeveer 5 minuten.<ol>
<li>Wachten op de LMP agarose lichtjes afkoelen, dan 25 µL van tricaïne oplossing van 8 mg/mL en 40 µL van 1M BDM oplossing toevoegen aan de buis van lage smeltpunt agarose. Meng door pipetteren op en neer, breng de buis naar een 38 ° C warmte blok te houden van de LMP agarose in zijn vloeibare toestand.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In een Petri schotel met embryo medium, zorgvuldig dechorionate de voorgeselecteerde embryo's onder de stereomicroscoop met pincet, verzorgen niet tot schade van de embryo's.</li>
	<li>De embryo's overbrengen in een aparte schotel met 2 mL media te monteren.<ol>
<li>Wanneer de harten van de embryo's worden gestopt (duurt ongeveer 5-10 min), overdracht de embryo's naar de montage schotel en schik embryo's in de putjes met behulp van Tang zodat ze onder een hoek van 25 graden liggen, tails wijst naar het bovenste gedeelte van het goed, de dooier naar boven.</li>
		<li>Wanneer de embryo's zijn ruwweg in plaats, verwijder het medium, de embryo's insluiten in ~ 200 µL van 0,7% LMP agarose met tricaïne en BDM, en passen de embryo's posities, kantelen van de embryo's naar links of naar rechts als nodig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wacht totdat de LMP agarose sets (duurt ongeveer 5 minuten), vervolgens montage medium aan het gerecht toevoegen. De embryo's zijn nu klaar om te worden photoconverted. Opmerking: De tricaïne en de BDM worden gebruikt om de anesthetize van de embryo's en om te stoppen met de embryo's hart, respectievelijk. Montage media kan worden voorbereid voor de dag voor imaging, maar zorg ervoor dat de media te beschermen tegen licht. Opmerking: De juiste positionering van de embryo's is belangrijk dat er een duidelijke laser-pad naar de cellen die men te photoconvert wenst. Positie van het hoofd van het embryo dicht bij het begin van de put zodat laserlicht hoeft niet te reizen ver te bereiken van het embryo, en zodat de embryo's kunnen gemakkelijk gemonteerd na photoconversion.</li>
</ol>4. Photoconversion
<ol><li>Op een rechtop confocal microscoop (zoals Leica SP8) uitgerust met een 405 nm, 488 nm en 561 nm laserbron, zoek het embryo is verzonden met behulp van hart wit licht (helderveld) en een objectief (graag Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 doelstelling). Controleren op rode Kaede fluorescentie met behulp van de 561 nm laser (dat wil zeggen, DPSS 561 laser, bij ~ 5% intensiteit, detector vastgesteld op 589-728 nm). Vervolgens visualiseer het endocard met behulp van de 488 nm laser (dat wil zeggen, 30 mW multiline Argon laser bij ~ 5% intensiteit, detector vastgesteld op 502-556 nm).</li>
	<li>"FRAP" modus op de Microscoop verwerving software. Selecteer ~ 1% laser macht voor beide 488 nm en 561 nm lasers.</li>
	<li>Richten zich op het vlak van belang, een regio van belang (ROI), selecteer vervolgens photoconvert cellen met behulp van de 405 nm diode laser op 25% laser kracht, drie keer over de ROI scannen. Onvoldoende Kaede moet worden photoconverted in de ROI, scan de 405 nm laser over het gebied drie keer opnieuw. Herhaal deze stap voor alle ROIs.</li>
	<li>Keren naar de modus "TCS SP8" op de software en het verwerven van een z-stack, met behulp van de 561 nm en 488 nm lasers opeenvolgend. Zorg ervoor dat de optie 'bidirectionele' imaging snelheid te verhogen. Opmerking: Hoe lang het duurt om photoconvert en beeld die elk embryo varieert. Hartslag is bekend dat belangrijk is voor normaal hart ventiel ontwikkeling, dus vermijden houden het hart gestopt voor meer dan 30 min, zelfs als dat betekent dat u geen tijd om te photoconvert alle 5 embryo's. Opmerking: Tijdens het photoconversion gebruik bet detectoren, terwijl als photoconversion, wordt het aangeraden om te gebruiken hybride detectoren ingesteld op 'tellen' modus. Dit is omdat de hybride detectoren gevoeliger zijn en geschikt zijn voor het produceren van betere kwaliteitsbeelden, maar zijn gemakkelijk beschadigd door overmatige blootstelling.</li>
</ol>5. unmounting photoconverted embryo 's
<ol><li>Na photoconversion, kunt een glazen pipet ingedrukt licht net boven het hoofd van het embryo te breken de LMP agarose, dan zachtjes zuigen op het embryo.<ol>
<li>Het werpen van het embryo van de glazen pipet in een 35-mm petrischaal met embryo medium met FTU (weg te wassen met middellange BDM).</li>
		<li>De embryo transfer naar een goed in een 6-well plaat met embryo medium met FTU. Tijdens deze stap, zorg ervoor om te houden van nota van welke embryo gaat in die Nou, zoals dit essentieel is voor de positie van photoconverted cellen op later ontwikkelingsstadia correleren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nu dat de embryo's worden verwijderd uit het BDM met medium, beginnen hun hart weer in ongeveer 5 min. terugkeer embryo's het donker bij 28,5 ° C om embryo's te blijven ontwikkelen normaal te verslaan.</li>
</ol>6. imaging photoconverted cellen in later embryonale stadia
<ol><li>De gewenste stadium, het hart stoppen en opnieuw insluiten van de embryo's zoals onder stap 3 van dit protocol, met het belangrijke verschil dat de embryo's moeten worden behandeld met BDM in afzonderlijke, duidelijke gerechten om embryo's bij te houden.</li>
	<li>Voor embryo's tot 62 hpf, verwerven van z-stacks van het endocard met behulp van 561 nm en 488 nm voor rode en groene TL-signalen, respectievelijk. Voor embryo's in stadia ouder dan 62 hpf, gebruik een multiphoton laser ingesteld op 940 nm tot beeld van groene Kaede in plaats van de 488 nm laser.</li>
</ol>7. beeldanalyse voor embryo's onder 48 hpf
Opmerking: Weefsel bewegingen van de AVC moeilijk kunnen zijn om te analyseren als gevolg van de complexe driedimensionale structuur. Om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted gebied in de AVC tussen twee niet-photoconverted regio's of de lengte van een niet-photoconverted gebied in de AVC tussen twee photoconverted-regio's, het kan wenselijk zijn te weerspiegelen de driedimensionale structuur op een tweedimensionale kaart. Beelden van photoconverted embryo's verkregen vóór 48 hpf kan worden geanalyseerd met behulp van de volgende methode.
<ol><li>De verworven afbeeldingen in Matlab of soortgelijke software importeren.</li>
	<li>Handmatig de ROI, d.w.z. het endocard, afgebakend en toepassen van een masker om te verwijderen het signaal buiten deze regio.</li>
	<li>De drempel van een intensiteit van toepassing op de afbeelding om de punten op het endocard identificeren en plot ze in drie dimensies. Isoleren van de punten die overeenkomen met het smalste en meest rechte deel van de AVC, door handmatig wissen de punten geen rente over het atrium en het ventrikel met behulp van de opdracht wissen in de software.</li>
	<li>Gebruiken een cilinder past de punten vertegenwoordigen de AVC aldus verkregen.</li>
	<li>Definieer een referentiesysteem om te vergelijken verschillende monsters. Bijvoorbeeld, het aannemen van het massamiddelpunt van de AVC-punten als de oorsprong van het referentiesysteem en de as van de ingerichte cilinder als de z-as.<ol>
<li>Zorg ervoor dat de positieve z-posities altijd correspondeert aan dezelfde kant van het hart (ventriculaire of atriale).</li>
		<li>Project de AVC punten op de x-y vlak en een ellips gebruiken om ze te passen.</li>
		<li>Draai de endocardial punten rond de z-as zo dat de hoofdas van de ovaal en de y-as van het referentiesysteem zijn parallel en positieve y-waarden komen met de interne kant van de AVC ten aanzien van het embryo overeen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om het segment van de AVC, snijd de driedimensionale dataset met sommige vliegtuigen verkregen door het draaien van de halfvlak {y = 0, x > 0} in de z-richting.<ol>
<li>Project van de intensiteit van de aangrenzende pixels op deze vliegtuigen en het endotheel definiëren op een consistente wijze. Bijvoorbeeld handmatig een lijn tekenen van de atriale naar de ventriculaire kant van de AVC bij halve dikte van het endotheel.</li>
		<li>Interpoleren van de punten van de lijnen waarmee het endotheel met een driedimensionale spline met behulp van de werkset spline te vertegenwoordigen de AVC met een oppervlak. Opmerking: Het aantal de knipvlakken bepaalt zowel de nauwkeurigheid van de segmentatie en het verbruik van de tijd van deze stap. 8 vliegtuigen zijn meestal genoeg om goede resultaten te bereiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De azimutale positie van elk punt op het oppervlak van de AVC met behulp van cilindrische coördinaten bepalen.<ol>
<li>Definieer een parametrische kromme langs het oppervlak van de AVC door het berekenen van de booglengte op de oppervlakte tussen opeenvolgende punten op elke azimutale positie.</li>
		<li>Voor elke parametrische kromme, definieert u het punt op de curve die zich het dichtst bij het midden van de AVC tot nul. De punten van de AVC zijn dus volledig beschreven door hun azimutale positie en hun positie op de parametrische kromme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontvouwen van de AVC tot een twee-dimensionale afbeelding met behulp van de parametrische positie van de punten.</li>
	<li>De randen van de regio te kwantificeren als de randen van de binaire image drempelmethode de verhouding tussen de intensiteiten van de photoconverted en de niet-photoconverted-kanalen te zoeken. Handmatig het resultaat te corrigeren indien nodig.</li>
	<li>Bereken de booglengte tussen de randen voor het berekenen van de lengte van het weefsel als een functie van de azimutale positie.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, R. W., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+photoresponsive+protein+technologies+applications+in+vivo%3A+a+spotlight+on+zebrafish+developmental+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology.</a> F1000Res. 6, (2017).</li>
<li>Sehnert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponin+T+is+essential+in+sarcomere+assembly+and+cardiac+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility.</a> Nat Genet. 31, 106-110 (2002).</li>
<li>Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+development+of+the+atrioventricular+canal+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish.</a> J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+mechanics+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Blood flow mechanics in cardiovascular development.</a> Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).</li>
<li>Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+driven+cardiac+valve+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>Boselli, F., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+modeling+for+shear+stress+quantification+in+the+embryonic+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>Steed, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((klf2a+couples+mechanotransduction+and+zebrafish+valve+morphogenesis+through+fibronectin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis.</a> Nat Commun. 7, 11646(2016).</li>
<li>Herwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+mechanisms+of+blood+vessel+fusion+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo.</a> Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).</li>
<li>Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+shear+stress+patterns+predict+the+orientation+of+convergent+tissue+movements+in+the+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart.</a> Development. , (2017).</li>
<li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+Using+Photoconvertible+Proteins+During+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="NULL">Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Pestel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+3D+visualization+of+cellular+rearrangements+during+cardiac+valve+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation.</a> Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), e0134005(2015).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton-evoked+color+change+of+DsRed+as+an+optical+highlighter+for+cellular+and+subcellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling.</a> Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).</li>
<li>Dempsey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+labeling+by+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell labeling by confined primed conversion.</a> Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).</li>
<li>Mohr, M. A., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+morphology+in+vivo+with+confined+primed+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion.</a> Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cellular+structures+in+vivo+using+confined+primed+conversion+of+photoconvertible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).</li>
<li>Mohr, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Engineering+of+Photoconvertible+Fluorescent+Proteins+for+Dual-Color+Fluorescence+Nanoscopy+Enabled+by+a+Triplet-State+Mechanism+of+Primed+Conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).</li>
<li>Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhOTO+zebrafish%3A+a+transgenic+resource+for+in+vivo+lineage+tracing+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration.</a> PLoS One. 7 (3), e32888(2012).</li>
<li>Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+using+PhOTO+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).</li>
</ol>

Geen belangenconflict verklaard.

Timing van photoconversion: Hoewel Kaede blijft helder uitgedrukt in EdCs zelfs bij 96 hpf, opgemerkt moet worden dat als het embryo groeit, laserlicht meer diffundeert voordat zij de AVC tot, beperkte photoconversion van Kaede moeilijker te maken. At embryonale stadia later dan 55 hpf, het ballonvaren van het ventrikel en het atrium betekent ook dat de paarse laserstraal gebruikt voor photoconversion AVC cellen zonder eerste doorsnijdt het atrium of de ventrikel niet bereiken. Dit betekent dat voorbij 55 hpf, o...

De zebravis is momenteel een van de belangrijkste gewervelde modellen om te studeren cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen in vivo. Dit is grotendeels te wijten aan de de zebravis optische transparantie en inschikkelijkheid aan genetics, waardoor het een krachtig model voor de toepassing van optische technieken met genetisch photoresponsive eiwit technologieën1gecodeerd. Specifiek voor de studie van hart ontwikkeling, zebravis ontvangen voldoende zuurstof via diffusie zodanig dat zelfs mutanten zonder hartslag kunnen overleven door middel van de eerste week van ontwikkeling, het toelaat van analyses over de gevolgen van ontwikkelingsstoornissen genen en verstoord doorbloeding op hart voedselproductie niet mogelijk is in de meeste gewervelde dieren2.
De zebravis hart buis wordt gevormd door 24 uur bericht bevruchting (hpf). Kort na haar oprichting begint de hart-buis actief te verslaan. Door 36 hpf, een duidelijke vernauwing scheidt het atrium van het ventrikel. Deze regio van de vernauwing wordt aangeroepen op een cuboidal morfologie3de atrioventriculaire kanaal (AVC), en de cellen in deze regio wijziging vanuit een squamous morfologie. Zebravis Atrioventriculaire ventiel morfogenese begint ongeveer 48u post bevruchting. Door 5 dagen na de bevruchting, twee ventiel folders uit te breiden naar de AVC en de terug stroom van bloed vanuit het ventrikel aan het atrium tijdens de cardiale cyclus4voorkomen. Bijhouden van cellen tijdens de vorming van AVC en ventiel is een uitdaging zoals de snelle kloppen van het hart maakt het moeilijk om te volgen van cellen via traditionele time-lapse microscopie5,6. Dit protocol, aangepast van Steed et al., 20167, beschrijft een methode die gebruikmaakt van de GS (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafish transgene lijn, waarin de photoconvertible proteïne Kaede wordt uitgedrukt in endotheliale cellen, met inbegrip van het endocard. De drug 2,3-butaandion-2-monoxime (DTB) wordt gebruikt om tijdelijk stoppen met het hart gewonnen, waardoor nauwkeurige photoconversion van EdCs tussen 36 en 55 hpf en hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op specifieke tijdstippen voor ontwikkelingsstoornissen. Het is eerder aangetoond dat EdCs photoconverted using zulks werkwijze voor vijf dagen of meer na de tijd van photoconversion7te onderscheiden van hun onbekeerde buren kan blijven. Dit protocol gegevens ook een methode die wordt gebruikt voor beeldanalyse van photoconverted EdCs in embryo's jonger dan 48 hpf, die met succes is gebruikt om het weefsel bewegingen volgen tijdens AVC ontwikkeling (Boselli et al., in druk)9. Wij hopen dat lezers dit protocol nuttig vindt zou voor de studie van AVC en ventiel ontwikkeling in normale embryo's, en mutanten, morphants of drug-behandelde embryo's. Voor een meer algemene protocol betreffende cel bijhouden met behulp van photoconvertible eiwitten tijdens de ontwikkeling van de zebravis, te bekijken gelieve het artikel door Lombardo et al., 201210.

<table><tbody><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Noodzakelijke apparatuur voor het fokken van vissen en het verzamelen van eieren (zie het Zebrafish Book22 voor details).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rechtopstaande confocale microscoop (Uitgerust met lasers die werken op 488 nm, 561 nm en 405 nm, een instelbare multifoton laser en een Leica HCX IRAPO L, 25 &times;, N.A. 0.95 objectief)</td><td>Leica</td><td>Leica SP8</td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>ThermoScientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm weefselkweekschaal</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 wel plaat</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Tricaine stockoplossing&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure lage smeltpunt agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PTU (1-fenyl-2-thioureum)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium: 30x stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab uitgerust met de Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 mg/mL Tricaine stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mg tricainepoeder (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonzuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Danieau</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pas aan naar pH 7, verdeel in portieën en bewaar bij -20 &deg;C&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M BDM stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112135</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verdeel in portieën en bewaar bij -20 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium: 30x stockoplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50.7 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>0.78 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>1.47 g Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>2.1 g Calciumnitriet tetrahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13477-34-4</td><td></td></tr><tr><td>19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Pas aan naar pH 7.2 en bewaar op kamertemperatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlasCLEAR hars</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plus 39&nbsp;Freeform Pico 3D printer</td><td>Asiga</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

volgende endocardial weefsel mutaties via de cel photoconversion in het embryo van de zebravis

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Tijdens de embryogenese, cellen ondergaan dynamische veranderingen in het gedrag van de cel, en ontcijferen van de cellulaire logica achter deze veranderingen is een fundamentele doelstelling op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. De ontdekking en ontwikkeling van photoconvertible eiwitten hebben ons begrip van deze dynamische veranderingen sterk geholpen door het verstrekken van een methode om optisch Markeer cellen en weefsels. Terwijl photoconversion, time-lapse microscopie en latere beeldanalyse hebben bewezen als zeer succesvol in het blootleggen cellulaire dynamiek in organen zoals de hersenen of het oog, wordt deze aanpak echter in het algemeen niet gebruikt in de ontwikkelingslanden hart wijten aan uitdagingen van de snelle beweging van het hart tijdens de cardiale cyclus. Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel beschrijft een methode voor photoconverting en vervolgens endocardial cellen (EdCs) bijhouden tijdens zebrafish Atrioventriculaire kanaal (AVC) en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling. Bij deze methode wordt tijdelijk stoppen van het hart met een geneesmiddel om nauwkeurige photoconversion plaatsvinden. Harten zijn toegestaan om te hervatten gewonnen na verwijdering van de drug en de embryonale ontwikkeling blijft normaal totdat het hart weer voor hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op een moment later ontwikkelings tijd wordt gestopt. Het tweede deel van het protocol beschrijft een methode van de analyse van het beeld om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted of niet-photoconverted gebied in de AVC in jonge embryo's door het toewijzen van het fluorescerende signaal van de driedimensionale structuur naar een tweedimensionale kaart . Samen, de twee delen van het protocol kan men de oorsprong en werking van cellen waaruit de zebravis AVC en Atrioventriculaire hartklep, en potentieel kan worden toegepast voor het bestuderen van mutanten, morphants of embryo's die zijn behandeld met te onderzoeken reagentia die AVC en/of klep ontwikkeling verstoren.

Een voorbeeld van een embryo photoconverted op 48 hpf en beeld weer bij 80 hpf wordt weergegeven in Figuur 2, films 1 en 2. Kaede bloot aan licht van 405 nm onherroepelijk bekeerlingen van de eiwitten uit zijn fluorescente groene vorm aan fluorescerende rode vorm, waardoor het gedrag van cellen die zijn gemarkeerd met de groene of de rode vorm moet worden gevolgd met betrekking tot hun differentieel gekleurde buren tijdens de...

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Het algemene doel van deze procedure is om endocardiale cellen te volgen tijdens de vorming van de atrioventriculaire kanaal en hartklep. Deze methode kan helpen om sleutelvragen in het veld van hartontwikkeling aan te pakken, zoals het begrijpen hoe endocardiale cellen zich gedragen in verschillende soorten mutanten. Het volgen van cellen tijdens de AVC- en klepvorming is uitdagend vanwege de snelle hartslag.Het maakt het moeilijk om cellen te volgen via traditionele time-lapse microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het enkele van deze moeilijkheden omzeilt. De procedure zal worden gedemonstreerd door Renee, een postdoc in mijn lab.Na het maken van een mal volgens het tekstprotocol, pipet ongeveer 1,5 milliliter gesmolten 1%-agarose in een 35-millimeter plastic montageschaal. Plaats vervolgens de plastic mal in de vloeibare agarose, zorg ervoor dat er geen lucht tussen de mal en de agarose komt. Plaats de schaal op vier graden Celsius totdat de agarose hard wordt.Verwijder vervolgens de plastic mal uit de agarose. Voeg vervolgens twee milliliter van eerder bereid montagemedium toe aan de montageschaal en laat 15 tot 30 minuten de tijd om de oplossing in de agarose te laten diffunderen. Ondertussen smelt je een milliliter aliquot van 0,7% lage smeltpunt, of LMP, agarose door de buis in een 70-graad Celsius hitteblok te plaatsen gedurende ongeveer vijf minuten.Pipet de LMP agarose op en neer om het iets af te koelen. Voeg vervolgens 25 microliter van acht milligram per milliliter tricaine en 40 microliter van een molaar BDM oplossing toe aan de buis. Mix door op en neer te pipetten.Breng vervolgens de buis over naar een 38-graad Celsius hitteblok om de LMP agarose in zijn vloeibare toestand te houden. Breng de embryo's over naar een aparte schaal met twee milliliter montagemedium. Vervolgens, wanneer de harten zijn gestopt met kloppen, breng de embryo's over naar de montageschaal en gebruik pincetten om ze in de putjes te rangschikken zodat ze in een hoek van 25 graden liggen, staarten gericht naar het diepere deel van de put, met de dooier naar boven.Wanneer de embryo's ruwweg op hun plaats zitten, verwijder je het medium en bedden ze in ongeveer 200 microliter 0,7% LMP agarose met tricaine en BDM. Pas vervolgens de embryo-posities aan, kantel ze naar links of rechts indien nodig. Druk op de wanden van het ingedrukte vierkant om overtollig agarose naar de zijgebieden van de montageschaal te laten overstromen.Wacht ongeveer vijf minuten totdat de LMP agarose hard is geworden en voeg dan montagemedium toe aan de schaal. De embryo's zijn nu klaar om te worden fotogeconverteerd. Om fotoconversie uit te voeren, gebruikt u op een rechtopstaande confocale microscoop die is uitgerust met 405, 488 en 561-nanometer laserbronnen, getransmitteerd wit licht en een objectieflens om het hart van de embryo te lokaliseren.Gebruik de 561-nanometer laser om te controleren op rode Kaede-fluorescentie. Gebruik vervolgens de 488-nanometer laser om het endocardium te visualiseren. Vervolgens, op de software voor microscopenaankoop, voer FRAP-modus in.Selecteer vervolgens ongeveer 1% laservermogen voor zowel de 488 als de 561-nanometer lasers. Terwijl u zich concentreert op het gebied van belang, selecteert u een gebied van belang, of ROI. Gebruik vervolgens de 405-nanometer diodelaser met 25% laservermogen om de cellen fotogeconverteerd te maken, door drie keer over de ROI te scannen.Als er onvoldoende Kaede in het ROI fotogeconverteerd is, scan dan de 405-nanometer laser opnieuw drie keer over het gebied. Keer terug naar de TCS SP8-modus op de software en gebruik vervolgens de 561 en 488-nanometer lasers achter elkaar, in bidirectionele modus, om een Z-stack te verkrijgen. Na fotoconversie, gebruik een glazen pipet om lichtjes naar beneden te drukken net boven het hoofd van het embryo om de LMP agarose te breken.Zuig vervolgens voorzichtig het embryo op. Om het BDM-bevattende medium weg te spoelen, spuit het embryo uit de glazen pipet in een 85-millimeter petrischaal met embryomedium met PTU. Breng het embryo over naar een putje in een zes-putjesplaat met embryomedium met PTU.Tijdens deze stap, zorg ervoor om op te schrijven welk embryo in welke putje gaat, omdat dit essentieel is om de positie van fotogeconverteerde cellen in latere ontwikkelingsstadia te correleren. Nu de embryo's zijn verwijderd uit het BDM-bevattende medium, zouden hun harten weer moeten beginnen te kloppen in ongeveer vijf minuten. Breng de embryo's terug in het donker op 28,5 graden Celsius om ze normaal te laten ontwikkelen.In het gewenste stadium, stop het hart en bedden de embryo's opnieuw in, zoals eerder in deze video is gedemonstreerd, met het belangrijke verschil dat de embryo's behandeld moeten worden met BDM in afzonderlijke, gemarkeerde schalen om ze bij te houden. Voor embryo's tot 62 hpf, verwerf Z-stacks van het endocardium met behulp van 561 en 488 nanometer voor rode en groene fluorescente signalen, respectievelijk. Voor embryo's ouder dan 62 hpf, gebruik een multifotonlaser ingesteld op 940 nanometer om groene Kaede te beeldvormen in plaats van de 488-nanometer laser.Voor embryo's jonger dan 48 hpf is het mogelijk om de driedimensionale AVC op een tweedimensionaal beeld te projecteren voor analyse. Eerst, drempel de afbeelding. Wis vervolgens punten weg die buiten het hart liggen.Om handmatige segmentatie uit te voeren, richt de afbeelding aan de linkerkant zodat deze overeenkomt met de afbeelding aan de rechterkant. Segmenteer de zijkant van het hart waar de oranje vector doorheen gaat en voeg punten toe in de richting van de blauwe vector. Interpoleer vervolgens de doorsneden en projecteer de kleurintensiteit op het oppervlak.Vervolgens, pas de oriëntatie van de AVC aan en projecteer deze op een 2D-oppervlak. Een voorbeeld van een embryonaal hart net na fotoconversie bij 48 hpf wordt hier getoond. Cytoplasmatisch Kaede in verschillende cellen van de superieure kant van de

following-endocardial-tissue-movements-via-cell-photoconversion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.

Light Sheet Microscopie van snelle hartdynamica in zebravisembryo's

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Dit protocol beschrijft een goedkope lichtmicroscopiemethode om de cardiale morfologie en functie in zebravisembryo's te beoordelen, waardoor een reproduceerbare evaluatie van ontwikkelingscardiotoxiciteit mogelijk is zonder dat er geavanceerde beeldvormingssystemen nodig zijn.

Functionele cardiale beeldvorming in zebravisembryo's met behulp van standaardmicroscopie en videoanalyse: toepassingen in milieu- en biomedisch onderzoek

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Leer endocardiale cellen volgen tijdens hartklepvorming in levende zebravisembryo's met behulp van Kaede-fotoconversie. Deze methode overwint beperkingen van traditionele tijdverloopmicroscopie door de snelle hartslag.

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Meer video's verkennen