Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW
28 maart 2018
Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.
Het algemene doel van deze methodologie is om op een efficiënte manier transgene planten te genereren die intacte, eenmalige inserties van een transfer-DNA, of T-DNA, dragen. De BIBAC-Gateway-vector is een waardevol hulpmiddel voor het genereren van transgene planten die intacte, eenmalige inserties van interessante sequenties dragen die stabiele genexpressie vertonen. Met de BIBAC-Gateway-vector kan men met minimale inspanning gebruik maken van Gateway-recombinatietechnologie om sequenties van interesse in te voegen.
Alle BIBAC-derivaten, inclusief de BIBAC-Gateway-vectoren, zijn geschikt voor het overbrengen van grote, transgene DNA-fragmenten naar plantengenomen. De BIBAC-GW-vectoren kunnen worden gebruikt om sequenties van interesse in veel plantensystemen in te voegen, zoals maïs, rijst en tomaat. Er zijn twee BIBAC-GW-plasmiden beschikbaar.
Het BIBAC-RFP-GW-plasmide bevat een DsRed-gen dat in zaadmantels wordt geëxpresseerd. Het BIBAC-BAR-GW-plasmide bevat een gen dat weerstand biedt tegen glufosinaat. Beide vectoren bevatten een kanamycine-resistente gen als selectiemarker in bacteriën.
Om de sequenties van interesse in de binaire vector in te voegen, bereidt u eerst de Gateway Entry en binaire vectoren voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om een Gateway-reactie uit te voeren, bereidt u de LR-recombinatiereactie voor volgens de suggesties van de leverancier in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bij kamertemperatuur. Meng 100 tot 300 nanogram van de supergewikkelde Entry-klon en 300 nanogram van de BIBAC-Gateway-vector.
Pas het volume van het mengsel aan op 16 microliters met TE.Voeg vervolgens vier microliters LR Clonase-enzymmix toe en meng door te vortexen. Incubeer het mengsel gedurende één uur op 25 graden Celsius. Beëindig de LR-reactie door twee microliters Proteinase K-oplossing aan het mengsel toe te voegen.
Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius voordat u overgaat tot transformatie in E.coli, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de Arabidopsis-planten voor transformatie voor te bereiden, kweekt u Arabidopsis-planten in een kas of een klimaatgecontroleerde groeikamer tot ze bloeien. Knip de eerste scheuten af om meer secundaire scheuten te laten ontstaan.
Planten zijn klaar voor het dompelen vier tot zes dagen na het knippen, wanneer de planten veel onrijpe bloemhoofden en niet veel bevruchte siliques hebben. Om bloemdompeling uit te voeren, dompelt u de bloeiwijzen gedurende vijf tot tien seconden in Agrobacterium-suspensie. Gebruik zachte agitatie.
Wikt de bovengrondse delen van de planten in klamboefolie om de luchtvochtigheid hoog te houden en bedek de plantenpotten met een doos om de planten in het donker te houden. Incubeer de planten gedurende twee dagen in een kas of groeikamer. Verwijder na twee dagen de doos en de klamboefolie en laat de planten tot rijpheid groeien in een kas of groeikamer.
Om de efficiëntie van de transformatie te verhogen, kunnen dezelfde planten zeven dagen na de eerste dompeling opnieuw worden gedompeld. Vervolgens, wanneer de getransformeerde planten volwassen en droog zijn, oogst u de zaden. Bundel en analyseer de zaden van planten die met dezelfde constructie zijn getransformeerd als een enkele set.
In het geval dat planten worden getransformeerd met een BIBAC-RFP-Gateway-plasmidederivaat, identificeert u transgene planten door de zaden te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie. Om DsRed-expressie in zaadmantels te detecteren, beeld de zaden af bij een excitatie van 560 nanometer en emissie van 600 tot 650 nanometer. Scheid de fluorescerende zaden van niet-fluorescerende tegenhangers met behulp van pincetten.
Om te screenen op transgene planten getransformeerd met een BIBAC-BAR-Gateway-plasmidederivaat, zaait u de zaden in bakken gevuld met aarde. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van zaden over de bakken door zaden te suspenderen in 0,1% agar in 0,5x MS-medium en de zaden te verspreiden met behulp van een pipet van één milliliter. Stimuleer de zaden om op een synchrone manier te ontkiemen door de zaden gedurende ten minste twee dagen bij vier graden Celsius te incuberen.
Dit kan worden gedaan voor of na het zaaien van de zaden. Twee en drie weken na het zaaien van de zaden, besproeit u de zaailingen met 0,5% glufosinaat-ammoniumoplossing. Gebruik 500 milliliter glufosinaat-ammoniumoplossing per vierkante meter.
Breng overlevende zaailingen over naar potten. Analyseer de glufosinaat-ammoniumresistente planten door middel van PCR op de aanwezigheid van de constructie van belang. Bepaal het aantal T-DNA-integraties en hun integriteit door DNA-blotting met behulp van restrictie-enzymen.
Deze methode maakt identificatie mogelijk van zowel enkele als herhaalde integraties op dezelfde of verschillende loci in het genoom. Gebruik een reeks restrictiedigesties om de verschillende mogelijke integratiepatronen te identificeren. Selecteer een enzym dat eenmaal in het midden van de T-DNA snijdt, om sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de restrictieplaats onafhankelijk te kunnen onderzoeken.
Selecteer ook een enzym of combinatie van enzymen die de hele sequentie van interesse in één keer uitsnijden. Zorg ervoor dat u alleen restrictie-enzymen gebruikt die niet gevoelig zijn voor cytosinemethylering. Na het uitvoeren van DNA-blotting, zoals beschreven in het tekstprotocol, voert u blot-analyse uit.
De analyse hangt af van de gebruikte restrictiestrategie. Bij het analyseren van de blot met de strategie met één restrictieplaats in het midden van de T-DNA, telt u het aantal gedetecteerde fragmenten. In deze strategie suggereert het aantal gehybridiseerde fragmenten het aantal T-DNA-integraties.
Vergelijk het aantal gedetecteerde fragmenten met een sonde voor de linker- en rechterkant van de T-DNA. Als er een verschillend aantal hybridiserende fragmenten wordt gedetecteerd met de twee sondes, dan zijn er ofwel meerdere T-DNA-integraties in een omgekeerde herhaling of onvolledig geïntegreerde T-DNA's aanwezig. Om tandem- en omgekeerde arrangementen van de T-DNA's te identificeren,
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het genereren van transgene planten met intacte, single-copy inserties van T-DNA met behulp van de BIBAC-Gateway vector. De beschreven protocollen faciliteren de efficiënte creatie en het testen van transgene Arabidopsis-planten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Plantenbiotechnologie
- Genetische modificatie
- Transgeen onderzoek
Achtergrond
- De BIBAC-Gateway-vector maakt de insertie van grote DNA-fragmenten in plantgenomen mogelijk.
- Stabiele genexpressie is cruciaal voor de functionaliteit van transgene planten.
- Gateway-recombinatietechnologie vereenvoudigt het proces van DNA-insertie.
- Deze methodologie kan worden toegepast op diverse plantsystemen, waaronder maïs, rijst en tomaat.
Doel van de studie
- Om een gestroomlijnde aanpak te bieden voor het genereren van transgene planten.
- Om de integriteit en het kopie-aantal van DNA-inserties in transgene planten te waarborgen.
- Om de efficiëntie van planttransformatietechnieken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van BIBAC-Gateway binaire vectoren.
- Protocollen voor het genereren van transgene Arabidopsis-planten.
- Testmethoden voor het beoordelen van de integriteit van het insert en het kopieaantal.
- Toepassing van Gateway-recombinatietechnologie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van transgene planten met intacte, single-copy inserties.
- Aangetoonde stabiliteit van genexpressie in transgene lijnen.
- De verstrekte protocollen zijn effectief voor diverse plantensoorten.
- Facilitering van de insertie van grote DNA-fragmenten in plantgenomen.
Conclusies
- De BIBAC-Gateway-vector is een krachtig instrument voor genetische modificatie van planten.
- Efficiënte methodologieën kunnen de ontwikkeling van transgene planten aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere plantensystemen buiten Arabidopsis.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Stabiele integratie van een transgen in een enkele kopie is cruciaal voor betrouwbare expressie van eigenschappen en functionele genomica in biotechnologische pijplijnen voor planten. Het BIBAC-GW binaire vectorsysteem maakt de efficiënte generatie en identificatie van transgene planten met intacte, enkelvoudige kopie-inserties mogelijk, waardoor het risico op gene silencing wordt verminderd en robuuste downstream-analyses worden ondersteund. Deze mogelijkheid versterkt de vroege ontdekking, target-validatie en translationeel onderzoek in portfolio's voor de ontwikkeling van gewaseigenschappen en synthetische biologie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse van genfuncties mogelijk door middel van stabiele expressie van een transgene kopie.
- Vermindert storende effecten van meerkopie-inserties en gensilencing in functionele studies.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de integriteit en het kopiegetal van genetische modificaties te waarborgen.
- Faciliteert betrouwbare targetvalidatie in plantensystemen die relevant zijn voor de ontdekking van eigenschappen.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare workflow voor het genereren van gevalideerde transgene lijnen voor fenotypische screening.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van transgene expressie en integratie mogelijk via DNA-blotting en PCR.
- Standaardiseert selectie met behulp van fluorescentie- of herbicideresistentiemarkers voor efficiënte screening.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen of kenmerken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door een consistente expressie van het transgen over verschillende lijnen heen te waarborgen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische trait-validatie in diverse gewasmodellen.
- Vermindert biologische risico's in een laat stadium door onbedoelde genetische herschikkingen te minimaliseren.
- Maakt een risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van kandidaat-traits mogelijk op basis van de integratiekwaliteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in de plantbiotechnologische pijplijn, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinische validatie van eigenschappen, ter ondersteuning van zowel hypothese-gestuurde als translationele onderzoeksdoelstellingen.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten en het verduidelijken van signaalpaden door stabiele genexpressie in transgene planten mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de selectie en validatie van transgene events.
- Analytiek: Biedt robuuste DNA-blotting en PCR-gebaseerde metingen om het integratieaantal en de integriteit te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Waarborgt de continuïteit van eigenschappen en de stabiliteit van de expressie over verschillende plantgeneraties en modellen heen.
- Bedrijfsmatige hergebruikbaarheid: Biedt een schaalbaar, herbruikbaar vectorplatform dat aanpasbaar is aan meerdere plantensoorten en doeleigenschappen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de kenmerkfunctie en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de generatie van transgene planten.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door gene silencing en onvolledige integraties te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van kenmerkcandidaat mogelijk op basis van metrieken voor integratiekwaliteit.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in plantentransformatie, moleculaire klonering en DNA-blottinganalyse.
- Toegang tot groeikamers, fluorescentiemicroscopie en instrumentatie voor moleculaire biologie is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van selectie- en screeningsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan diverse plantensoorten, hoewel de transformatie-efficiëntie per systeem kan variëren.
- Een lagere transformatie-efficiëntie dan bij sommige binaire vectoren maakt een voldoende hoge monsterdoorvoer noodzakelijk.
Veelgestelde vragen over Biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Inserting Sequences of Interest into BIBAC-GW Binary Vector
2:37
Arabidopsis Transformation
5:37
Characterizing Transgenics for the Number and Integrity of T-DNA Integrations
8:19
Results: Analysis of the Number of T-DNA Insertions in Plants Transformed with BIBAC-Bar-GW Carrying a Reporter Sequence
10:01
Conclusion
