Genereren van transgene planten met Single-kopie invoegen met behulp van de binaire Vector BIBAC-GW
March 28th, 2018
Met behulp van een pBIBAC-GW binaire vector maakt genereren van transgene planten met intact single-kopie invoegingen, een eenvoudig proces. Hier is een reeks van protocollen die leiden de lezer door het proces van het genereren van transgene planten van Arabidopsis en testen van de planten voor INTACTHEID en aantal kopieën van de inserts gepresenteerd.
Het algemene doel van deze methodologie is om op een efficiënte manier transgene planten te genereren die intacte, eenmalige inserties van een transfer-DNA, of T-DNA, dragen. De BIBAC-Gateway-vector is een waardevol hulpmiddel voor het genereren van transgene planten die intacte, eenmalige inserties van interessante sequenties dragen die stabiele genexpressie vertonen. Met de BIBAC-Gateway-vector kan men met minimale inspanning gebruik maken van Gateway-recombinatietechnologie om sequenties van interesse in te voegen.
Alle BIBAC-derivaten, inclusief de BIBAC-Gateway-vectoren, zijn geschikt voor het overbrengen van grote, transgene DNA-fragmenten naar plantengenomen. De BIBAC-GW-vectoren kunnen worden gebruikt om sequenties van interesse in veel plantensystemen in te voegen, zoals maïs, rijst en tomaat. Er zijn twee BIBAC-GW-plasmiden beschikbaar.
Het BIBAC-RFP-GW-plasmide bevat een DsRed-gen dat in zaadmantels wordt geëxpresseerd. Het BIBAC-BAR-GW-plasmide bevat een gen dat weerstand biedt tegen glufosinaat. Beide vectoren bevatten een kanamycine-resistente gen als selectiemarker in bacteriën.
Om de sequenties van interesse in de binaire vector in te voegen, bereidt u eerst de Gateway Entry en binaire vectoren voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om een Gateway-reactie uit te voeren, bereidt u de LR-recombinatiereactie voor volgens de suggesties van de leverancier in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter bij kamertemperatuur. Meng 100 tot 300 nanogram van de supergewikkelde Entry-klon en 300 nanogram van de BIBAC-Gateway-vector.
Pas het volume van het mengsel aan op 16 microliters met TE.Voeg vervolgens vier microliters LR Clonase-enzymmix toe en meng door te vortexen. Incubeer het mengsel gedurende één uur op 25 graden Celsius. Beëindig de LR-reactie door twee microliters Proteinase K-oplossing aan het mengsel toe te voegen.
Meng en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius voordat u overgaat tot transformatie in E.coli, zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de Arabidopsis-planten voor transformatie voor te bereiden, kweekt u Arabidopsis-planten in een kas of een klimaatgecontroleerde groeikamer tot ze bloeien. Knip de eerste scheuten af om meer secundaire scheuten te laten ontstaan.
Planten zijn klaar voor het dompelen vier tot zes dagen na het knippen, wanneer de planten veel onrijpe bloemhoofden en niet veel bevruchte siliques hebben. Om bloemdompeling uit te voeren, dompelt u de bloeiwijzen gedurende vijf tot tien seconden in Agrobacterium-suspensie. Gebruik zachte agitatie.
Wikt de bovengrondse delen van de planten in klamboefolie om de luchtvochtigheid hoog te houden en bedek de plantenpotten met een doos om de planten in het donker te houden. Incubeer de planten gedurende twee dagen in een kas of groeikamer. Verwijder na twee dagen de doos en de klamboefolie en laat de planten tot rijpheid groeien in een kas of groeikamer.
Om de efficiëntie van de transformatie te verhogen, kunnen dezelfde planten zeven dagen na de eerste dompeling opnieuw worden gedompeld. Vervolgens, wanneer de getransformeerde planten volwassen en droog zijn, oogst u de zaden. Bundel en analyseer de zaden van planten die met dezelfde constructie zijn getransformeerd als een enkele set.
In het geval dat planten worden getransformeerd met een BIBAC-RFP-Gateway-plasmidederivaat, identificeert u transgene planten door de zaden te analyseren met behulp van fluorescentiemicroscopie. Om DsRed-expressie in zaadmantels te detecteren, beeld de zaden af bij een excitatie van 560 nanometer en emissie van 600 tot 650 nanometer. Scheid de fluorescerende zaden van niet-fluorescerende tegenhangers met behulp van pincetten.
Om te screenen op transgene planten getransformeerd met een BIBAC-BAR-Gateway-plasmidederivaat, zaait u de zaden in bakken gevuld met aarde. Zorg voor een gelijkmatige verdeling van zaden over de bakken door zaden te suspenderen in 0,1% agar in 0,5x MS-medium en de zaden te verspreiden met behulp van een pipet van één milliliter. Stimuleer de zaden om op een synchrone manier te ontkiemen door de zaden gedurende ten minste twee dagen bij vier graden Celsius te incuberen.
Dit kan worden gedaan voor of na het zaaien van de zaden. Twee en drie weken na het zaaien van de zaden, besproeit u de zaailingen met 0,5% glufosinaat-ammoniumoplossing. Gebruik 500 milliliter glufosinaat-ammoniumoplossing per vierkante meter.
Breng overlevende zaailingen over naar potten. Analyseer de glufosinaat-ammoniumresistente planten door middel van PCR op de aanwezigheid van de constructie van belang. Bepaal het aantal T-DNA-integraties en hun integriteit door DNA-blotting met behulp van restrictie-enzymen.
Deze methode maakt identificatie mogelijk van zowel enkele als herhaalde integraties op dezelfde of verschillende loci in het genoom. Gebruik een reeks restrictiedigesties om de verschillende mogelijke integratiepatronen te identificeren. Selecteer een enzym dat eenmaal in het midden van de T-DNA snijdt, om sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de restrictieplaats onafhankelijk te kunnen onderzoeken.
Selecteer ook een enzym of combinatie van enzymen die de hele sequentie van interesse in één keer uitsnijden. Zorg ervoor dat u alleen restrictie-enzymen gebruikt die niet gevoelig zijn voor cytosinemethylering. Na het uitvoeren van DNA-blotting, zoals beschreven in het tekstprotocol, voert u blot-analyse uit.
De analyse hangt af van de gebruikte restrictiestrategie. Bij het analyseren van de blot met de strategie met één restrictieplaats in het midden van de T-DNA, telt u het aantal gedetecteerde fragmenten. In deze strategie suggereert het aantal gehybridiseerde fragmenten het aantal T-DNA-integraties.
Vergelijk het aantal gedetecteerde fragmenten met een sonde voor de linker- en rechterkant van de T-DNA. Als er een verschillend aantal hybridiserende fragmenten wordt gedetecteerd met de twee sondes, dan zijn er ofwel meerdere T-DNA-integraties in een omgekeerde herhaling of onvolledig geïntegreerde T-DNA's aanwezig. Om tandem- en omgekeerde arrangementen van de T-DNA's te identificeren,
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methodologie voor het genereren van transgene planten met intacte, single-copy invoegingen van T-DNA met behulp van de BIBAC-Gateway vector. De beschreven protocollen vergemakkelijken de efficiënte creatie en testen van transgene Arabidopsis planten.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Plantenbiotechnologie
- Genetische manipulatie
- Transgeen onderzoek
Achtergrond
- De BIBAC-Gateway vector maakt de invoeging van grote DNA-fragmenten in plantengenoom mogelijk.
- Stabiel genexpressie is cruciaal voor de functionaliteit van transgene planten.
- Gateway recombinatietechnologie vereenvoudigt het proces van DNA-invoeging.
- Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende plantensystemen, inclusief maïs, rijst en tomaat.
Doel van het onderzoek
- Om een gestroomlijnde aanpak te bieden voor het genereren van transgene planten.
- Om de integriteit en kopienummer van DNA-invoegingen in transgene planten te waarborgen.
- Om de efficiëntie van plantentransformatietechnieken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van BIBAC-Gateway binaire vectoren.
- Protocollen voor het genereren van transgene Arabidopsis planten.
- Testmethoden voor het beoordelen van invoegintegriteit en kopienummer.
- Toepassing van Gateway recombinatietechnologie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van transgene planten met intacte, single-copy invoegingen.
- Aangetoonde stabiliteit van genexpressie in transgene lijnen.
- De geleverde protocollen zijn effectief voor verschillende plantensoorten.
- Vereenvoudigde de invoeging van grote DNA-fragmenten in plantengenoom.
Conclusies
- De BIBAC-Gateway vector is een krachtig hulpmiddel voor plantengenetische manipulatie.
- Efficiënte methodologieën kunnen de ontwikkeling van transgene planten aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere plantensystemen buiten Arabidopsis.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Stable, single-copy transgene integration is critical for reliable trait expression and functional genomics in plant biotechnology pipelines. The BIBAC-GW binary vector system enables efficient generation and identification of transgenic plants with intact, single-copy insertions, reducing gene silencing risk and supporting robust downstream analyses. This capability strengthens early discovery, target validation, and translational research in crop trait development and synthetic biology portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of gene function through stable, single-copy transgene expression.
- Reduces confounding effects of multi-copy insertions and gene silencing in functional studies.
- Supports mechanistic de-risking by ensuring integrity and copy number of genetic modifications.
- Facilitates confident target validation in plant systems relevant to trait discovery.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible workflow for generating validated transgenic lines for phenotypic screening.
- Enables quantitative assessment of transgene expression and integration via DNA blotting and PCR.
- Standardizes selection using fluorescence or herbicide resistance markers for efficient screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound or trait evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by ensuring consistent transgene expression across lines.
- Supports continuity from discovery through preclinical trait validation in diverse crop models.
- Reduces late-stage biological risk by minimizing unintended genetic rearrangements.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate traits based on integration quality.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the plant biotechnology pipeline from early discovery through lead identification and preclinical trait validation, supporting both hypothesis-driven and translational research objectives.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling stable gene expression in transgenic plants.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for selection and validation of transgenic events.
- Analytics: Provides robust DNA blotting and PCR-based measurements to assess integration number and integrity.
- Translational Research: Ensures trait continuity and expression stability across plant generations and models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable vector platform adaptable to multiple plant species and trait targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in trait function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines standardization, reproducibility, and scalability of transgenic plant generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing gene silencing and incomplete integrations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of trait candidates based on integration quality metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transformation, molecular cloning, and DNA blotting analysis.
- Needs access to growth chambers, fluorescence microscopy, and molecular biology instrumentation.
- Demands cross-team standardization of selection and screening protocols for reproducibility.
- Adaptable to various plant species but transformation efficiency may vary by system.
- Lower transformation efficiency than some binary vectors necessitates sufficient sample throughput.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:00
Inserting Sequences of Interest into BIBAC-GW Binary Vector
2:37
Arabidopsis Transformation
5:37
Characterizing Transgenics for the Number and Integrity of T-DNA Integrations
8:19
Results: Analysis of the Number of T-DNA Insertions in Plants Transformed with BIBAC-Bar-GW Carrying a Reporter Sequence
10:01
Conclusion
