Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Het algemene doel van dit protocol is om hoogwaardige kopieën te genereren van de geordende, niet-redundante transposon-mutantenbibliotheek van de Pseudomonas aeruginosa-stam PA14, aangeduid als de PA14NR-set. Dit protocol behoudt de integriteit van de PA14NR-set tijdens replicatie, waardoor hoogwaardige kopieën van deze bibliotheek worden gegenereerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gedetailleerde beschrijving geeft van alle stappen die betrokken zijn bij bibliotheekreplicatie, kwaliteitscontrole en juiste opslag van individuele mutanten.

Hoewel dit protocol is ontworpen om de P14NR-set te repliceren, kan het worden aangepast om andere bacteriebibliotheken te repliceren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege het risico op besmetting tijdens het replicatieproces. Daarom biedt dit protocol gedetailleerde stapsgewijze instructies om dat risico te verminderen.

Ons laboratorium distribueert de PA14NR-set aan de wereldwijde wetenschappelijke gemeenschap. En we bevelen aan dat de bibliotheken worden gerepliceerd door de eindgebruiker. Om begeleiding te bieden, bieden we een protocol dat in detail beschrijft hoe u hoogwaardige kopieën van de bibliotheek kunt genereren.

Visuele demonstratie van dit protocol is cruciaal, vooral de stappen die zijn ontworpen om kruisbesmetting te voorkomen. Voor zelfbescherming, evenals bescherming van de bacterieculturen, moet altijd een laboratoriumjas, handschoenen en een masker worden gedragen bij het hanteren van de niet-redundante transposon-insertiemutante bibliotheek van P aeruginosa-stam PA14, aangeduid als PA14NR-set. Bereid LB Agar platen voor door ongeveer 60 milliliter gesmolten LB-agar in rechthoekige platen te gieten.

Laat de platen ongeveer een uur drogen in een steriele kap voor gebruik. Creëer een steriele werkruimte met een Bunsenbrander op een met ethanol afgeveegde werktafel. En zet containers op met geschikte oplossingen voor de sterilisatiesterilisator van de pin.

Haal een PA14NR-set masterplate uit de min 80 graden Celsius vriezer en plaats deze op droog ijs in een 4 liter ijsbak. Neem de 96-well masterplate die moet worden gerepliceerd van het droog ijs en plaats deze op de werktafel om kort te laten ontdooien. Lijn de masterplate en de agarplaat uit met de A1-coördinaat van beide platen in de linkerbovenhoek.

Markeer de positie van de A1-coördinaat op de rechthoekige agarplaat. Om de replicator-pins te steriliseren, dompel de pins 30 seconden in 250 milliliter 0,3 tot 0,5% natriumhypochloriet. Tik lichtjes op de replicator om overtollig vocht te verwijderen en dompel de pins 10 seconden in 250 milliliter steriel ultrapuur water, gevolgd door 250 milliliter 70% ethanol gedurende 30 seconden en 250 milliliter 95% ethanol gedurende twee minuten.

Vlam steriliseer de replicator-pins door de replicator loodrecht op de vlam van de Bunsenbrander te houden, langzaam naar de vlam te naderen tot het ethanol ontbrandt en trek hem dan onmiddellijk uit de vlam. De vlam zal uitdoven zodra al het ethanol is verbrand. Koel de pins af door ze 30 seconden op een ongebruikte rechthoekige plaat met steriele LB-agar te prikken.

Terwijl de replicator-pins afkoelen, verwarm kort het aluminium zegel van de PA14NR-set masterplate met uw hand en trek het voorzichtig af, zorg ervoor dat het zegel de plaat niet opnieuw raakt. Gebruik een pincet om eventuele restanten van het aluminium zegel te verwijderen. Plaats de replicator-pins in de masterplaat door voorzichtig te duwen en de replicator in alle vier de richtingen te schudden om ervoor te zorgen dat de pins contact maken met de bevroren bacterieculturen in elk van de 96 putjes.

Let extra op de putjes die zich aan de buitenrand van de plaat bevinden door de replicator-pins tegen bevroren culturen in de putjes aan de rand van de plaat te duwen. Plaats de replicator-pins voorzichtig op het oppervlak van de agarplaten. Beweeg de replicator in een lichte cirkelvormige beweging om veel grasvelden van ongeveer vier tot vijf millimeter voor elke mutantenstam te vormen.

Versluit de PA14NR-set masterplaat met een nieuw steriele aluminium zegel. Gebruik een platenroller om ervoor te zorgen dat elke put en de randen van de plaat volledig zijn afgesloten. Breng de 96-well masterplaat terug naar droog ijs.

Na het hanteren van de PA14NR-set, veeg alle werkoppervlakken af met 70% ethanol. Breng de gerepliceerde agarplaat over naar een 37 graden Celsius incubator en incubeer overnacht. Zorg ervoor dat de laminare stroomkap leeg is van onnodige apparatuur en zet de kapventilator minimaal 10 minuten aan voordat u met deze procedure begint.

Veeg de oppervlakken van de kap en alle items in de kap af met 70% ethanol. Gebruik een 50 tot 1200 microliter 12-kanaals elektronische pipet om elk putje van een 12 milliliter diepe puttenblok te vullen met 525 microliter LB vloeibaar bouillon met geschikte antibiotica. Verzegeld de diepe puttenblok voordat u het uit de laminare stroomkap verwijdert.

Breng vervolgens de met media gevulde diepe puttenblok over naar een met ethanol afgeveegde werktafel. Creëer een steriele werkruimte met een Bunsenbrander op de werktafel en zet containers op met geschikte oplossingen voor de sterilisatiesterilisator van de pin. Dompel de replicator-pins in elke oplossing zoals eerder gedemonstreerd.

Vlam steriliseer de replicator-pins. Koel vervolgens de pins af door ze 30 seconden in een ongebruikte rechthoekige plaat met LB-agar te prikken. Plaats de replicator-pins voorzichtig op de agarplaat met gekweekte mutante stammen en controleer of de pins contact maken met alle 96 mutanten op de agarplaat.

Dompel vervolgens de pins gedurende vijf tot 10 seconden in de diepe putten die LB vloeibaar bouillon bevatten. Vermijd het aanraken van de zijden van de putten met de pins. Verzegeld het diepe puttenblok met een steriele ademende afdichtingsmembraan.

Gebruik een platenroller om ervoor te zorgen dat elke afzonderlijke