Name: Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Leer hoe je de PA14NR-transposonmutantenbibliotheek van Pseudomonas aeruginosa repliceert met behoud van integriteit en kwaliteitscontrole. Dit protocol minimaliseert besmettingsrisico's en is aanpasbaar voor andere bacteriële bibliotheken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedank Lisa Philpotts van de MGH Treadwell virtuele bibliotheek voor haar begeleiding in de database zoeken. Dit werk werd gesteund door de Cystic Fibrosis Stichting (YONKER16G0 en HURLEY16G0) en NIH NIAID (BPH en ADE: R01 A1095338).

De auteurs melden geen financiële belangenconflicten. Eliana Drenkard en Frederick Ausubel deelgenomen aan de oprichting de PA14 nonredundant transposon mutant bibliotheek. Bryan Hurley en Lael Yonker momenteel house en de mutant bibliotheek distribueren als onderdeel van de afdeling kindergeneeskunde in het Massachusetts General Hospital.

De P. aeruginosa PA14NR ligt een waardevolle bron voor de wetenschappelijke gemeenschap. Volgens de maart 2017 dataset uit Clarivate Analytics belangrijke indicatoren van de Science database, Liberati et al. (2006) 37, waarin de bouw van de PA14NR Set, is gerangschikt in de top 1% van de publicaties van de microbiologie. Google Scholar rapporten meer dan 600 citaten van de Liberati et al. (2006) originele manuscript vanaf augustus 2017. De bibliotheek heeft een ...

Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie aanwezig in de bodem, water, en de meeste menselijke omgevingen, evenals huid microflora. Vergeleken bij veel bacteriesoorten, heeft P. aeruginosa een relatief grote genoom van 5.5-7 Mbp met hoge G + C inhoud (65-67%). Bovendien een aanzienlijk deel van de genen betrokken zijn bij de metabole aanpassingsvermogen en zijn onderdeel van regulerende netwerken, grote flexibiliteit in reactie op de milieudruk1. P. aeruginosa geeft uiting aan een overvloed van virulentiefactoren, neiging naar formulier biofilms vertoont, bezit het vermogen om te coördineren van de reacties via meerdere quorum sensing trajecten en bevat een opmerkelijke capaciteit te ontwikkelen resistentie tegen antibiotica en tolerantie2,3,4,5,6,7,8. Deze kenmerken stellen belangrijke uitdagingen voor de behandeling van infecties veroorzaakt door P. aeruginosa.
Chronische P. aeruginosa infecties kunnen optreden in talrijke ziekte staten. Cystic fibrosis (CF), een genetische ziekte die wordt veroorzaakt door mutatie van het gen Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) , resulteert in inspissated, besmette afscheidingen binnen de luchtwegen, progressieve Bronchiëctasie en uiteindelijk dood van respiratoire insufficiëntie9. Door volwassenheid, zijn de meerderheid van de patiënten met CF chronisch geïnfecteerd met P. aeruginosa, dat een sleutelrol in de morbiditeit en mortaliteit die zijn gekoppeld aan deze ziekte10 speelt. Bovendien hebben patiënten met ernstige branden verwondingen11, tracheostomies12, gewrichtsprothesen13of inwonende katheters14 risico op P. aeruginosa infectie gerelateerd aan van de bacteriën vermogen om vorm biofilms en ontsnappen host15van de inflammatoire reacties. Verder, kolonisatie zonder concurrentie treedt op nadat een bevolking meerdere antibiotica resistentie of tolerant is geselecteerd door middel van breedspectrum, sequentiële antimicrobiële behandeling12,16,17 , 18. beter begrijpen van de pathogenese van P. aeruginosa zal belangrijke gevolgen hebben voor talloze ziekte staten.
Verschillende P. aeruginosa klinische isolaten, met inbegrip van stammen PAO1, PA103, PA14 en PAK, zijn uitvoerig bestudeerd om te onderzoeken van de verschillende functies van P. aeruginosa pathogenese. Stam PA14 is een klinische isolaat die behoort tot een van de meest voorkomende klonale groepen wereldwijd19,20 en heeft niet uitgebreid in het laboratorium is gepasseerd. PA14is zeer virulente in gewervelde modellen van infectie, met een opmerkelijke endotoxine profile21, pili structuur22, pathogeniteit eilanden23, III secretie typesysteem (TTSS), cytotoxiciteit naar zoogdieren cellen24 en profielen van antibiotische weerstand en volharding25. Bovendien, PA14 is ook zeer virulente in talrijke gastheer-pathogeen modelsystemen, met inbegrip van plant blad infiltratie modellen26,27,Caenorhabditis elegans infectie modellen28, 29, insect modellen30,31, evenals muis longontsteking modellen32,,33 en huid branden modellen34.
Genoom-brede mutant bibliotheken zijn verzamelingen van isogene mutanten in niet-essentiële genen die zeer krachtige tools om te begrijpen van de biologie van een organisme door analyse van de genfunctie toe te staan op een genomic schaal vormen. Twee in de buurt van-saturation transposon invoeging mutant bibliotheken gebouwd in P. aeruginosa zijn momenteel beschikbaar voor distributie. De sites van de invoeging van de transposons zijn vastgesteld voor beide bibliotheken. Deze zogenaamde nonredundant bibliotheken genoom-brede studie van bacteriestammen vergemakkelijken door het aanzienlijk verlagen van de tijd en kosten genfunctieonderzoek screening willekeurige transposon mutanten. De P. aeruginosa PAO1 transposon mutant bibliotheek, gebouwd in de MPAO1 isoleren van de stam PAO1 met behulp van transposons ISphoA/ hah en ISlacZ/ hah35, is samengesteld door het Manoil laboratorium, Universiteit van Washington. De bibliotheek bestaat uit een reeks-geverifieerd verzameling 9,437 transposon mutanten die biedt brede genoom dekking en omvat twee mutanten voor de meeste genen36. Informatie over de PAO1 van de P. aeruginosa transposon mutant library is beschikbaar op de openbare, internet toegankelijke Manoil lab-website op http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm. De P. aeruginosa stam PA14 nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek (PA14NR ingesteld) gebouwd in stam PA14 met behulp van de MAR2xT7 en Tn transposonsphoA37 wordt momenteel gedistribueerd door de afdeling kindergeneeskunde in het Massachusetts General Hospital. De PA14NR Set bestaat uit een verzameling van meer dan 5.800 mutanten met één transposon invoegingen in niet-essentiële genen37. Details over de bouw van de PA14NR Set zijn beschreven in de openbare, toegankelijke internet site http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB, waarin ook een scala aan online zoekprogramma's om het gebruik van de PA14NR Instellen.
De oorspronkelijke PA14NR Set bestond uit 5,459 mutanten, geselecteerd uit een uitgebreide bibliotheek van ongeveer 34.000 willekeurige transposon insertiemutanten, die overeenkomen met 4,596 voorspelde PA14 genen 77% van alle voorspelde PA14 genen37. Sinds de bouw van de bibliotheek in 2006 nieuwe mutanten werden toegevoegd, en momenteel de PA14NR Set omvat meer dan 5.800 mutanten38 die vertegenwoordigen ongeveer 4.600 PA14 genen. De meerderheid van de PA14 transposon mutanten werden gegenereerd in het wild type achtergrond37. Details over elk lid van de mutant bibliotheek, met inbegrip van genetische achtergrond, zijn beschikbaar via de online database zoeken, of door het downloaden van de Nonredundant bibliotheek spreadsheet, beide functies beschikbaar op de website van PA14 (http:// PA14.MGH.Harvard.edu/cgi-bin/PA14/Home.cgi). De meerderheid van mutanten werden gemaakt met behulp van de MAR2xT7 (MrT7) transposon, met een kleine set gemaakt met behulp van de TnPhoA (phoA) transposon37. Elke transposon heeft een antibiotica-resistentie-cassette, waarmee een mutant selectie met gentamicine (MrT7) of kanamycine (phoA). De PA14NR-set van mutanten in drieënzestig 96-wells-platen is opgeslagen en omvat twee extra controle van de 96-wells-platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon. De indeling van de 96-wells-plaat gecombineerd met de online zoekprogramma's sterk vergemakkelijkt de aangepaste ontwikkeling van screening tests waarmee gebruikers gemakkelijk om genen te identificeren mutant fenotypen is gekoppeld. De online zoekprogramma's vergemakkelijken ook de zoek- en selectie van aanvullende relevante mutanten vereist voor verdere studies.
De PA14 en PAO1 transposon mutant bibliotheken zijn zeer belangrijke wereldwijde resources voor de wetenschappelijke gemeenschap, en zij elkaar aanvullen bij het valideren van de functie van onbekende genen en trajecten van deze bacteriële pathogenen. Toevallig, sinds de bouw van de PAO1 en PA14 transposon mutatie Bibliotheken, heeft full-DNA sequentiebepaling genoomanalyse van vele P. aeruginosa isolaten aangetoond dat PAO1 en PA14 tot verschillende belangrijke subclades van de P. aeruginosa behoren fylogenie7,39,40,41. Omdat klinisch P. aeruginosa isolaten vindt u verspreid over de fylogenie, het feit dat PAO1 en PA14 tot verschillende P. aeruginosa behoren subgroepen verhoogt de waarde van de twee transposon mutatie bibliotheken voor vergelijkende studies.
Publicaties met een beschrijving van de bouw en screening van bacteriële mutant Bibliotheken, waaronder P. aeruginosa bibliotheken35,zijn37,42, beschikbaar in de literatuur. Echter tot de beste van onze kennis, geen gepubliceerde protocollen beschrijven gedetailleerde procedures en technieken die worden gebruikt voor replicatie, onderhoud en validatie van bacteriële mutant bibliotheken zijn beschikbaar.
De methodologie uiteengezet in deze publicatie beschrijft een set van drie protocollen die het gebruik vergemakkelijken en onderhoud van de PA14NR Set. Het eerste protocol beschrijving van replicatie van de bibliotheek zoals aanbevolen voor de ontvangers van de PA14NR Set. Het tweede protocol bevat richtsnoeren voor de strepen, groeiende en opslaan van individuele mutanten geïdentificeerd met behulp van de PA14NR Set. Het derde protocol beschrijft kwaliteitscontrole technieken, met inbegrip van PCR versterking van fragmenten van transposon mutanten en de daaropvolgende sequencing mutant identiteit te bevestigen. Deze set van protocollen kan ook worden aangepast voor de replicatie en het onderhoud van andere bacteriële mutant bibliotheken of collecties. De replicatie van bacteriële mutant bibliotheken of collecties is zeer aangeraden voor het behoud van de integriteit van de "master copy" (originele exemplaar ontvangen). Replicatie van meerdere kopieën van de PA14NR Set voor routinematige laboratoriumgebruik minimaliseert de kans op besmetting van de interwell van het originele exemplaar.

<table><tbody><tr><td>Materialen voor bibliotheekreplicatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele 96-wells weefselkweek gecoat, doos van 50</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353072</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Steriele 96 Well Clear V-Bottom 2000&mu;L Deep Well Plates, doos van 25</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3960</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Nunc OmniTray (rechthoekige platen), doos van 60</td><td>Thermo Scientific Rochester</td><td>242811</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Rechthoekige ijsvorm, Midi (4L)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>432104</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Secure-Gard Cone Mask, doos van 300</td><td>Cardinal Health</td><td>AT7509</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>AluminaSeal, pak van 100</td><td>Diversified Biotech</td><td>ALUM-100</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Breathe-Easy membraan, pak van 100</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Steriele, individueel verpakte, 50mL oplossingsbak/reagens reservoir, doos van 100</td><td>Sorenson</td><td>S50100</td><td>via Westnet Incorporated</td></tr><tr><td>Plate roller</td><td>VWR</td><td>60941-118</td><td>via VWR</td></tr><tr><td>Cryo Laser Labels - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", pak van 16 vellen</td><td>GA International</td><td>RCL-11T1-WH</td><td>via Labtag.com (sjabloon voor afdrukken ook beschikbaar via Labtag.com)</td></tr><tr><td>96-well replicator</td><td>V &amp; P Scientific, Inc.</td><td>Custom 407C, 3.18mm pin diameter, 57mm lang</td><td>via V &amp; P Scientific, Inc.</td></tr><tr><td>Multitron Pro, 3mm schudkuvende incubator</td><td>Infors HT</td><td>l10003P</td><td>via Infors HT</td></tr><tr><td>Picus 12 kanaals 50-1200&mu;L elektronische pipet</td><td>Sartorius</td><td>735491PR</td><td>via Sartorius</td></tr><tr><td>Filtertips 50-1200&mu;L, pak van 960</td><td>Biohit</td><td>14-559-512</td><td>via Fisher Scientific; gebruik elektronische multikanaals-compatibele tips</td></tr><tr><td>Drijfijs</td><td>Specifiek voor gebruiker leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialen voor afzonderlijke mutant opslag</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifugebuizen: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pipetten (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>Materialen voor kwaliteitscontrole PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifugebuizen: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnistrips PCR Tubes met koepelvormige deksels</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0404</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>ART Barrier low-retention pipettips (10 uL, 100 uL, 1000 uL)</td><td>Molecular BioProducts, Inc.</td><td>Z676543 (10 uL), Z676713 (100 uL), Z676802 (1000 uL)</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Pipetten (P1000, P200, P20, P2)</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>via Gilson</td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifugebuizen: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>MasterPure DNA Purification Kit</td><td>Epicentre</td><td>MCD85201</td><td>via Epicentre Technologies Corp</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, klaar voor gebruik</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1333</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>RediLoad Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>750026</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën voor bibliotheek en afzonderlijke mutant opslag</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol MB Grade, 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td></td><td></td><td>Per 1L dH2O: 10g tryptone, 5g gistextract, 5g NaCl, 1ml 1N NaOH (Current Protocols in Molecular Biology.&nbsp; Wiley, 1994.)</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7293</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gistextract</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>LB&nbsp; agar</td><td></td><td></td><td>Zie bovenstaande bereiding, voeg 15g Bacto Agar toe</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Gentamicinesulfaat, 10g</td><td>BioReagent</td><td>1405-41-0</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Ethanol, 190 proof</td><td>Decon</td><td>04-355-221</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Chemicaliën voor kwaliteitscontrole PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Voorkeursleverancier van gebruiker</td><td></td><td>Zie primers vermeld in Tabel 3</td></tr><tr><td>Corning cellgro Molecular Biology Grade Water</td><td>Corning</td><td>46000CV</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq Polymerase Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase, recombinant</td><td>Invitrogen</td><td>10342020</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>dNTP's</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>via ThermoFisher</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>via Sigma-Aldrich</td></tr></tbody></table>

replicatie van de besteld, nonredundant bibliotheek van pseudomonas aeruginosa stam pa14 transposon insertiemutanten

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is een fenotypische en genotypisch divers en flexibel gram-negatieve bacterie alomtegenwoordig in de menselijke omgevingen. P. aeruginosa vermag vormen van biofilms, ontwikkelen van resistentie tegen antibiotica, produceren van virulentiefactoren en snel evolueren in de loop van een chronische infectie. Dus P. aeruginosa kan leiden tot zowel acute en chronische, moeilijk te behandelen van infecties, resulterend in significante morbiditeit in bepaalde patiënt populaties. P. aeruginosa stam PA14 is een menselijke klinische isolaat met een geconserveerde genoom structuur die een verscheidenheid aan zoogdieren en nonvertebrate gastheren maken PA14 een aantrekkelijke stam voor de studie van deze ziekteverwekker infecteert. In 2006, werd een nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek met 5,459 mutanten overeenkomt met 4,596 voorspelde PA14 genen geproduceerd. Sindsdien heeft de distributie van de bibliotheek PA14 de onderzoeksgemeenschap om beter te begrijpen de functie van afzonderlijke genen en complexe trajecten van P. aeruginosatoegestaan. Handhaving van de integriteit van de bibliotheek door middel van het replicatieproces vereist goede behandeling en precieze technieken. Te dien einde stelt dit manuscript protocollen die beschrijven in detail de stappen bij bibliotheek replicatie, de controle van de kwaliteit van de bibliotheek en correcte opslag van individuele mutanten betrokken.

Twaalf nieuwe exemplaren van de PA14NR Set werden gerepliceerd met behulp van Protocol I, en een beoordeling van de kwaliteitscontrole van de nieuwe kopieën gegenereerd werd uitgevoerd met behulp van Protocol III.
PA14NR Set mutant platen samen met controle platen, die bestaan uit wild type PA14 geënt en niet-geënte wells tussenliggende in een vooraf ingesteld patroon (figuur 4A), werden gerepliceer...

Pseudomonas aeruginosa infectie veroorzaakt significante morbiditeit in kwetsbare hosts. De nonredundant transposon invoeging mutant bibliotheek van P. aeruginosa stam PA14, uitgeroepen tot PA14NR ingesteld, vergemakkelijkt de analyse van gene functionaliteit in tal van processen. Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van hoge kwaliteit kopieën van de PA14NR ingesteld mutant bibliotheek.

Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Het algemene doel van dit protocol is om hoogwaardige kopieën te genereren van de geordende, niet-redundante transposon-mutantenbibliotheek van de Pseudomonas aeruginosa-stam PA14, aangeduid als de PA14NR-set. Dit protocol behoudt de integriteit van de PA14NR-set tijdens replicatie, waardoor hoogwaardige kopieën van deze bibliotheek worden gegenereerd. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een gedetailleerde beschrijving geeft van alle stappen die betrokken zijn bij bibliotheekreplicatie, kwaliteitscontrole en juiste opslag van individuele mutanten.Hoewel dit protocol is ontworpen om de P14NR-set te repliceren, kan het worden aangepast om andere bacteriebibliotheken te repliceren. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen vanwege het risico op besmetting tijdens het replicatieproces. Daarom biedt dit protocol gedetailleerde stapsgewijze instructies om dat risico te verminderen.Ons laboratorium distribueert de PA14NR-set aan de wereldwijde wetenschappelijke gemeenschap. En we bevelen aan dat de bibliotheken worden gerepliceerd door de eindgebruiker. Om begeleiding te bieden, bieden we een protocol dat in detail beschrijft hoe u hoogw

replication-ordered-nonredundant-library-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Kazi, M. I., et. al., Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the selection, quantification, and preservation of Gram-negative recipient bacteria carrying transposon insertions based on kanamycin resistance.

Isolation of Gram-Negative Bacteria with Genomic Transposon Insertions

Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Hier beschrijven we een techniek die transposon mutagenese met hoge gegevensdoorvoer sequencing combineert te identificeren en kwantificeren van transposon leptospiral mutanten in weefsels na een uitdaging van hamsters. Dit protocol kan worden gebruikt voor scherm mutanten voor overleving en verspreiding in dieren en kan ook worden toegepast op in vitro studies.

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode voor het identificeren van genetische factoren die betrokken zijn bij verschillende soorten motiliteiten in Pseudomonas aeruginosa.

High-throughput methode voor het observeren van motiliteitsfenotypes in Pseudomonas aeruginosa

Protocol beschrijft de toepassing van een flow cel-systeem voor de teelt en het analyseren van microbiële biofilms voor Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa en Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow cellen

Leer hoe je de PA14NR-transposonmutantenbibliotheek van Pseudomonas aeruginosa repliceert met behoud van integriteit en kwaliteitscontrole. Dit protocol minimaliseert besmettingsrisico's en is aanpasbaar voor andere bacteriële bibliotheken.

Replicatie van de besteld, Nonredundant bibliotheek van Pseudomonas aeruginosa stam PA14 Transposon insertiemutanten

Meer video's verkennen