Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling
20 april 2018
Hier presenteren we een methode voor een menselijke in vitro model van stretch letsel in een 96-Wells-formaat op een tijdschaal die relevant zijn voor de invloed van trauma's. Het gaat hierbij om methoden voor het fabriceren van rekbare platen, kwantificeren van de mechanische belediging, kweken en verwonden van cellen, imaging en hoog inhoudsanalyse te kwantificeren van de schade.
Het algemene doel van dit model is om een klinisch relevant neurotrauma-fenotype te creëren in een 96-well formaat om de efficiënte en gelijktijdige vergelijking van verwondingen onder meerdere experimentele omstandigheden mogelijk te maken. Het primaire doel van dit model is om high-content fenotypische geneesmiddelontdekkingsscreens in neurotrauma mogelijk te maken, met humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen. De platen die in dit model worden gebruikt, behouden de industrie-standaard 96-well platengeometrie, waardoor ze compatibel blijven met bestaande high-content screeningmachines, zoals robotarmen en geautomatiseerde microscopen.
Plaats om te beginnen een bodemloze 96-well plaat met de onderkant omhoog gedurende 60 seconden op hoog vermogen in een 200 watt plasmareiniger. Plaats vervolgens de plaat in 200 milliliter vers bereide 1,5% APTES in gedeïoniseerd water, met de onderkant naar beneden, gedurende 20 minuten in een afzuigkap. 10 minuten na het begin van de incubatie, gebruik pincetten om een plasma-behandelde siliconenmembraan op een rechthoek van 7,5 bij 11 centimeter perkamentpapier te plaatsen en een aluminium plaat van 7,5 bij 11,05 centimeter uit te lijnen op het onderste gedeelte van de plaatfabricageklem.
Gebruik vervolgens pincetten om de siliconenmembraan en het perkamentpapier op de aluminium plaat uit te lijnen. Aan het einde van de coatingperiode, verwijder de bodemloze plaat uit het APTES-bad, en schud het overtollige oplossing af. Dompel de bodemloze plaat gedurende vijf seconden in twee opeenvolgende 200 milliliter gedeïoniseerd waterbaden en schud het overtollige water af.
Na volledige droging met perslucht, plaats de bodemloze plaat in het bovenste gedeelte van de plaatfabricageklem, en sluit voorzichtig de klem om de bodemloze plaat en siliconen samen te persen. Gebruik stageschroeven om de plaat onder een camera met een live-feed op de stage van het rekapparaat vast te zetten en plaats een koepellicht boven het apparaat. Start de instrumentcontrolesoftware op de computer die aan het verwondingsapparaat is gekoppeld en klik op de Launch-venster om het in-vitro neurotraumaproject te starten.
Dubbelklik in het projectvenster op de Motion Control en position tracker virtuele instrumenten. Sluit de kooi rond het verwondingsapparaat en klik op de pijl in het virtuele Motion Control-instrument om het instrument te starten. Klik dicht bij de onderkant om de stage te laten zakken tot binnen twee millimeter van contact met de indenter, en klik op stop om het virtuele instrument te stoppen.
In het projectvenster, klik rechts op Axis One en klik op Interactive Test Panel. Voer 500 eenheden in het veld Target Position in het venster dat verschijnt om de stapgrootte in te stellen op 50 micrometer. Klik vervolgens herhaaldelijk op Go, totdat de plaat voor het eerst contact maakt met een indenter, en controleer het contact op de live beeld weergegeven door de camera.
De verticale stagepositie wordt gemeld in de bovenste linkerhoek van het venster van het interactieve testpaneel. Laat de plaat verder zakken tot elke put contact maakt met de indenter, en beweeg de camera en de stage indien nodig om de hele plaat te bekijken. Noteer de gerapporteerde verticale stagepositie wanneer alle pinnen in contact zijn, en sluit het interactieve testpaneel.
Voer vervolgens het virtuele Motion Control-instrument uit en klik op Top om de stage te verhogen, gebruik de stopknop om het virtuele instrument te stoppen wanneer de stage op positie staat. Open de deur om het apparaat te deactiveren, los vervolgens de seth-schroef op de hoek die als eerste contact maakte om de hoek te verlagen, en draai de tegenoverliggende schroef vast om de hoek die als laatste contact maakte te verhogen. Herhaal het lager maken van de blok, observeren en aanpassen tot de plaat contact maakt met alle indenter gelijktijdig.
Zorgvuldige uitlijning van de indenterblok is belangrijk voor het bereiken van een uniforme verwonding over alle putten van de plaat. Open de deur om het apparaat opnieuw te deactiveren en plaats de aandraaibouten in hun gaten op de indenterblok. Draai vervolgens de schroeven vast en noteer de stagepositie gerapporteerd door het interactieve testpaneel wanneer de plaat contact maakt.
Om de plaat te rekken, wijzig de bestandsnaam in het veld File Path in het virtuele instrument voor positiecontrole naar een unieke bestandsnaam en klik op de pijl Run. Stel de diepte en duur van de indruk en de velden Injury en Injury Duration in het virtuele instrument voor bewegingscontrole in. Met de plaat op de nulpositie, voer het virtuele instrument voor bewegingscontrole uit en klik op Injure om de plaat in te drukken.
Klik op Top om de stage omhoog te bewegen, klik op stop wanneer de plaat in de bovenste positie staat, en open de deur om het verwondingsapparaat te deactiveren. Inspecteer vervolgens de verplaatsingsgeschiedenis van de stage gepresenteerd in het virtuele instrument voor positietracker om te bevestigen dat de opgegeven maximale verplaatsing is toegepast en exporteer de gegevens naar een geschikt spreadsheetprogramma. Om de rekken van de siliconenmembraan te beoordelen, plaats na plasmabehandeling de plaat op een zachte ondergrond en prime de kleine uitsteeksel op een stempel met inkt van een permanente markeringspen.
Plaats de stempel in de eerste put die getest moet worden en tik om een goede overdracht van inkt te garanderen. Wanneer alle putten gestempeld zijn, plaats de hogesnelheidscamera op een boomstand over het verwondingsapparaat met de lens ingesteld op de kleinste genoemde F-stop, zodat het gezichtsveld 12 indenters in een drie-op-vier raster bevat. Met de plaats in de nulpuntpositie, klik één keer op de opnameknop in de camerasoftware zodat deze trigger in leest en schakel de heldere diffuse axiale licht in.
Druk vervolgens de plaat in zoals zojuist gedemonstreerd en schakel het axiale licht uit. Om een celcultuur te verwonden, voeg 100 microliter laminine-behandelde, humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen toe aan elke put van de plasma-behandelde plaat en laat de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur aan de bodem van de plaat hechten voordat de plaat in de celcultuurincubator wordt geplaatst. Na twee tot drie dagen van cultuur, klemmen de plaat op de stage van het verwondingsapparaat en pas de positie van het
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het creëren van een menselijk in vitro-model van stretchletsel met gebruik van een 96-well formaat dat relevant is voor impacttrauma. Het model maakt high-content fenotypische drug discovery-screens mogelijk met neuronen afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen door de vergelijking van letsels onder meerdere experimentele condities toe te staan.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- In vitro-modellen
Achtergrond
- De groeiende belangstelling voor onderzoek naar neurotrauma maakt efficiënte modellen voor drugscreening noodzakelijk.
- Huidige modellen bootsen menselijke neurotrauma-condities mogelijk niet nauwkeurig na.
- Deze methode introduceert een klinisch relevant model om neuronale beschadiging te bestuderen.
- Het gebruik van 96-wells platen behoudt de compatibiliteit met apparatuur voor high-content screening.
Doel van de studie
- Om een model te ontwikkelen dat neurotrauma nabootst in een high-throughput-formaat.
- Om vergelijkingen van neuronale beschadiging over verschillende experimentele opstellingen te faciliteren.
- Om fenotypische drug discovery in neurotrauma-onderzoek te versnellen.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van een celkweekmodel met 96 putjes om rekletsels te simuleren.
- Het letsel wordt opgewekt met een aangepast apparaat dat mechanische stress uitoefent.
- Gedetailleerde procedures voor het prepareren van rekbare platen en het kweken van menselijke neuronen worden beschreven.
- De kwantificering van het letsel wordt uitgevoerd via imaging en high-content analyse.
Belangrijkste resultaten
- Het model genereert effectief uniforme beschadiging in alle putjes.
- Er zijn duidelijke protocollen opgesteld voor de fabricage van platen en de kwantificering van de beschadiging.
- De toepassing van deze methodologie maakt een systematische evaluatie van neuronale reacties op beschadiging mogelijk.
- De resultaten ondersteunen het nut van het model bij drugscreening en onderzoek naar neurotrauma.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een robuuste methode voor het repliceren van neurotrauma in vitro.
- Het platform kan worden aangepast voor high-content screening om potentiële therapeutica te identificeren.
- De bevindingen dragen bij aan een beter begrip van de mechanismen van neuronale beschadiging en reparatieprocessen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor het management
Deze methode maakt high-throughput fenotypische screening van therapieën voor neurotrauma mogelijk met behulp van menselijke iPSC-afgeleide neuronen in een 96-well formaat, waardoor de translationele kloof in de geneesmiddelenontwikkeling voor TBI wordt overbrugd. Door klinisch relevante mechanische rekprofielen te repliceren, ondersteunt het mechanistische risicoreductie en voorspellend vertrouwen bij vroege targetvalidatie. Het platform is integreerbaar met bestaande high-content screening-infrastructuur, wat de assay-gereedheid en de efficiëntie van portfolio-triage verbetert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in humane neuronale systemen onder gecontroleerde omstandigheden van mechanisch letsel.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare letselmetriek voor de verduidelijking van signaalpaden en het verminderen van risico's bij targetselectie.
- Strategische waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid bij de selectie van targets door de humane pathofysiologie van gesloten hoofdletsel te modelleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, schaalbare modellen voor neuronale beschadiging die compatibel zijn met geautomatiseerde imaging- en analyseworkflows.
- Operationele waarde: Faciliteert de simultane vergelijking van meerdere experimentele condities over 96 wells, waardoor het gebruik van reagentia en cellen wordt geoptimaliseerd.
- Strategische waarde: Maakt high-content fenotypische screening mogelijk voor de identificatie van lead-verbindingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor neurotrauma.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat de brug tussen ontdekking en preklinische validatie door gebruik te maken van neuronen van menselijke oorsprong en klinisch relevante letseldynamiek.
- Operationele waarde: Ondersteunt continue assayprestaties van hit-bevestiging tot lead-optimalisatie via gestandaardiseerde inductie van letsel.
- Strategische waarde: Verbetert de translationele continuïteit en vermindert de biologische variabiliteit bij preklinische besluitvorming.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor mechanistische screening mogelijk is vóór de preklinische fase.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten en pathway-analyse in menselijke neuronen onder gedefinieerde mechanische stress.
- Screening: Biedt assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en high-content fenotypische read-outs voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve, op imaging gebaseerde letselmetrieken die statistische vergelijkingen tussen condities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft de biologische relevantie door het gebruik van menselijke iPSC-afgeleide neuronen en klinisch afgestemde strain-profielen.
- Enterprise-hergebruik: Ontworpen als een herbruikbaar platform dat compatibel is met robotische handling en geautomatiseerde microscopiesystemen.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Predictieve betrouwbaarheid door modellering van menselijke pathofysiologie en vermindering van mechanistische ambiguïteit bij neurotrauma.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via het 96-well formaat en geautomatiseerde kwantificering van letsel.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd risico op falen in een laat stadium bij TBI-programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang op basis van gegevens over de letselrespons van menselijke neuronen.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in stamceldifferentiatie, neuronale kweek en het modelleren van mechanisch letsel.
- Toegang tot apparatuur voor plasmabehandeling, een op maat gemaakt indentatieapparaat en systemen voor hogesnelheidsbeeldvorming.
- Standaardisatie van membraanpreparatie, celzaaien en de uitvoering van het letselprotocol tussen teams.
- Overwegingen voor adaptatie naar andere celtypen of letselprofielen buiten hiPSCNs en equibiaxiale rek.
- Praktische beperkingen omvatten de doorlooptijden voor membraandetoxificatie en de vereisten voor uitharding gedurende de nacht vóór gebruik.
