Protocol voor Acute en chronische ecotoxiciteit testen van de Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri
April 24th, 2018
In dit werk beschrijven we een acute, chronische en multigeneratie bioassay om te bestuderen van de effecten van gemeenschappelijke en gecombineerde stressoren op de Turquoise poolfish Nothobranchius furzeri. Dit protocol is ontworpen om te bestuderen levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.
Het algemene doel van dit experiment is om de effecten van toxicanten op de turquoise killivis Nothobranchius furzeri te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ecotoxicologie, zoals de langetermijneffecten van stressfactoren op belangrijke levensgeschiedeniseigenschappen, zoals de tijd tot rijping, groei of vruchtbaarheid. Het grote voordeel van dit experiment is dat we een gewerveld dier gebruiken met een zeer snelle levenscyclus, wat resulteert in tijd- en kostenefficiënte experimenten.
Deze killivissen zijn ideale modellen om de impact van langdurige en multigenerationele effecten van stressfactoren te bestuderen. Uiteindelijk zullen ze bijdragen aan een beter begrip van de milieu-impact van toxicanten. Hoewel deze methode nieuwe inzichten kan bieden in de gecombineerde effecten van toxicanten en temperatuur, kan het ook worden toegepast op andere stressfactoren zoals UV-straling, voedselgebrek en pH-veranderingen.
Killivissen zijn lastig om mee te werken, omdat ze een nieuw modelsysteem zijn in de ecotoxicologie en omdat hun gevoeligheid voor veel verontreinigingen nog onbekend is. We ontwikkelden het idee voor deze experimentele methode toen we voor het eerst hoorden over de uitzonderlijk korte levensduur van killivissen en hun vermogen om slapende eieren te produceren die jarenlang in de schappen kunnen worden bewaard. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het type experiment, evenals de manier van omgaan met de individuen, de resultaten kan veranderen.
Om te beginnen, selecteer gona ray zoo, of GRZ eieren, in de D3 fase, die herkenbaar zijn aan de aanwezigheid van gouden ogen. En gebruik een zacht paar pincetten om ze voorzichtig over te brengen naar een plastic tweelitertank. Voeg een centimeter van het uitbroedelingsmedium toe bij 12 graden Celsius en laat de watertemperatuur geleidelijk aanpassen naar kamertemperatuur.
Na 24 uur voer de uitgekomen vissen een geconcentreerde dosis vers uitgekomen artemia nauplii en verhoog de waterdiepte tot vijf centimeter door er vismedium aan toe te voegen. 48 uur na het uitkomen, breng gezonde, drijvende larven over naar afzonderlijke containers met blootstellingsmedium en toxicantconcentraties zoals beschreven in het tekstprotocol. Elke ochtend en avond controleert u vissen op sterfte, stress en ziekte, en berekent u LC50-waarden volgens het tekstprotocol.
Voer een chronisch blootstellingsexperiment uit door individuele containers te vullen met het juiste blootstellingsmedium en voeg een luchtbuis toe om de pot te beluchten. Breng vissen over naar de potten voor de rest van het experiment. Van twee tot 23 dagen na het uitkomen of DPH, voer de vissen twee keer per dag ad libitum artemia nauplii.
Vervolgens, na suppletie met gehakte chironomus larven tot 37 DPH, gebruik bevroren chironomus larven om de vissen ad libitum twee keer per dag, elke dag, verder te voeren. Om de groei te bepalen, meet u de lichaamsgrootte wekelijks door vissen over te brengen naar een petrischaal gevuld met medium van de reservoir. Neem vier tot vijf grootte-gekalibreerd dorsale foto's van de vissen op een vaste hoogte.
En gebruik een spatieel meetprogramma om ze digitaal te analyseren. Vanaf 15 DPH, inspecteer visueel de mannelijke vissen op kleur om de rijping te bepalen. Controleer de vinnen op de eerste tekenen van bruidskleuren en gebruik de dag waarop de eerste kleur zichtbaar was als proxy voor de rijpingstijd van de mannetjes.
Vanaf 30 DPH, controleer vruchtbaarheid door een liter spawntank op te zetten voor een rijp mannelijk en vrouwelijk koppel binnen elke behandeling, gebruik blootstellingsmedium uit het aquarium van het mannetje en vul het aan met spawnsubstraat. Breng zowel het mannetje als het vrouwtje over naar de spawntank. En terwijl menselijke activiteit of verstoring rond de spawncontainers wordt geminimaliseerd, laat ze twee uur spawnen.
Vervolgens, zonder onnodige menging van het water, wat de eieren in het spawnsubstraat zou laten wervelen, breng vissen voorzichtig terug naar hun oorspronkelijke huisvestingscontainers. Filter de eieren door het spawnsubstraat over een 500 micrometer gaas te gieten. Tel de eieren en gebruik een pipet om ze over te brengen naar vochtig veenmos in petrischalen.
Verwijder dagelijks dode eieren. Na een week, gebruik afdichtfolie om de petrischaal af te sluiten. En bewaar deze in een temperatuurregelbare incubator op 28 graden Celsius, met een 14 tot 10 licht tot donker cyclus, voor onmiddellijke ontwikkeling tot de D3 fase.
Voor langdurige conservering, bewaar de eieren in constante duisternis op 17 graden Celsius, waarbij eieren de slapende fase ingaan en meerdere jaren levensvatbaar blijven. Om vissen uit de slapende eieren te rekruteren, breng de eieren over naar 28 graden Celsius en een 14 tot 10 licht tot donker cyclus, voor ongeveer drie weken, om ze te laten ontwikkelen tot de D3 fase. Om de kritische thermische maximum of CT max van volwassen vissen te meten, begint u met een continu circulerend waterbad, verwarmd met een constante snelheid van 0,33 graden Celsius per minuut.
Voeg voor elk individueel visje verschillende liter aquaria toe. Start het experiment door de vissen toe te voegen aan het aquarium wanneer het water de experimentele kweektemperatuur van de vissen heeft bereikt. Gebruik een digitale thermometer om de temperatuur in de liter aquaria van het CT max-bad om de vijf minuten te controleren.
Wanneer de vis niet langer een dorsale ventrale rechtopstaande positie kan behouden of hevig begint te trillen, meet u de temperatuur in het liter aquarium, wat de kritische maximale temperatuur is. Breng de vis vervolgens terug naar zijn experimentele huisvesting voor herstel. Zoals in deze grafiek te zien is, veroorzaakte acute blootstelling van enfurzeri aan verschillende concentraties koper een toename van sterfte met toenemende toxicantconcentratie.
LC50 waarden nemen in de loop van de tijd af, wat betekent dat met afnemende concentraties, er meer tijd verstrijkt voordat 50%van de replica's sterft. In chronisch blootstellingsonderzoek, met water-borne koper, zijn vissen korter in lengte, zoals gemeten na drie weken wanneer grootgebracht bij de hoogste geteste concentratie. In dit experiment met water-borne chloorpyrifos of CPH, wann
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een bioassay om de effecten van stressoren op de Turquoise killivis, Nothobranchius furzeri, te onderzoeken. Het richt zich op levensgeschiedeniskenmerken zoals mortaliteit, groei en vruchtbaarheid, en biedt inzichten in ecotoxicologie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ecotoxicologie
- Omgevingswetenschap
- Visbiologie
Achtergrond
- De Turquoise killivis heeft een snelle levenscyclus, waardoor het geschikt is voor het bestuderen van stressoreffecten.
- Het begrijpen van de effecten van toxicanten is cruciaal voor het beoordelen van milieurisico's.
- Deze studie behandelt zowel acute als chronische stressoreffecten.
- Meergeneratieeffecten worden ook in dit onderzoek beschouwd.
Doel van de studie
- Om de langetermijneffecten van toxicanten op levensgeschiedeniskenmerken te evalueren.
- Om de gecombineerde effecten van meerdere stressoren te beoordelen.
- Om het begrip van milieueffecten op aquatisch leven te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Acute en chronische bioassays met Nothobranchius furzeri.
- Beoordeling van mortaliteit, groei en vruchtbaarheid.
- Evaluatie van de kritische thermische maximum.
- Toepassing van de methode op verschillende stressoren, inclusief UV-straling en pH-veranderingen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van significante effecten van toxicanten op groei en reproductie.
- Inzichten in de veerkracht van de soort onder stress.
- Gegevens die het gebruik van killivis als modelorganisme in ecotoxicologie ondersteunen.
- Bewijs van meergeneratieeffecten van stressoren.
Conclusies
- De studie biedt een waardevol kader voor ecotoxicologisch onderzoek.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de milieu-impact van verontreinigingen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om aanvullende stressoren te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The turquoise killifish model enables rapid assessment of toxicant effects on vertebrate life-history traits, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in environmental health research. Its short life cycle and dormant egg storage allow cost-efficient, scalable screening for predictive confidence in compound safety profiling. This approach aids portfolio triage by identifying biological risks associated with environmental exposures prior to downstream development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying impacts on maturation, growth, and fecundity as functional readouts of physiological stress.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized measurement of mortality and sublethal endpoints across concentrations and time.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that disrupt critical life-history processes, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing dose-response relationships for toxicant exposure.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined protocols for acute, chronic, and multigenerational testing.
- Scalability: Highlights screening readiness via dormant egg recruitment, eliminating need for continuous on-site culture and enabling platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through assessment of combined stressor effects, such as toxicants and temperature, on fecundity and maturation.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by measuring life-history traits predictive of population-level impacts.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by quantifying how stressors alter developmental timing and reproductive output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, vertebrate-based readouts of stressor impact on conserved biological processes.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through measurement of maturation time, growth, and fecundity as integrative biomarkers of physiological status.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs via LC50 determination, size calibration, and egg counting under controlled exposure conditions.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including critical thermal maximum and coloration timing as proxies for physiological thresholds.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by linking life-history disruptions to population fitness and multi-generational outcomes.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through dormant egg banking and protocol adaptability across stressors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vertebrate stress response.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through defined exposure media, feeding regimens, and environmental controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying hazards early in discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative thresholds for mortality, growth inhibition, and fecundity reduction.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in vertebrate husbandry, ecotoxicology, and life-history trait measurement.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include temperature-controlled incubators, imaging systems for size calibration, and water baths for CT max assays.
- Cross-team standardization requirements for feeding schedules, exposure medium preparation, and blind scoring of maturation and fecundity endpoints.
- Adaptation considerations across model systems, including sensitivity to handling, water quality, and thermal history.
- Practical limitations supported by source material: challenges in working with a new model system, unknown sensitivity to many pollutants, and variability introduced by individual handling or environmental fluctuations.
