CRISPR-gemedieerde verlies van functie analyse in cerebellaire submodule cellen gebruiken In Utero Electroporation gebaseerde gentransfer
June 9th, 2018
Conventionele studies van de verlies-van-functie van genen met behulp van knock-out dieren zijn vaak kostbare en tijdrovende geweest. Electroporation gebaseerde CRISPR-gemedieerde somatische mutagenese is een krachtig hulpmiddel om te begrijpen gen functioneert in vivo. Wij rapporteren hier een methode voor het analyseren van de knock-out fenotypen in delende cellen van het cerebellum.
Het algemene doel van deze elektroporatie-gebaseerde in vivo gentransferbenadering is om de rollen van geninteresse te evalueren in de differentiatie van cerebellale granulocellen door middel van CRISPR-gemedieerde verlies-van-functie-analyses. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsneurowetenschappen en de neuro-oncologieën, zoals voor het identificeren van de moleculen die belangrijk zijn voor de normale cerebellaire ontwikkeling en hersentumorformaties. De procedure van in-utero elektroporatie zal worden gedemonstreerd door Dr. Lena Herbst, een post-doc uit het laboratorium van Professor Peter Lichter, en vervolgens zal de volgende immunohistologie worden uitgevoerd door Dr. Weijun Feng, een post-doc uit het laboratorium van Dr. Haikun Di.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is om zo haalbaar mogelijk genen van interesse in de cerebellaire cellen te elimineren, met behulp van de CRISPR-cas9-technologieën, in plaats van de generatie van een combinatie van knock-out-dieren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in genfuncties tijdens normale cerebellaire ontwikkeling, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals de ontwikkeling van andere fysieke hersengebieden en hersentumormodellering. Begin met het laden van een borosilicaat glas capillair in een micropipet trekker en trek om een fijne punt te creëren.
Label de capillair punt met zwarte inkt voor betere visualisatie tijdens de injectie, en teken een schaal op het glas. Werk onder een stereomicroscoop, gebruik een liniaal en scherpe naaldtang om de punt te knippen tot een lengte van ongeveer zes millimeter en creëer een scherpe, eenzijdige afgeschuinde rand. Filter een 1% fast green stockoplossing door een nulpunt, 22 micron filter om kleurdeeltjes uit de oplossing te verwijderen.
Meng de single-guide RNA plasmiden in gelijke delen met de luciferase reporter plasmid tot een eindconcentratie van minimaal één microgram per milliliter voor elk plasmid. Kleur de plasmidoplossing met fast green bij een eindconcentratie van 0,5%. Nadat een zwangere CD-1 muis is verdoofd met isofluraan, plaats de muis op haar rug op een verwarmingskussen en geeft pijnstiller. Breng oogzalf aan om oogdroogheid tijdens de chirurgie te voorkomen.
Bevestig de lens met plakband en steriliseer de buik met een ontsmettingsmiddel. Bedek de muis met gaas, waarbij alleen het chirurgische gebied bloot ligt. Na het maken van een huidsnede van ongeveer twee centimeter lengte, lokaliseer de linea alba en gebruik doffe tip weefselscharen om een iets kleinere tweede snede door het buikvlies te maken.
Bevochtig de geopende buikholte met voorverwarmde steriele PBS. Gebruik vervolgens ringtang om de baarmoederhoorns voorzichtig uit de buikholte te extraheren. Grijp de baarmoederwand op de opening tussen de dooiersakken van twee naburige embryo's en trek voorzichtig.
Vermijd enige druk op het embryo terwijl u het door de snede trekt. Zodra de baarmoederhoorns zijn geëxtraheerd, zuigt u ongeveer 10 tot 15 microliters gekleurde plasmidoplossing aan met de voorbereide glazen capillair. Vermijd eventuele luchtbellen tijdens dit proces.
Houd het embryo voorzichtig met ringtang en lokaliseer het nekgebied. Dring langzaam door de dorsale achterhersenen met de punt van de glazen capillair en beweeg naar de vierde ventrikel. Injecteer ongeveer één microliter van de plasmidmix.
Bevestig dat de gekleurde DNA niet is gelekt uit de hersenen, en zichtbaar is als een diamantvormige structuur. Hier is het het belangrijkst om het hele gebied van de vierde ventrikel te vullen met plasmidoplossing, om DNA ook naar het distale deel van de cerebellaire primordium te leveren. Zorg er tegelijkertijd voor dat er geen bloeding optreedt tijdens dat proces.
Plaats platina tang, uitgerust met vijf millimeter diameter elektrode platen lateraal over het hoofd van het embryo, met de negatieve pool die het oor bedekt, en de positieve pool gepositioneerd bij het cerebellaire primordium boven de baarmoederwand, en breng elektrische vierkante pulsen toe. Wanneer alle embryo's zijn geëlektroporeerd, plaats de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte en vul met steriele PBS. Laat de baarmoederhoorns in een natuurlijke positie glijden.
Schakel de anesthesie uit en plaats het dier buik-onder in een nieuwe kooi om te herstellen. Voor het cryosecteren, fixeer de cerebella 's nachts in vijf milliliter 4%PFA in PBS per hersenen, bij vier graden Celsius. De volgende dag, breng de gefixeerde cerebella over naar tien milliliter 30%sucrose in PBS per hersenen, en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.
De volgende dag, nadat het weefsel naar de bodem van de buis is gezonken, verwijder de hersenen van de sucrose, en droog de resterende sucrose oplossing met een stuk cellulose filterpapier. Dompel vervolgens elk cerebellum in optimale snijtemperatuur compound in een wegwerpbare kunststof mal, en bevries op droogijs. Snijd het cryogene blok in 10 micron dikke secties, met behulp van een cryostaat, en bewaar de secties op min 80 graden Celsius tot gebruik.
Wanneer u klaar bent om door te gaan naar immunokleuring, droog de slides eerst 30 minuten op kamertemperatuur, en was vervolgens twee keer 10 minuten per keer in PBS. Cirkel de secties met een vloeibare blokkeringspen en incubeer de secties in blokkeeroplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg primaire antilichamen tegen de moleculen van interesse toe in de blokkeeroplossing, en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.
Was de slides met 0,1%Triton bevattende PBS drie keer gedurende 10 minuten per keer. Voeg vervolgens fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam toe, verdund in blokkeeroplossing bevattende DAPI, en incubeer de secties gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de slides in PBS-T drie keer gedurende 10 minuten per keer, monteer de slides, en bewaar bij vier graden Celsius tot beeldvorming.
hek293T cellen die stabiel streptococcus pyogenes cas9 tot expressie brengen, werden getransfecteerd met sgRNA expresserende en targeting plasmiden. GFP expressie in levende cellen werd gemonitord met behulp van een fluorescente celimager 48 uur na transfectie. De
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een op elektroporatie gebaseerde CRISPR-gemedieerde somatische mutagenese-methode voor het analyseren van genfuncties in cerebellaire granulair cellen. Deze aanpak maakt een efficiënte evaluatie mogelijk van genrollen in normale cerebellaire ontwikkeling en hersentumorvorming.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genfunctieanalyse
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Conventionele knockout-studies zijn vaak kostbaar en tijdrovend.
- CRISPR-technologie maakt gerichte genbewerking mogelijk.
- Het cerebellum is cruciaal voor motorische controle en cognitieve functies.
- Inzicht in genrollen kan ontwikkelings- en pathologische processen verhelderen.
Doel van de studie
- Om genfuncties in de differentiatie van cerebellaire granulair cellen te evalueren.
- Om moleculen te identificeren die belangrijk zijn voor cerebellaire ontwikkeling.
- Om hersentumorvorming te modelleren met behulp van genknockouttechnieken.
Gebruikte methoden
- In-utero elektroporatie voor genoverdracht.
- CRISPR-Cas9-technologie voor genknockout.
- Immunohistochemische analyse voor het analyseren van cellulaire veranderingen.
- Samenwerking tussen meerdere onderzoekslaboratoria.
Belangrijkste resultaten
- De haalbaarheid van genknockout in cerebellaire cellen is aangetoond.
- Inzichten zijn verkregen in genfuncties tijdens cerebellaire ontwikkeling.
- Potentiële toepassingen in andere hersengebieden en tumormodellering zijn getoond.
- De voordelen van deze methode ten opzichte van traditionele knockout-modellen zijn benadrukt.
Conclusies
- Deze methode biedt een snelle aanpak om genfuncties in vivo te bestuderen.
- Het kan het onderzoek op het gebied van ontwikkelingsneurowetenschappen aanzienlijk bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot verschillende neurologische stoornissen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
CRISPR-mediated somatic mutagenesis in cerebellar granule cells via in utero electroporation enables rapid, cost-effective functional interrogation of disease-relevant genes in neurodevelopmental and neuro-oncology research. This approach bypasses the time and resource constraints of germline models, supporting earlier target validation and mechanistic de-risking in the discovery pipeline. The method's quantitative phenotyping and chimeric modeling facilitate predictive confidence for portfolio triage and translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct loss-of-function analysis of candidate genes implicated in brain malformations and tumors.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene function in disease-relevant neural cell populations.
- Facilitates rapid hypothesis testing without the need for full germline knockout model generation.
- Provides functional validation of genetic findings from patient-derived tissue sequencing.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chimeric brain tissue systems for downstream phenotypic screening and quantitative analysis.
- Delivers reproducible, GFP-labeled cell populations for standardized imaging and immunohistochemistry workflows.
- Enables scalable assessment of multiple sgRNA constructs for gene targeting efficiency.
- Supports robust comparison of gene knockout versus control conditions in situ.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant somatic mutation modeling for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from genetic discovery to preclinical validation in neurodevelopmental and tumor contexts.
- Reduces late-stage biological risk by enabling early functional assessment of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging genetic target identification with in vivo functional validation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification for candidate neurodevelopmental genes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative phenotypic outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene knockout effects using immunohistochemistry and GFP-based readouts.
- Translational Research: Facilitates modeling of somatic mutations relevant to human brain disorders and tumors.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function interrogation across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurobiological pathways.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and supports scalable gene function studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental and neuro-oncology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero electroporation and CRISPR-Cas9 gene editing techniques.
- Demands access to specialized surgical, imaging, and molecular biology infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of plasmid design, delivery, and phenotypic analysis protocols.
- Adaptation to other brain regions or cell types may require protocol optimization.
- Practical limitations include surgical skill requirements and potential variability in electroporation efficiency.
