Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Het algemene doel van dit experiment is om volgende generatie sequencing bibliotheken te genereren van zowel het DNA als het RNA van kleine populaties cellen zonder de steekproef op enig moment te splitsen. Deze methode biedt onderzoekers een nieuwe benadering om de structurele variaties van DNA op de expressie van genen te bestuderen. Toen we Gel-seq voor het eerst bedachten, waren er geen protocollen voor het gelijktijdig sequencen van zowel het DNA als het RNA uit hetzelfde monster.

Gelukkig zijn er nu drie gepubliceerde benaderingen die dit probleem oplossen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel genomische als transcriptomische informatie kan worden verkregen uit dezelfde set cellen voor een verwaarloosbaar toegevoegde kostprijs. Gel-seq werd oorspronkelijk ontwikkeld met rechtopstaande cassettes, maar dit protocol kan worden aangepast om met elke standaard gelelektroforese cassette te werken.

Bereid de vulstof, de hoge dichtheid en de lage dichtheid voorloper mengsels in drie buizen. Voeg de reagentia toe in de beschreven volgorde en draai het mengsel in een vortex. Voeg voortijdig geen APS of Temed toe.

Wacht tot u wordt opgedragen. Ontgast vervolgens elke gelmonomeeroplossing door eerst een naald door de dop te steken. Verbind vervolgens de naald met een huisstofzuigleiding en dompel deze assemblage onder in een ultrasonisch bad.

Wacht ongeveer een minuut tot er geen bubbels meer uit de vloeistof komen. Voeg vervolgens aan het voorlopermengsel van de vulstof Temed en APS toe en draai het kort in een vortex. Gebruik binnen drie minuten een pipet van één millimeter om zes millimeter toe te voegen aan elke gelcassette zonder te morsen.

Zorg ervoor dat de vloeistof op niveau is door de cassettes rechtop op een vlak tafeltje te plaatsen. Vul vervolgens geleidelijk de cassettes aan met ontgast, geïoniseerd water, waarbij u ervoor zorgt dat de vermenging van het polymeriserende mengsel met het water tot een minimum wordt beperkt. Laat de polymeer vervolgens een uur tot een nacht cureren.

Zodra de polymeer is uitgehard, giet het waterlaagje weg en gebruik vanaf zes centimeter afstand een zachte stroom gecomprimeerde lucht om het oppervlak van de gel te drogen. Voeg vervolgens Temed en APS toe aan de voorloper van de hoge dichtheidsgel en draai kort in een vortex. Breng binnen drie minuten 320 microliter over naar elke cassette en verspreid deze over de vulgellaag door de cassette heen en weer te schudden.

Vul vervolgens de cassettes aan met gedeïoniseerd, ontgast water en laat de polymeer ongeveer een uur uitharden. Zodra het is uitgehard, droogt u de polymeer zoals eerder. Voeg vervolgens Temed en APS toe aan het voorlopermengsel van de lage dichtheidsgel en draai het in een vortex.

Vul vervolgens snel de resterende cassettes met dit mengsel en plaats de gelkam voordat het begint uit te harden. Voeg nu het overschot van de reserve voorloper bovenop de kam toe om tijdens de polymerisatie te worden geadsorbeerd. Na het uitharden is de cassette klaar voor gebruik.

Gebruik na het converteren van het RNA naar cDNA een gel om de gewenste fractie te herstellen. Reinig eerst de elektroforesekamer grondig met enkele milliliters van een DNA-verwijderingsproduct en een pluisvrije doek. Vul vervolgens de kamer met schone, nul punt vijf XTBE en plaats het hele apparaat in een UV-crosslinking oven van 254 nanometer en steriliseer gedurende 15 minuten.

Plaats nu een Gel-seq cassette in de elektroforesekamer en vergrendel deze op zijn plaats. Verwijder vervolgens langzaam de gelkam door voorzichtig omhoog te trekken zonder de gel te scheuren. Laad nu monsters in met een pipet.

Duik de punt volledig in de putjes wanneer u monsters laadt om de kans op besmetting tussen de putjes te minimaliseren. Breng een elektrisch veld van 250 volt aan over de Gel-seq cassette gedurende 30 minuten om het gDNA te scheiden van de cDNA/RNA hybriden. Nadat u het gel hebt geladen, uitgevoerd en verzameld, snijdt u het gel met een scalpel precies onder de laag met hoge dichtheid en gooit u het vulgelgedeelte weg.

Schil vervolgens voorzichtig de resterende gel van de cassette af en gebruik zorgvuldig een schraper. Nadat u de scheiding hebt geverifieerd met behulp van een geldoc, gebruikt u een transilluminator om de banden uit te snijden. Het gDNA zou aan het begin van de gel met lage dichtheid moeten liggen en het cDNA zou op de grens tussen de gebieden met lage en hoge dichtheid moeten liggen.

Snijd nu met een scalpel de gebieden van de gel uit die gDNA en cDNA bevatten. Verwijder ook dezelfde secties van de negatieve controlebaan. Gebruik botte pincetten om de gelsecties voorzichtig over te brengen naar stripbuisjes.

Als de gel breekt, vind en breng alle gebroken stukken over naar het buisje. Maal vervolgens elk geltje af met cirkelvormige bewegingen en druk met een pipettip. Voeg voordat u de tips verwijdert 40 microliter nuclease-vrij water toe aan de gDNA en 80 microliter aan de cDNA monsters.

Verwijder vervolgens voorzichtig de tips en gooi ze weg. Bevestig nu de stripbuisjes aan een vortexmixer op 37 graden Celsius en schud ze acht tot twaalf uur. Het DNA zal zo uit de gel elueren.

Na het schudden pipet de monsters in een filterplaat met een maaswijdte van acht micron. Draai vervolgens de plaat gedurende vijf minuten op 2.600 g om de gelfragmenten uit te filteren. Til vervolgens de filterplaat op van de behuizing en gebruik een pipet om de gelvrije monsters van de plaat over te brengen naar nieuwe stripbuisjes van 200 microliter.

Voeg aan elk monster dat gDNA bevat een microliter protease toe en pipet op en neer om goed te mengen. Incubeer vervolgens de monsters gedurende 15 minuten bij 50 graden Celsius. Volg met een verwarmingsactivatie gedurende 15 minuten bij 70 graden Celsius.

Deze nucleosome depletie stap is cruciaal. Gebruik vervolgens een naald van 18 gauge om een gat in de dop van elke monsterbuis te prikken. Gebruik vervolgens een vacufuge om de gDNA monsters terug te brengen tot vijf microliter en de cDNA monsters tot 10 microliter.