Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Het algemene doel van deze methodologie is om een van de eerste stappen in de activering van een initiator-caspase te visualiseren. Deze stap wordt geïnduceerde nabijheid genoemd en vindt plaats wanneer caspase-moleculen samenkomen om actieve dimeren te vormen tijdens apoptotische celdood. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het caspase-gebied, zoals wanneer, waar en hoe efficiënt specifieke initiator-caspases kunnen worden geactiveerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men de assemblage van caspase-activeringscomplexen in levende cellen in realtime kan visualiseren. Deze biomoleculaire fluorescentie-complementatiemethode maakt gebruik van fragmenten van het thyroxine-eiwit, Venus, die zijn doordrenkt in een caspase. De fragmenten zijn op zichzelf niet fluorescerend, maar wanneer de caspase geïnduceerde nabijheid ondergaat, brengt dit de twee Venus-helften samen en lichten ze op.

Om de cellen te transfecteren, voegt u eerst 12 microliters van het transfectiereagens toe aan 750 microliters gereduceerd serummedium in een sterilet buisje. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 nanogram van een reporter-plasmide toe aan een sterilet 1,5 milliliterbuisje voor elke put die getransfecteerd moet worden.

Voeg 20 nanogram van elk caspase BiFC-plasma toe aan elke buis. Breng elke buis op tot een totaal volume van 100 microliter door gereduceerd serummedium toe te voegen. Gebruik een P200-pipet om 100 microliter van de transfectiereagensoplossing druppelsgewijs aan het plasmidemengsel toe te voegen.

Na het incuberen van het plasmide-transfectiereagensmengsel gedurende 20 minuten op kamertemperatuur, zuigt u het medium uit de cellen met een pipet of met zuiging. Pipet vervolgens met een P1000-pipet voorzichtig 800 microliter serumvrij medium langs de zijkant van de put. Voeg met een P200-pipet 200 microliter van het DNA-lipidcomplex druppelsgewijs toe aan elke put.

Incubeer de cellen gedurende drie uur in een weefselkweekincubator op 37 graden Celsius. Verwijder na de incubatie het serumvrije medium dat de DNA-lipidcomplexen bevat door middel van zuiging of met de pipet, zorg ervoor dat u de monolaag niet verstoort. Pipet voorzichtig twee milliliter voorverwarmd compleet groeimedium langs de zijkant van elke put en incubeer de cellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Voor de data-acquisitie, voert u de inductie van caspase-activering uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Zet de microscoop aan volgens de instructies van de fabrikant en start de acquisitiesoftware. Selecteer het 60x of 63x olie-objectief en plaats een druppel olie op het objectief.

Plaats vervolgens de kweekschaal op de microscooptafel met behulp van de juiste plaathouder. Zet de verwarming aan en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius. Focus op de reporterfluorescentie met behulp van de RFP-laser of -filter.

Voer de procentuele laservermogen in op 50% en de belichtingstijd op 100 milliseconden voor zowel Venus als RFP als startpunt om de optimale instellingen voor het experiment te bepalen. Schakel de live-opname in en inspecteer het resulterende beeld en de weergegeven histogrammen voor beide kanalen. Als het signaal laag is en het beeld moeilijk te onderscheiden is, verhoog dan het procentuele laservermogen en/of de belichtingstijd in stappen totdat het signaal en het beeld er goed uitzien.

Selecteer vervolgens of open de Z stack-module in de microscoopsoftware. Pas de focus in één richting aan totdat de cel niet langer zichtbaar is. Selecteer dit als de bovenste positie.

Pas de focus in de tegenovergestelde richting aan totdat de cel weer niet langer zichtbaar is en selecteer dit als de onderste positie. Kies de optimale stapgrootte en start de acquisitie. Pas indien nodig de weergavehistogram aan om het visuele uiterlijk van het fluorescente signaal te verbeteren.

Gebruik ten slotte driedimensionale renderingsoftware om het 3D-beeld te reconstrueren. Als er een kooldioxidebron beschikbaar is, plaats dan het kooldioxide-afgifteapparaat bovenop de plaathouder. Stel het kooldioxidegehalte in op 5% en schakel de kooldioxideregelaar in vanuit de software.

Navigeer naar een veld met getransfecteerde cellen. Visualiseer het levende beeld van de cellen zoals verkregen door de camera en weergegeven door de acquisitiesoftware op het computerscherm met behulp van de RFP-laser. Voer vervolgens de instellingen voor het procentuele laservermogen en de belichtingstijd voor de RFP-laser in.

Voer vervolgens de instellingen in voor het procentuele laservermogen en de belichtingstijd voor het YFP-laserlicht. Kies voor elke put van de plaat een aantal verschillende posities die een of meer cellen bevatten die de reporter tot expressie brengen. Voer het tijdsinterval tussen elk frame van de tijdsverloop in en het totale aantal te nemen frames.

Bezoek elke positie opnieuw en corrigeer en werk de focus bij indien nodig. Begin de tijdsverloop en sla de gegevens op. Analyseer tenslotte de gegevens met behulp van beschikbare beeldvormingssoftware zoals beschreven in het tekstprotocol.

Hier wordt een voorbeeld van caspase-2 BiFC na DNA-schade getoond. Cellen werden behandeld met een topoisomerase een-remmer: Camptothecin. Het rode fluorescente eiwit, mCherry, werd gebruikt als reporter om aan te tonen dat de cellen de BiFC-sonde tot expressie brengen en om het totale aantal cellen te helpen visualiseren.

Venus-fluorescentie wordt in groen getoond en de grote puntjes vertegenwoordigen geïnduceerde nabijheid van caspase-2. Om een hoge resolutie visualisatie van de subcellulaire lokalisatie van het caspase-activeringscomplex te bieden, kunnen enkele cellen in drie dimensies worden afgebeeld. Caspase-2-activering wordt hier in groen getoond en de kern is in rood weergegeven.

De orthogaanle snijbeeldenweergave van de cel wordt getoond waarbij het xy-vlak, het yz-vlak en het xz-vlak zij aan zij kunnen worden gevisualiseerd. Het driedimensionale beeld kan ook worden weergegeven in een film waarbij de cel rond de y