Name: Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Leer caspase BiFC-imaging om activeringscomplexen in levende cellen te visualiseren. Deze methode maakt real-time observatie van initiator caspase-dimerisatie mogelijk voor apoptoseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen alle eerdere leden van de lab Bouchier-Hayes die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek te erkennen. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een Texas kinder ziekenhuis Pediatric Pilot award naar LBH. Wij danken Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) voor toestemming om te nemen van de gegevens gepubliceerd in samenwerking met haar team. De ontwikkeling van de reagentia die beschreven werd gesteund door het Cytometry en de cel Sorteren kern aan Baylor College of Medicine met financiële steun van de NIH (NIAID P30AI036211, NCI, P30CA125123 en NCRR S10RR024574) en de hulp van Joel M. Sederstrom

1. bereiding van de cellen en cultuur gerechten
Opmerking: Voer stappen 1-3 in een weefselkweek laminaire flow hood. Draag handschoenen.
<ol><li>Als met glazen bodem gerechten, jas het glas met fibronectine. Ga verder met stap 1.2 als met behulp van kunststof gerechten.<ol>
<li>Maak een oplossing van 0,1 mg/mL van fibronectine: verdunnen 1 mL 1 mg/mL fibronectine oplossing in 9 mL 1 X PBS.</li>
		<li>Dekking van de glazen bodem van elk putje met 0,5-1 mL fibronectin en incubeer gedurende 1-5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Met behulp van een precisiepipet, de oplossing van fibronectine verzamelen en opslaan bij 4 ° C. Opmerking: De fibronectine oplossing kan meerdere malen hergebruikt.</li>
		<li>Spoel het glas een keer met 1-2 mL 1 X PBS, en gecombineerd uit PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 x 10 bord5 cellen per putje van de plaat van een 6-well in 2 mL van de juiste cel cultuur media (Zie tabel 1 voor cel nummers te gebruiken voor verschillende formaat putten). Als met behulp van een cellijn die stabiel de caspase BiFC onderdelen uitdrukt (zie discussie), plaat 2 x 105 cellen en overgaan tot de behandeling stap (stap 3).</li>
	<li>Cellen zich te houden aan de schotel 's nachts bij 37 ° C in een broedstoof weefselkweek toestaan.</li>
</ol>2. de transfectie van cellen in te voeren van de caspase BiFC onderdelen
<ol><li>Transfect cellen met de juiste transfectiereagens. Opmerking: Dit protocol schetst de instructies voor de Lipofectamine 2000, die is geoptimaliseerd voor minimale toxiciteit. Dit protocol is met succes gebruikt in de Hela cellen, MCF7 cellen en LN18 cellen. Met behulp van extra transfectie reagentia volgt u de instructies van de fabrikant als optimaliseren indien nodig.<ol>
<li>Voeg 12 µL van het transfectiereagens aan 750 µL van verminderde serum media in een steriele buis.</li>
		<li>Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg 10 ng van een verslaggever plasmide (een plasmide codering een TL proteïne, b.v. rood fluorescerende eiwit [RFP], dat zal label transfected cellen) tot een steriele 1,5 mL koker voor elk putje om te zijn transfected.</li>
		<li>Toevoegen van 20 ng van elke caspase BiFC plasmide (b.v.20 ng van caspase-2 prodomain [Pro C2]-VC en 20 ng van C2 Pro-VN) aan elke buis (tabel 2).</li>
		<li>Elke buis tot een totaal volume van 100 ÂµL brengen door verminderde serum media toe te voegen.</li>
		<li>Met behulp van een pipet p200, voeg 100 µL van transfectie reagens oplossing uit stap 2.1.2 aan de plasmide mengsel op een dropwise manier.</li>
		<li>Incubeer de plasmide-transfectie reagens mix gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>De media van de cellen met behulp van een precisiepipet of afzuigen gecombineerd en vervolgens met behulp van een precisiepipet p1000 Pipetteer 800 µL van de serum mediagroep zachtjes langs de zijkant van de put.</li>
		<li>Met behulp van een pipet p200, 200 µL van het DNA-lipide-complex dropwise toevoegen aan elk putje.</li>
		<li>Incubeer de cellen in een weefselkweek incubator bij 37 ° C gedurende 3 uur.</li>
		<li>Zorg niet te verstoren de enkelgelaagde, verwijderen van de serum-mediagroep bevattende de lipide-DNA complexen aspiratie met behulp van zuiging of met een pipet.</li>
		<li>Pipeteer 2 mL van voorverwarmde (37 ° C) volledige groei media zachtjes langs de zijkant van elk putje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een weefselkweek incubator voor 24-48 h voor optimale eiwit expressie.</li>
</ol>3. activering van caspase-inductie
<ol><li>Behandelen met een drug of stimulus dat caspase activering ongeveer 24 h na transfectie induceert.<ol>
<li>Voeg de gewenste concentratie van het geneesmiddel aan opgewarmd vooraf (37 ° C) imaging media (volledige groei media aangevuld met Hepes [20 mM, pH 7,2-7,5] en 2-mercaptoethanol [55 µM]) en meng voorzichtig (tabel 3).</li>
		<li>De media van de cellen met behulp van een precisiepipet of afzuigen gecombineerd en vervolgens met behulp van een precisiepipet, Pipeteer 2 mL van de oplossing van 3.1.1 zachtjes langs de zijkant van de put.</li>
		<li>Imaging media zonder de drug toevoegen aan één putje als een onbehandeld controlegewas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen in een incubator weefselkweek bij 37 ° C of ga verder bij stap 4.3 voor een time-lapse experiment.</li>
</ol>4. Caspase BiFC data-acquisitie
<ol><li>
Caspase BiFC voor enige tijd punt verwerving
	<ol>
<li>Zet de Microscoop en fluorescerende lichtbron, na instructies van de fabrikant.</li>
		<li>De cellen onder de RFP filter en de focus op de verslaggever gene fluorescentie te zoeken.</li>
		<li>Met behulp van een hand-tally counter, tellen alle RFP-positieve cellen in het gezichtsveld. Noteer het nummer.</li>
		<li>Met behoud van hetzelfde gezichtsveld, overschakelen naar het GFP-filter (of YFP filter indien beschikbaar) en, met behulp van een hand-tally counter, het aantal rode bloedcellen dat ook groen zijn (Venus-positief). Heen en weer schakelen tussen de twee filters om ervoor te zorgen dat alleen de rode bloedcellen worden geëvalueerd voor Venus-positiviteit. Noteer het nummer (Figuur 3).</li>
		<li>Het tellen van ten minste 100 RFP-positieve cellen uit elk van de drie afzonderlijke gebieden van de plaat.</li>
		<li>In elk gebied, het percentage van Venus-positieve transfected cellen (d.w.z. rode bloedcellen die ook groene) te berekenen. Het gemiddelde van de resulterende percentages om de standaarddeviatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Driedimensionale beeldvorming van caspase BiFC
	<ol>
<li>Zet de Microscoop na instructies van de fabrikant en de acquisitie software starten.</li>
		<li>Selecteer de 60 x of 63 x olie doelstelling en breng een druppel olie op het doel</li>
		<li>Plaats de schotel van cultuur in het werkgebied van de microscoop met behulp van de juiste plaat houder.</li>
		<li>Met behulp van een epifluorescence lichtbron en de Microscoop oog stuk of de confocal lasers en het computerscherm, navigeer naar een gebied van belang.</li>
		<li>Focus op de verslaggever fluorescentie met behulp van de RFP laser of het filter.</li>
		<li>Als epifluorescence heeft tot op dit punt is gebruikt, de lichtbron naar de confocal lasers en visualiseer het live beeld van de cellen als verworven door de camera en weergegeven door de acquisitie software op het computerscherm.</li>
		<li>Met behulp van de joystick-controle en het wiel van de focus, fine-tunen de focus en de positie van de cellen zodat de cellen zich in het midden van de zoeker. Kies cellen die zijn gescheiden van elkaar en elkaar niet overlappen.</li>
		<li>Input het percentage laser vermogen 50% en de belichtingstijd bij 100 ms voor zowel Venus en RFP als uitgangspunt om te bepalen van de optimale instellingen te gebruiken voor het experiment.</li>
		<li>Zet de live opname en inspecteren van de resulterende afbeelding en de bijbehorende display histogrammen voor beide kanalen.</li>
		<li>Als het signaal laag is en de afbeelding moeilijk is uit te maken, Verhoog de percentage laser macht en/of blootstelling tijd in stappen totdat het signaal in de afbeelding ziet er goed uit.</li>
		<li>Zorg ervoor dat het signaal niet verzadiging bereikt. Inspecteer het histogram weergave om ervoor te zorgen dat er een duidelijke piek is zichtbaar voor elke fluor. Als de piek het gehele histogram display omvat, ingang lagere laser macht en blootstelling instellingen (Figuur 2).</li>
		<li>Visualiseren (onbehandelde of niet-transfected) cellen onder dezelfde voorwaarden om ervoor te zorgen dat het signaal specifiek is. Opmerking: Enkele kleur transfectants kan ook worden gebruikt om te bepalen voor crossover, maar als de signalen ruimtelijk gescheiden (bijvoorbeeld mitochondriale versus cytosolische zijn) is dit niet nodig.</li>
		<li>Selecteer of open de module van de stapel Z in de Microscoop software.</li>
		<li>Met behulp van de focus knop, bij benadering de focal positie overeenkomt met het midden van de cel.</li>
		<li>Pas de focus in één richting totdat de cel is niet meer zichtbaar, Selecteer deze optie als de bovenste positie.</li>
		<li>Pas de focus in de tegenovergestelde richting totdat de cel opnieuw niet meer zichtbaar is en selecteer deze optie als de onderste positie.</li>
		<li>Kies de optimale stap-grootte (meestal ongeveer 20 µm) en begin van de acquisitie om de camera te nemen automatisch één afbeelding in elk kanaal op elk van de 20 µm stappen tussen de boven- en onderkant posities.</li>
		<li>3D-rendering software gebruiken voor het reconstrueren van de 3D-afbeelding (Figuur 4film 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Time-lapse beeldvorming van caspase BiFC
	<ol>
<li>Ten minste 1 uur vóór het experiment, zet de Microscoop en de temperatuur instellen tot 37 ° C.</li>
		<li>Selecteer de 40 x 60 x en 63 x olie doelstelling en breng een druppel olie op het doel.</li>
		<li>Plaats de schotel van cultuur in het werkgebied van de microscoop met behulp van de juiste plaat houder.</li>
		<li>Als een CO2 bron beschikbaar is, plaatst u de CO2 -levering apparaat (meestal een plexiglas deksel aangesloten op de buis van Eustachius de CO-2 levert) op de top van de houder van de plaat. De CO2 -niveau ingesteld op 5% en inschakelen van de CO2 -controller van binnen de software. Als een CO2 bron niet beschikbaar is, ook 20 mM Hepes buffer media.</li>
		<li>Navigeer naar een gebied van transfected cellen en visualiseer het live beeld van de cellen als verworven door de camera en weergegeven door de acquisitie software op het computerscherm met behulp van de laser van RFP.</li>
		<li>Volgende stappen 4.2.8-4.2.12, ingang de instellingen voor percentage laser macht en blootstelling tijd voor de RFP-laser. Deze waarden zo laag mogelijk houden terwijl nog bekwaam om te ontdekken de fluorescent signaal.</li>
		<li>Met behulp van een positieve controle proeven (Zie tabel 3 voor voorbeelden), volg stappen 4.2.8-4.2.12 aan de ingang van de instellingen voor percentage laser macht en blootstelling tijd voor de YFP laserlicht. Deze waarden zo laag mogelijk houden terwijl nog steeds kundig voor speurder Venus signaal.</li>
		<li>Kies voor elk putje van de plaat, een aantal verschillende posities met een of meer cellen, uiting geven aan de verslaggever.</li>
		<li>Voer het tijdsinterval tussen elk frame van de time-lapse en het totale aantal frames moeten worden genomen. Zorgen er is tijd om alle geselecteerde posities te verwerven voordat het volgende frame dient te worden genomen.</li>
		<li>Elke positie opnieuw te bezoeken en corrigeren en bijwerken van de focus zo nodig.</li>
		<li>Zet de focus drift correctie systeem (indien beschikbaar) om te corrigeren voor focal drift die kan ontstaan door veranderingen in temperatuur of externe trillingen.</li>
		<li>Beginnen de time-lapse en sla de gegevens.</li>
		<li>Het analyseren van de gegevens met behulp van verkrijgbare imagingsoftware (Figuur 5Movie 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Salvesen, G. S., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase mechanisms.</a> Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).</li>
<li>Boatright, K. M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of caspase activation.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).</li>
<li>Luthi, A. U., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CASBAH%3A+a+searchable+database+of+caspase+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The CASBAH: a searchable database of caspase substrates.</a> Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).</li>
<li>Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+mechanism+of+caspase-2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">The biochemical mechanism of caspase-2 activation.</a> Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).</li>
<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+model+for+apical+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A unified model for apical caspase activation.</a> Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li>
<li>Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+domains+of+death%3A+evolution+of+the+apoptosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">The domains of death: evolution of the apoptosis machinery.</a> Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).</li>
<li>Salvesen, G. S., Dixit, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation%3A+the+induced-proximity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caspase activation: the induced-proximity model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+dimerization+and+inducible+cleavage+reveal+a+requirement+for+both+processes+in+caspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation.</a> J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).</li>
<li>Riedl, S. J., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apoptosome%3A+signalling+platform+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The apoptosome: signalling platform of cell death.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li>
<li>Tinel, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIDDosome%2C+a+protein+complex+implicated+in+activation+of+caspase-2+in+response+to+genotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress.</a> Science. 304 (5672), 843-846 (2004).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li>
<li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-2+activation+in+the+absence+of+PIDDosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation.</a> J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).</li>
<li>Manzl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIDDosome-independent+tumor+suppression+by+Caspase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2.</a> Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPM1+directs+PIDDosome-dependent+caspase-2+activation+in+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus.</a> J Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death Dis. 6, e1813(2015).</li>
<li>Aaronson, D. S., Horvath, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+road+map+for+those+who+don%27t+know+JAK-STAT%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A road map for those who don't know JAK-STAT.</a> Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).</li>
<li>Manton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+death+by+the+novel+proteasome+inhibitor+marizomib+in+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo.</a> Sci Rep. 6, 18953(2016).</li>
<li>Fan, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+mCherry+as+a+new+red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+for+visualizing+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).</li>
<li>Chu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+far-red+bimolecular+fluorescence+complementation+system+that+allows+for+efficient+visualization+of+protein+interactions+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions.</a> Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).</li>
<li>Karbowski, M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mitochondrial+morphology+in+healthy+cells+and+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis.</a> Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).</li>
<li>Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CARD+plays+a+critical+role+in+ASC+foci+formation+and+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling.</a> Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).</li>
<li>Szymczak, A. L., Vignali, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+2A+peptide-based+strategies+in+the+design+of+multicistronic+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors.</a> Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).</li>
<li>Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdimer+processing+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation.</a> EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).</li>
<li>Stennicke, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-9+can+be+activated+without+proteolytic+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caspase-9 can be activated without proteolytic processing.</a> J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).</li>
<li>Slee, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+the+cytochrome+c-initiated+caspase+cascade%3A+hierarchical+activation+of+caspases-2%2C+-3%2C+-6%2C+-7%2C+-8%2C+and+-10+in+a+caspase-9-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner.</a> J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).</li>
<li>McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+cleavage+motif+selectivity+of+caspases%3A+implications+for+analysis+of+apoptotic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways.</a> Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol bespreekt het gebruik van split fluorescerende eiwitten voor het meten van caspase geïnduceerde nabijheid. Split Venus werd gekozen voor deze techniek, omdat het is zeer helder, zeer photostable en de uiteinde is snel 13. Dus, de analyse van Venus uiteinde op caspase geïnduceerde nabijheid kan bieden bijna real-time schattingen van caspase-eiwit interactie dynamiek. Venus is opgesplitst in twee iets overlappende fragmenten, het N-terminus van Venus (Venus-N of VN) aminozuren bestaande...

Het caspase protease familie staan bekend om hun belangrijke rol in apoptosis en aangeboren immuniteit 1. Vanwege hun belang, wanneer, waar, en bepalen hoe efficiënt specifieke caspases worden geactiveerd kan bieden cruciaal inzicht in de mechanismen van caspase activering trajecten. De visualisatie van de vroegste stappen in de opeenvolging van de activering van caspase kunnen de imaging gebaseerd protocol beschreven hier. Deze techniek maakt gebruik van de dynamische eiwit: eiwitinteractie dat station caspase-activering.
De caspases kunnen worden onderverdeeld in twee groepen: de caspases van de initiatiefnemer (caspase-1, -2, -4 -5, -8, -9, -10 en -12) en de caspases van de beul (caspase-3-6 en -7). De beul caspases zijn aanwezig in de cel als voorgevormde Dimeren en worden geactiveerd door de splitsing tussen de grote en kleine subeenheid 2. Wanneer geactiveerd, klieven zij talrijke structureel en regelgevend proteïnen wat resulteert in apoptosis 3. De initiatiefnemer caspases zijn de eerste caspases in het algemeen leiden tot de activering van de caspases van de beul te worden geactiveerd in een traject. In tegenstelling tot de beul caspases, worden initiatiefnemer caspases geactiveerd door dimerisatie 4,5. Deze dimerisatie wordt vergemakkelijkt door de aanwerving van inactieve monomeren aan specifieke grote molecuulgewicht complexen bekend als activering platformen. Vergadering van activering platformen wordt beheerst door een reeks van specifieke eiwit: eiwitinteractie. Deze zijn gemedieerd door geconserveerde eiwit interactie motieven aanwezig in de proform van de initiatiefnemer caspase en omvatten het dood domein (DD), dood effector domein (DED) en caspase werving domein (kaart) 6 (figuur 1A). Activering platformen omvatten over het algemeen een receptor eiwitten en een adapter-eiwit. De receptor is meestal geactiveerd bij de binding van een ligand, inducerende een conformationele verandering die het mogelijk voor de oligomerisatie van talloze moleculen maakt. De receptor werft vervolgens ofwel de caspase direct of adapter moleculen die op hun beurt de caspase aan het complex brengen. Zo komen talrijke caspase-moleculen in de nabijheid van dimerisatie toelaat. Dit staat bekend als de nabijheid van de geïnduceerde model 7. Zodra dimerized, ondergaat de caspase autoprocessing, die dient om de actieve enzym 4,8te stabiliseren. Vergadering van de Apaf1 apoptosome wordt bijvoorbeeld geactiveerd door cytochroom c na haar vrijlating uit de mitochondriën in een proces genaamd mitochondriale buitenmembraan permeabilization (MOMP). Apaf1 werft beurtelings caspase-9 tot en met een interactie die wordt gemedieerd door een kaart in beide eiwitten 9aanwezig. Soortgelijke eiwitinteractie resulteren in de vergadering van de CD95 dood inducerende signalering complexe (DISC) dat tot activering van caspase-8 leidt; de PIDDosome, die caspase-2 activeren kan; en verschillende inflammasome complexen dat caspase-1 activering 10,11,12te leiden. Dus, initiatiefnemer caspases worden gerekruteerd voor specifieke activering platformen door een gemeenschappelijk mechanisme wat resulteert in de nabijheid van de geïnduceerde en dimerisatie, waarzonder activering niet zal plaatsvinden.
Caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) is een imaging gebaseerde bepaling, die is ontwikkeld voor het meten van deze eerste stap in de activering van de caspases van de initiatiefnemer, waardoor directe visualisatie van caspase geïnduceerde nabijheid na activering platform vergadering. Deze methode maakt gebruik van de eigenschappen van de split fluorescent proteïne Venus. Venus is een helderder en meer photostable versie van gele fluorescerende eiwit (YFP) dat kan worden verdeeld in twee niet-belichting fluorescerende en iets overlappende fragmenten: de N-terminus van Venus (Venus N of VN) en de C-terminus van Venus (Venus C of VC). Deze fragmenten behouden de mogelijkheid om refold en fluorescerende wanneer in de directe nabijheid van 13geworden. Elk fragment Venus is gesmolten tot de prodomain van de caspase, de minimale gedeelte van de caspase dat zich aan het platform van de activering bindt. Dit zorgt ervoor dat de caspases niet enzymatische activiteit behouden en gelijktijdige analyse van downstream gebeurtenissen gekoppeld aan endogene gebeurtenissen dus mogelijk is. De Venus fragmenten refold wanneer de caspase-prodomains worden gerekruteerd voor de activering platform en ondergaan van de nabijheid van de geïnduceerde. (Figuur 1B). De resulterende fluorescentie van Venus kan worden gebruikt voor het nauwkeurig en specifiek bewaken de subcellular localisatie, de kinetiek en de efficiëntie van de vergadering van initiatiefnemer caspase activering platforms in afzonderlijke cellen. Imaging gegevens kan worden verkregen door confocale microscopie of standaard fluorescentie microscopie en kan worden aangepast aan een aantal verschillende microscopie benaderingen, met inbegrip van: time-lapse imaging als u wilt bijhouden van de activering van caspase in real-time; hoge resolutie beeldvorming voor de nauwkeurige analyse van subcellular localisatie; en eindpunt kwantificering van de efficiëntie van de activering.
Deze techniek werd eerst ontwikkeld om de activering van caspase-214onderzoeken. Terwijl het platform van de activering van caspase-2 wordt beschouwd als de PIDDosome, bestaande uit de receptor PIDD (p53-geïnduceerde proteïne met een dood domein) en de adapter RAIDD (RIP-geassocieerde ICH-1/CAD-3 homologe eiwit met een dood domein), PIDDosome-onafhankelijke caspase-2 activering heeft gemeld. Dit suggereert dat extra activeren platforms voor caspase-2 15,16bestaan. Ondanks de niet wetende de volledige onderdelen van de activering van caspase-2-platform, heeft de caspase BiFC techniek toegestaan voor succesvolle ondervraging van de signaalroutes caspase-2 op het moleculaire niveau 14,17. Wij hebben ook met succes aangepast dit protocol voor de inflammatoire caspases (caspase-1, -4 en -5 -12) 18 en, in beginsel dezelfde aanpak zou voldoende moeten zijn ook het analyseren van elk van de resterende caspases van de initiatiefnemer. Dit protocol kan ook worden aangepast om te onderzoeken van andere wegen waren dimerisatie is een belangrijk signaal voor activeren. Bijvoorbeeld, worden STAT eiwitten geactiveerd door dimerisatie na fosforylering door Janus kinase (JAK) 19. Dus, het BiFC-systeem kan worden gebruikt om te visualiseren voor STAT activering evenals vele andere trajecten dynamische eiwitinteractie geregeld. Het volgende protocol biedt stapsgewijze instructies voor de invoering van de verslaggevers in cellen en methodologieën Beeldacquisitie en analyse.

<table><tbody><tr><td>6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes</td><td>Mattek</td><td>P06G-1.5-20-F</td><td></td></tr><tr><td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein</td><td>Millipore</td><td>FC010-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma</td><td>D8537-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>OPTI MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VC plasmid</td><td>Addgene</td><td>49261</td><td></td></tr><tr><td>C2-Pro VN plasmid</td><td>Addgene</td><td>49262</td><td></td></tr><tr><td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td><td></td><td></td><td>beschikbaar op aanvraag van LBH</td></tr><tr><td>HeLa cellen die stabiel de C2-Pro BiFC componenten tot expressie brengen</td><td></td><td></td><td>beschikbaar op aanvraag van LBH</td></tr><tr><td>DsRed mito plasmid</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td>vergelijkbare plasmiden die kunnen worden gebruikt als fluorescente reporters zijn te vinden op Addgene</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>2 Mercaptoethanol 1000X</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>q-VD-OPH</td><td>Apex Bio</td><td>A1901</td><td></td></tr></tbody></table>

verlichting van de trajecten voor caspase activeren met behulp van fluorescentie bimolecular complementatie

Lighting Up the Pathways to Caspase Activation Using Bimolecular Fluorescence Complementation

Het caspase-familie van proteasen spelen een essentiële rol in apoptosis en aangeboren immuniteit. Daaronder een deelgroep is bekend als initiatiefnemer caspases zijn de eerste in deze trajecten moet worden geactiveerd. Deze groep omvat caspase-2, -8, -9, alsmede de inflammatoire caspases, caspase-1, -4 en -5. De initiatiefnemer caspases worden alle geactiveerd door dimerisatie na aanwerving aan specifieke multiprotein complexen genaamd activering platformen. Caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC) is een imaging gebaseerde benadering waar gesplitst fluorescente proteïnen gesmolten aan initiator caspases worden gebruikt voor het visualiseren van de aanwerving van initiatiefnemer caspases aan hun activering platformen en de daaruit voortvloeiende geïnduceerde nabijheid. Deze fluorescentie biedt een uitlezing van één van de vroegste stappen die nodig zijn voor initiator caspase activering. Het gebruik van een aantal verschillende microscopie gebaseerde benaderingen, kan deze techniek kwantitatieve gegevens bieden op de efficiëntie van caspase activering op het bevolkingsniveau van een, alsook de kinetiek van de activering van caspase en de grootte en het aantal caspase activeren complexen op basis van de per cel.

Een voorbeeld van caspase-2 BiFC geïnduceerd door DNA-beschadiging is afgebeeld in Figuur 3. Camptothecine, een topoisomerase ik inhibitor, werd gebruikt voor het opwekken van DNA-schade en caspase-2-activering. Het rood fluorescerende eiwit-mCherry werd gebruikt als een verslaggever om te tonen dat de cellen de BiFC sonde uiten en om te helpen visualiseren het totale aantal cellen. Venus fluorescentie wordt weergegeven in het groen en de grote puncta vertege...

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

The caspase family of proteases play essential roles in apoptosis and innate immunity. Among these, a subgroup known as initiator caspases are the first ...

Het algemene doel van deze methodologie is om een van de eerste stappen in de activering van een initiator-caspase te visualiseren. Deze stap wordt geïnduceerde nabijheid genoemd en vindt plaats wanneer caspase-moleculen samenkomen om actieve dimeren te vormen tijdens apoptotische celdood. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het caspase-gebied, zoals wanneer, waar en hoe efficiënt specifieke initiator-caspases kunnen worden geactiveerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men de assemblage van caspase-activeringscomplexen in levende cellen in realtime kan visualiseren. Deze biomoleculaire fluorescentie-complementatiemethode maakt gebruik van fragmenten van het thyroxine-eiwit, Venus, die zijn doordrenkt in een caspase. De fragmenten zijn op zichzelf niet fluorescerend, maar wanneer de caspase geïnduceerde nabijheid ondergaat, brengt dit de twee Venus-helften samen en lichten ze op.Om de cellen te transfecteren, voegt u eerst 12 microliters van het transfectiereagens toe aan 750 microliters gereduceerd serummedium in een sterilet buisje. Incubeer het mengsel gedurende vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 10 nanogram van

lighting-up-pathways-to-caspase-activation-using-bimolecular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

De subcellulaire lokalisatie van eiwitten is belangrijk bij het bepalen van de spatio-temporele regulatie van cell signaling. We beschrijven hier bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) als een eenvoudige methode voor het bewaken van de ruimtelijke interacties van eiwitten in de cel.

Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie

This video describes BiFC-PALM ― a combination of photoactivated localization microscopy and bimolecular fluorescence complementation ― to assess protein-protein interactions. BiFC involves the fusion of two fluorescent protein fragments with two interacting proteins of interest. When the two proteins interact, the fragments are brought into proximity, which allows the two parts to come together and reconstitute a functional fluorescent protein. The fluorescence of a single fluorophore is...

Bimolecular Fluorescence Complementation-Coupled Photoactivated Localization Microscopy

This video demonstrates the activation of caspase proteins in human macrophages using bimolecular fluorescence complementation reporter proteins. The pro-domains of caspase-1 are fused with non-fluorescent fragments of Venus proteins, which are recruited to inflammasome complexes. The proximity of inflammasomes induces the refolding and fluorescence of Venus fragments, confirming caspase activation in the macrophages.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

De hier beschreven methode wordt gebruikt om de apoptotische signaleringskaskade te induceren in gedefinieerde stappen om de activiteit van een anti-apoptotisch bacterieel effector-eiwit te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt voor inductieve expressie van pro-apoptotische of toxische eiwitten, of voor het onderzoeken van interferentie met andere signaalwegen.

Het toepassen van een induceerbare Expression Systeem om interferentie van bacteriële virulentiefactoren met intracellulaire signalering Studie

Eiwit-eiwit-interacties worden in cellen met een ruimtelijke resolutie van nanometer gevisualiseerd door bimoleculaire fluorescentie-complementatie (BiFC) te combineren met fotogeactiveerde lokalisatiemicroscopie (PALM). Hier wordt het gebruik van BiFC-PALM beschreven voor het beeldvormen van Ras-Raf-interacties in U2OS-cellen voor het visualiseren van de nanoschalige clustervorming en diffusie van individuele Ras-Raf-complexen.

Fotogeactiveerde Localization Microscopie met Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC-PALM)

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Bioluminescentie - licht uitgezonden door een luciferase-enzym dat een substraat met kleine moleculen oxideert, een luciferine - kan worden gebruikt om fotosensorische eiwitten te activeren, waardoor een andere dimensie wordt toegevoegd aan lichtstimulatie en de manipulatie van een veelheid aan lichtgemedieerde functies in cellen op temporele en ruimtelijke schalen mogelijk wordt.

Bioluminescente optogenetica 2.0: Bioluminescentie benutten om fotosensorische eiwitten in vitro en in vivo te activeren

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Leer caspase BiFC-imaging om activeringscomplexen in levende cellen te visualiseren. Deze methode maakt real-time observatie van initiator caspase-dimerisatie mogelijk voor apoptoseonderzoek.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Meer video's verkennen