Name: Aanpassing 3 de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer 3' RACE-protocollen voor transcriptanalyse in kankercellen met verschillende DNA-polymerases. Deze methode brengt mRNA-sequenties in kaart en identificeert fusiegenen voor diagnostisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen erkennen Bettine Gibbs voor haar technische hulp.

Een laboratoriumjas, handschoenen en veiligheidsbril dragen te allen tijde tijdens het uitvoeren van alle procedures in dit protocol. Ervoor zorgen dat de containers/buizen met de fenol en guanidine isothiocyanaat reagens alleen worden geopend in een gecertificeerde kap, en de afzet van fenol afval in een container aangewezen. Het gebruik van steriele buizen DNAse/RNAse-vrije, tips, en reagentia.
1. de celkweek
<ol><li>Groeien de cellijn van HeLa en twee schorsing mantel cel lymfoom cellijnen, Granta-519 en Jeko-1, in DMEM met 10% FBS en 100 U/mL penicilline/streptomycine in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C. De cellen 1:10 verdunnen en tellen met behulp van een deeltje teller14.</li>
	<li>Plaat voor RNA extractie, 500.000 cellen per putje in een 6 goed bord (media 2 mL per putje). Na incubatie gedurende 24 h, RNA te verzamelen uit de cellen.</li>
</ol>2. RNA extractie
<ol><li>Oogsten van cellen Opmerking: Met uitzondering van de stap van centrifugeren, voeren alle vermelde stappen in de kap van een weefselkweek te handhaven van de steriliteit.<ol>
<li>Voor schorsing cellen (Jeko-1 en Granta-519):<ol>
<li>Centrifugeer bij 1,725 x g gedurende 5 min. Aspirate de media, de cellen (samen met 2 mL media) overbrengen in een tube van 15 mL, en laat de cel pellet in de onderkant van de buis.</li>
			<li>Resuspendeer de pellet cel in 50 µL van 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS). Voeg toe 500 µL van monofasische fenol en guanidine isothiocyanaat reagens aan elk monster in de buis 1,5 mL microcentrifuge. Meng goed en laat op kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten terwijl het omkeren van de buis microcentrifuge elke 1 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor Adherente cellen (HeLa):<ol>
<li>De cel cultuurmedia van elk putje gecombineerd. Voeg 1 mL PBS aan elk putje te wassen uit puin.</li>
			<li>Verwijder de PBS en 500 µL van monofasische fenol en guanidine isothiocyanaat reagens toevoegen aan elk putje.</li>
			<li>Incubeer bij RT gedurende 5 min met zachte rockende. Overbrengen naar een 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lysis van de cel<ol>
<li>Het bevriezen van de fenol en guanidine isothiocyanaat cel mengsel bij-20 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: De mix kan worden gelaten bij-20 ° C's nachts of totdat het nodig is.</li>
		<li>Ontdooi de fenol en guanidine isothiocyanaat cel mengsel op ijs. Voeg 100 µL chloroform aan de buis van de microcentrifuge in de kap van een PCR. Vortex het monster voor 10-15 s tot het mengsel roze en ondoorzichtig. Incubeer het monster op ijs (bij 4 ° C) gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten op 20,800 x g- en 4 ° C. Verwijder voorzichtig de bovenste kleurloze waterfase (~ 200 µL) en transfer naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA neerslag<ol>
<li>Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol aan elk monster. Voeg 1 µL van coprecipitant (Zie Tabel van materialen) aan elk monster om te fungeren als een drager voor RNA en helpen visualiseren het RNA in opeenvolgende stappen. Incubeer het monster bij-80 ° C gedurende ten minste 4 uur. Voor de beste resultaten, na een nacht bebroeden bij-80 ° C.</li>
		<li>Het monster overbrengen in een gekoelde centrifuge. Centrifugeer gedurende 35 min bij 20.800 x g / 4 ° C; het RNA wordt weergegeven als een blauw stipje op de onderkant van de buis. Verwijder voorzichtig het isopropanol uit het monster. Voeg 500 µL van 80% ethanol en resuspendeer de pellet door kort vortexing voor 3 s.</li>
		<li>Centrifugeer het monster bij 20.800 x g bij RT gedurende 5 min. verwijderen alle de ethanol uit het monster. Laat het monster drogen voor ongeveer 10 min. resuspendeer de steekproef in 35 ÂµL van RNAse-gratis water. Plaats op een warmte blok (65 ° C) gedurende 5 minuten om ervoor te zorgen dat de RNA volledig in oplossing is, en onmiddellijk plaats de buis op ijs.</li>
		<li>Bepaal de concentratie van totale RNA met behulp van een spectrofotometer zoals eerder beschreven, behalve 1.5 µL van het RNA-monster gebruiken in plaats van 1 µL15. Eventueel 1 µg totaal RNA worden uitgevoerd op een 1% agarose gel om de integriteit van RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase behandeling
<ol><li>Voer na kwantificering van het RNA, DNAse behandeling op de totale RNA te degraderen alle genomic DNA. Voor elk monster, voegt u de volgende reagentia uit de RNAse-Vrije DNAse kit om een totale reactie van 20 µL Meng in een aparte microcentrifuge buis:<ol>
<li>Meng 2 µL DNase 10 X reactie buffer met 4.4 µg totaal RNA. Brengen tot een totaal van 14 µL met water.</li>
		<li>Voeg 2 µL van RNase-Vrije DNAse. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten in het bijzijn van 2 µL van RNase remmer (uit de Reverse transcriptie Kit).</li>
		<li>Voeg 2 µL van stoppen oplossing en warmte op een warmte blok gedurende 10 minuten bij 70 ° C tot de inactivering van het enzym DNAse. Opmerking: DNAse behandeling is optioneel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA synthese
Voor een definitieve reactie volume van 50 µL:
<ol><li>Voor een definitieve reactie volume van 50 µL: overdracht 22 µL van de DNase RNA getrakteerd op een nieuwe buis of overdracht 4 µg totaal RNA met toegevoegde water tot een totaal volume van 22 µL aan een nieuwe buis. Voeg 2 µL van de T7 oligo dT25 primer van 10 µM primer oplossing. De volgorde voor de T7 oligo dT25 primer is 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>Uit de Reverse transcriptie kit 2 µL van de RNase remmer (20 U/µL), 8 µL van de 5 x reactie buffer, 4 µL van 10 mM dNTPs en 2 µL van de Reverse-transcriptase (200 U/µL) toevoegen. Opmerking: Instellen een reactie zonder reverse-transcriptase fungeren als een negatieve controle.</li>
	<li>Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 h. overdracht rechtstreeks aan het ijs. Verwarm de buis op 75 ° C gedurende 5 minuten en plaats de buis op ijs.</li>
</ol>5. primer Fusion Gene Transcript zoeken
<ol><li>
Primer ontwerp
	<ol>
<li>De volgorde van cDNA downloaden vanuit de browser genoom Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) en de identificatie van een regio binnen de ORF van het doel transcript (ANKHD1) stroomopwaarts van de stop codon. Kopiëren en plakken van de hele regio (tot 700 nucleotiden) met sequenties stroomopwaarts van de stop codon in de reeks post regio van de primer designsoftware (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Selecteer de optie van de aangepaste ontwerp weergeven en selecteer 10 voor het aantal inleidingen dat het systeem (resultaten om terug te keren) moet genereren en laat al het andere parameters ingesteld op standaard.</li>
		<li>Kies vijf voorwaartse primers en twee omgekeerde inleidingen die elkaar niet overlappen. Bestel inleidingen en reconstrueren met RNAse/DNAse-gratis water met een eindconcentratie van 10 µM. Meer details over algemene primer design voor PCR vallen elders16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR te identificeren van potentiële inleidingen voor gebruik in latere 3' RACE Opmerking: Om te bepalen van de uiteindelijke voorwaartse inleidingen te gebruiken in de reactie, test de ontworpen inleidingen door het opzetten van verschillende combinaties van voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor regelmatige PCR in de kap van een PCR.<ol>
<li>CDNA (2 µL) overbrengen in een tube van de PCR verse 0,5 mL. Voeg 1 µL van de voorwaartse primer en 1 µL van de omgekeerde primer (van een 10 mM primer oplossing). Maximaal 12,5 µL maken door toevoeging van 8,5 µL van nuclease-gratis water. Voeg 12,5 µL van de 2 x PCR-naar-Gel Master Mix.</li>
		<li>Gebruik van PCR thermische fietsen oorzaken: 95 ° C gedurende 2 min gevolgd door 29 cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 1 min. de laatste cyclus vastgesteldop 68 ° C gedurende 7 minuten.</li>
		<li>Na PCR, de producten worden uitgevoerd op een 1% agarose gel bevlekt met ethidiumbromide. Details voor elektroforese zijn zoals eerder beschreven met een paar wijzigingen17.<ol>
<li>Los 1 g agarose in 100 mL voor Tris-acetaat (TAE)-buffer in een maatkolf van 250 mL. Koken in een magnetron.</li>
			<li>Laat afkoelen voor 1 min en voeg 7,5 µL van ethidium bromide oplossing (10 mg/mL stockoplossing) in een zuurkast. Meng goed door de kolf zwenken en giet in een horizontale gel-apparaat. Verlaat bij RT in de zuurkast voor minstens 30 min om de gel te stollen.</li>
			<li>Bedek de gel met 1 x TAE buffer en laden 10 µL van het PCR-product op de agarose gel samen met 3-5 µL van de DNA-moleculair gewicht ladder. Op 175 V uitgevoerd voor 10 min. visualiseren de producten met behulp van een imager, en als verdere scheiding van producten noodzakelijk is, voert u de gel voor een extra 5-10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selectie van genestelde inleidingen voor 3' RACE
	<ol>
<li>Het analyseren van de resultaten van de PCR agarose gel te selecteren van de inleidingen die een duidelijke, sterke, één PCR band hebben. De 5' meest primer gebruiken (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') samen met de T7 oligodT25 primer in de eerste PCR uitvoeren.</li>
		<li>Selecteer de geneste primer die zich downstream bevindt van de eerste primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'), en met de T7 primer gebruiken (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') in de tweede set van de PCR reacties.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. optimaliseren van 3' RACE naar kaart de 3' UTR met behulp van twee verschillende enzymen
Opmerking: Er is een toename van de diversiteit van de polymerase van DNA gebruikt voor PCR; Daarom wilden we bepalen standaardvoorwaarden die kunnen worden toegepast, zelfs bij het gebruik van verschillende enzymen voor de 3' RACE PCR reacties. De omgekeerde inleidingen voor een transcript worden constant; gehouden de enige veranderingen zijn in de geneste voorwaartse primers die specifiek voor het doel transcript zijn.
<ol><li>
Protocol 1:3 ' RACE met behulp van een gemodificeerde polymerase van DNA uit Woesei Pyrococcus (Pfu)
	<ol>
<li>Eerste PCR<ol>
<li>1 µL van cDNA overbrengen in een PCR-buis en voeg 5 µL van 10 x Pfu reactie buffer. Voeg 1 µL van de eerste geneste voorwaartse primer, 1 µL van de T7 oligodT25 primer en 1 µL van dNTPs (van een oplossing van 10 mM).</li>
			<li>Tot 49 µL totale volume maken door 40 ÂµL van water toe te voegen. Voeg 1 µL van de polymerase van DNA van Pfu en meng goed. Voer de PCR met behulp van de PCR-profiel in tabel 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tweede PCR<ol>
<li>2 µL van de producten van de eerste PCR overbrengen naar een nieuwe PCR-buis en meng met 5 µL van 10 x PfuUltra II reactie buffer. Voeg 1 µL van de tweede geneste PCR Inleiding, 1 µL van de T7 inleiding en 1 µL van dNTPs (10 mM-oplossing).</li>
			<li>Tot 49 µL totale reactie volume maken door 39 ÂµL van water toe te voegen. Voeg 1 µL van de polymerase van DNA van Pfu . Voer de PCR met behulp van PCR hetzelfde profiel als de eerste PCR setup (tabel 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocol 2:3 ' RACE met behulp van een chimeer polymerase van DNA uit een DNA bindend domein gesmolten tot een Woesei-zoals het corrigeren polymerase-PCR master mix
	<ol>
<li>Eerste PCR<ol>
<li>1 µL van cDNA overbrengen in een PCR-buis. Voeg 1 µL van de eerste geneste voorwaartse primer en 1 µL van de T7 oligodT25 primer. Maximaal 25 µL maken door 22 ÂµL van water toe te voegen.</li>
			<li>Voeg 25 µL van 2 x PCR Master Mix en meng goed. Gebruik de PCR fietsen voorwaarden beschreven in tabel 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tweede PCR<ol>
<li>2 µL van de producten van de eerste PCR overbrengen naar een nieuwe PCR-buis. Voeg 1 µL van de tweede geneste PCR Inleiding samen met 1 µL van de T7 omgekeerde primer.</li>
			<li>Maximaal 25 µL maken door 22 ÂµL van water toe te voegen. Voeg 25 µL van 2 X PCR Master Mix. Voer de PCR met behulp van PCR hetzelfde profiel als de eerste PCR setup (tabel 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Controleer of de tweede PCR-product van 3' RACE.
<ol><li>Neem 5-10 µL van de tweede PCR product (evenals product uit de eerste ronde van PCRs indien het afschrift wordt overvloedig uitgedrukt) and run op een agarose gel. Instellen van de gel en uitvoeren van de elektroforese zoals hiervoor is beschreven (stappen 5.2.3.1 aan 5.2.3.3). Visualiseer resultaten op een imager.</li>
</ol>8. product zuivering en Sequencing
<ol><li>Zuiveren van de gel PCR producten van de tweede PCR met behulp van de Gel en PCR Fragment DNA Clean-Up systeem volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Uitvoeren van Sanger sequencing (ook, zenden de gel gezuiverd PCR productmonsters en passende sequencing inleidingen naar een sequencing lab). Analyseren van de gegevens rangschikken na Sanger sequencing.</li>
	<li>Downloadsoftware sequentie-analyse (Zie Tabel van materialen) en de bestanden spoor in de software importeren. Gebruik de individuele PURE Base QVs (kwaliteit waarden) te verkrijgen de Base Bel informatie18. Download het chromatogram met hoge kwaliteit sporen voor weergave. Optioneel: Het gezuiverde product gel kan worden gekloond met behulp van een passende klonen kit en het geïsoleerde klonen verzonden voor Sanger sequencing.</li>
</ol>

<ol><li>Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+factors+in+pre-mRNA+3%27-end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).</li>
<li>Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+end+mRNA+processing%3A+Molecular+mechanisms+and+implications+for+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease.</a> EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).</li>
<li>Derti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+atlas+of+polyadenylation+in+five+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals.</a> Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+amplification+of+3%E2%80%B2+cDNA+ends+%283%E2%80%B2-RACE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Masamha, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFIm25+regulates+glutaminase+alternative+terminal+exon+definition+to+modulate+miR-23+function%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function.</a> RNA. 22 (6), 830-838 (2016).</li>
<li>Rodu, B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002962915361474">Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within.</a> Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).</li>
<li>Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1385/0-89603-483-6:233">PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology</a>. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).</li>
<li>Freeman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+full-length+transcripts+and+transcript+variants+using+5%27+and+3%27+RACE%5BTitle%5D)+AND+%22Lipoproteins+and+Cardiovascular+Disease%3A+Methods+in+Molecular+Biology+%28Methods+and+Protocols%29%22%5BJournal%5D)">Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE.</a> Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).</li>
<li>Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+characterization+of+a+novel+CCND1%2FMRCK+gene+fusion+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma.</a> J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Parker, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenic+FGFR3-TACC3+gene+fusion+escapes+miR-99a+regulation+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Investig%22%5BJournal%5D)">The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma.</a> J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).</li>
<li>Prakash, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+conjoined+genes%3A+Another+mechanism+for+gene+regulation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes.</a> PLOS ONE. 5 (10), e13284(2010).</li>
<li>Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+complexity+of+gene+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The emerging complexity of gene fusions in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>International Committee For Standardization In, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+evaluation+of+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">Protocol for evaluation of automated blood cell counters.</a> Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J Vis Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+Basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+primer+specific+filter+metrics+for+the+assessment+of+mitochondrial+DNA+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data.</a> Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).</li>
<li>Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+better+probes%3A+Effect+of+probe+size%2C+mismatch+position+and+number+on+hybridization+in+DNA+oligonucleotide+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays.</a> J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/365f/f55d5d1ca2c64665cf11eaf1a856dc464a19.pdf">The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency.</a> Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).</li>
<li>Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27896140">Multi-template polymerase chain reaction.</a> Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nat Commun. 5, 4846(2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Ondanks de komst van massale parallelle sequencing technologieën, op basis van het gen-door-gen, blijft 3' RACE de gemakkelijkste en meest economische methode om de PAS en nucleotiden grenzend aan de staart van de poly(A) te identificeren. De hier beschreven aanpassing breidt uit met behulp van 3' RACE te versterken én sequenties die ook een deel van de ORF, de stop codon en de gehele 3' UTR van het afschrift van de mRNA ANKHD1 kaart. Een groot voordeel van 3' RACE is dat de producten van 3' RACE met een paar kl...

De vorming van de 3'-eind is een cruciale stap in de maturatie van mRNA dat bestaat uit het splijten van de pre-mRNA stroomafwaarts van een PAS gevolgd door de toevoeging van ~ 250 untemplated adenines, waaruit de poly(A) staart1,2. De poly(A)-bindend-proteïne (PABP) bindt aan de staart van de poly(A), en dat de transcriptie van mRNA beschermt tegen afbraak, en vergemakkelijkt vertaling1.
Huidige schattingen blijkt dat 70% van menselijke genen meerdere PASs hebben, en dus het ondergaan van alternatieve polyadenylatie, wat resulteert in meerdere 3' einden3. Het is dus belangrijk om te identificeren waar de poly(A) staart hecht aan de rest van de 3' UTR, evenals het identificeren van de PAS gebruikt door een bepaald afschrift. De komst van de volgende generatie sequencing heeft geleid tot de gelijktijdige identificatie van de 3' UTRs en de PASs van duizenden genen. Deze toename van sequencing mogelijkheden heeft de ontwikkeling van bioinformatic algoritmen voor het analyseren van gegevens met betrekking tot alternatieve polyadenylatie van de 3'-eind vereist. Voor de detectie van DOVO of validering van de PAS en vandaar in kaart brengen van 3' eind van afzonderlijke genen van grootschalige sequencing gegevens, blijft 3' RACE de methode van keuze4,5. De sequenties die zijn opgenomen in de cDNA producten van 3' RACE normaal bevatten slechts een gedeelte van de 3' UTR waarin de poly(A) staart, de breukzijde, de PAS en de sequenties stroomopwaarts van de PAS. In tegenstelling tot de PCR, waarvoor het ontwerp en gebruik van gene specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen, vereist 3' RACE alleen twee gene specifieke geneste voorwaartse primers. Vandaar, PCR vereist een meer gedetailleerde kennis van de nucleotide-volgorde van een groot gebied van het gen wordt versterkte4,6. Aangezien 3' RACE gebruikt keren hetzelfde primer dat doelstellingen de poly(A) staart voor alle polyadenylated RNA afschriften, alleen de voorwaartse inleidingen moeten gene specifieke, dus alleen vereist kennis van een aanzienlijk kleinere regio van het mRNA. Hierdoor is de versterking van de regio's waarvan sequenties niet volledig gekenmerkt4,7 zijn. Dit heeft toegestaan 3' RACE worden gebruikt niet alleen om te bepalen van de 3'-eind van een gen, maar om ook bepalen en karakteriseren van grote gebieden stroomopwaarts van de PAS die een aanzienlijk deel van de 3' UTR vormen. Door het combineren van 5' RACE met de gewijzigde 3' RACE die grotere porties van de 3' UTR en flankerende gebieden omvat, is het mogelijk om volledig volgnummer of kloon van een hele mRNA transcriptie van het einde 5' aan de 3'-eind8.
Een voorbeeld van deze toepassing van gemodificeerde 3' RACE is de recente identificatie van een roman CCND1-MRCK fusion gene transcriptie van mantel cel lymfoom cellijnen en kankerpatiënten. De 3' UTR bestond uit sequenties van genen van zowel de CCND1 als MRCK en was recalcitrante aan miRNA voorschrift9. De twee geneste CCND1 specifieke voorwaartse primers zijn complementair aan de regio onmiddellijk aangrenzende en "downstream" van de CCND1 stop codon. Hoewel de hele transcriptoom sequentie samen met specifieke bioinformatic hulpmiddelen kan worden gebruikt voor het detecteren van gene fusies binnen de 3'-UTR10, vele labs kunnen onvoldoende financiële middelen of bioinformatic deskundigheid om te maken gebruik van deze technologie. Vandaar, 3' RACE is een alternatief voor DOVO identificatie en validatie van nieuwe fusion genen met betrekking tot de 3' UTR. Gezien de drastische toename van het aantal gerapporteerde fusion genen, alsmede afschriften doorlezen, 3' RACE uitgegroeid tot een krachtig instrument in het karakteriseren van gen-sequenties11,12. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat verschillende reeksen binnen de 3' UTR, evenals de lengte van de 3' UTR kan invloed hebben op mRNA transcript stabiliteit, lokalisatie, vertaalbaarheid en functie13. Gedeeltelijk het gevolg van een verhoogde belangstelling voor in kaart brengen van de transcriptome, is er een toename van het aantal verschillende polymerase van DNA wordt ontwikkeld voor gebruik in het lab. Het is belangrijk om te bepalen wat typen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de 3' wedstrijdprotocol in om te gebruiken het beschikbare repertoire van de polymerase van DNA.
Dit werk verslagen aanpassing 3' RAS om de gehele 3' UTR in kaart, de PAS, en de 3' eind breukzijde van het afschrift van de ANKHD1 met behulp van geneste inleidingen binnen de ANKHD1 afdeling van de chat-kopie en twee verschillende DNA-polymerase.

<table><tbody><tr><td>HeLa cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervicale kankercellijn.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantelcel-lymfoom cellijn.</td></tr><tr><td>Granta-519 cellen</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantelcel-lymfoom cellijn.</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Foetaal runderserum voor celcultuur.</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibioticum en antimycoticum.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco merkcelcultuurmedia met GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase en RNAse vrij water (niet DEPC behandeld).</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagens alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagens</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monofasische fenol- en guanidine isothiocyanaatoplossing.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&nbsp; bevattende ladingskleurstof gebruikt in routinematige snelle PCR-tests en primerzoeken.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase behandelingskit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix met HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix bevattende een chimaerische DNA polymerase bestaande uit een DNA bindingsdomein gefuseerd met een Pyrococcus-achtige proof-reading polymerase en andere reagentia.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Gemodificeerde DNA Polymerase van Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcriptie Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Gebruikt voor&nbsp; omgekeerde transcriptie van mRNA in&nbsp; cDNA synthese. Kit bevat&nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase en andere reagentia vermeld in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect grootte 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Moleculairgewicht DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Gebruikt om ethidiumbromide gekleurde agarose gel te visualiseren.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Moleculairgewicht DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrofotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&nbsp; Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Elektroforeseapparatuur-apparaat om gel op te zetten</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Voeding voor gelelektroforese.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, met One Shot&nbsp; TOP10 Chemisch Competent E. coli cellen</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood gewijd aan PCR werk.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Afzuigkap.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&nbsp;Particle&nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Deeltjesteller. Voor het tellen van cellen voor het plateren&nbsp; voor RNA extractie.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (via ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software om Sanger sequencing data te analyseren.</td></tr></tbody></table>

aanpassing 3' de snelle versterking van cdna uiteinden kaart afschriften bij kanker

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Rijping van eukaryotische mRNAs omvat 3' eind vorming, waarbij de toevoeging van een poly(A) staart. Om de kaart van de 3'-eind van een gen, is de traditionele methode van keuze 3' de snelle versterking van cDNA uiteinden (3' RACE). Protocollen voor 3' RACE vereisen het zorgvuldige ontwerp en de selectie van genestelde inleidingen binnen de 3' niet-vertaalde regio (3' UTR) van het target-gen van belang. Echter, met een paar wijzigingen het protocol kan worden gebruikt met de gehele 3' UTR en sequenties binnen het open leesraam (ORF), die een vollediger beeld van de relatie tussen de ORF en de 3' UTR. Dit is naast de identificatie van het polyadenylatie signaal (BK), evenals de website van het decolleté en polyadenylatie geboden door conventionele 3' RACE. Uitgebreide 3' RACE kan detecteren ongebruikelijke 3' UTRs, met inbegrip van gene fusies binnen de 3' UTR, en de reeks informatie kan worden gebruikt om te voorspellen van potentiële miRNA bandplaatsen evenals AU rijke destabiliserende elementen die de stabiliteit van het transcript kunnen beïnvloeden.

Geneste voorwaartse Primer zoeken:
De agarose gel van Figuur 1 toont twee verschillende PCR gel producten (banen 1 en 2) die gebruik hetzelfde toekomen primer maar verschillende omgekeerde inleidingen. Lane 3 heeft een onderscheiden PCR product en heeft een aparte voorwaartse en omgekeerde primer. De ideale inleidingen te gebruiken voor de PCR gebaseerde reactie zijn die een onderschei...

De twee verschillende 3' snelle versterking van cDNA uiteinden (3' RACE) protocollen beschreven hier maken gebruik van twee verschillende polymerase van DNA sequenties die bevatten een segment van het open leesraam (ORF), de stop codon en de gehele 3' UTR van een afschrift van het gebruik van RNA in kaart verkregen cellijnen van andere kanker.

Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de sequenties van mRNA-transcripten vanuit het drie-prime-uiteinde tot regio's binnen het eiwitcoderende gebied te bepalen door transcript-specifieke geneste primers te gebruiken in twee opeenvolgende PCR's en de gezuiverde PCR-producten te sequencen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het genetische veld, zoals het bepalen van het polyadenyleringssignaal, het stopcodon en de sequentie van de drie-prime onvertaalde regio van het transcript. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het op elk transcript kan worden toegepast als de sequentie van het kleine gebied van de open leesraam bekend is. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot kankerdiagnose, omdat het tumorspecifieke fusiegenen en splice-varianten kan detecteren.We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we nieuwe transcripten identificeerden met voorheen ongekarakteriseerde, drie-prime onvertaalde regio's. Om het protocol te starten, ontdooi de fenol en guanidine isothiocyanate celmix op ijs. Zodra het is ontdooid, voeg 100 microliter chloroform toe aan de microcentrifugebuis in een PCR-kap.Vortex de monste

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

We beschrijven de bereiding van barcode DNA-bibliotheken en daaropvolgende hybridisatie gebaseerde exon vastleggen voor de detectie van de belangrijkste kanker-geassocieerde mutaties in klinische monsters tumor door massaal parallelle "next generation" sequencing. Gerichte exon sequentie biedt de voordelen van hoge doorvoer, lage kosten en diepe sequentie dekking, hetgeen aldus hoge gevoeligheid voor het detecteren van lage frequentie mutaties.

Detecteren Somatische genetische veranderingen in tumorspecimens door Exon Capture en Massively Parallel Sequencing

Er wordt een geïntegreerd systeem beschreven voor gerichte next-generation sequencing van oncologische monsters. Dit cross-platform systeem is geoptimaliseerd voor tumorbiopsies van lage kwaliteit en lage hoeveelheid, past zich aan lage DNA-inputs aan, omvat goed gekarakteriseerde multi-variant controles en beschikt over een nieuwe variant caller die wordt geïnformeerd door kwantitatieve pre-analytische kwaliteitscontrolemaatregelen.

Integratie van Nat en droog Bench Processen Optimaliseert Gerichte next-generation sequencing van lage kwaliteit en lage hoeveelheid tumorbiopten

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Dit protocol beschrijft een methode voor de toewijzing pre-mRNA 3' eind verwerking van sites.

3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Het manuscript beschrijft een chip gebaseerde digitale PCR assay om te ontdekken een zeldzame CDH1 transcript variant (CDH1a) in normale vers bevroren en tumor weefsels verkregen van patiënten met maagkanker.

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Dit protocol beschrijft een methodologie voor multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Moleculaire cartografie met dubbele modaliteit: integratie van multiplex-mRNA-detectie met massacytometrie voor eiwitbeeldvorming

Tandem-splijsgebeurtenissen vinden plaats op plaatsen die minder dan 12 nucleotiden uit elkaar liggen. Het kwantificeren van verhoudingen van dergelijke splitsvarianten is haalbaar met behulp van een absolute kwantitatieve PCR-benadering. Dit manuscript beschrijft hoe splitsvarianten van het gen STAT3, waarbij twee splitsgebeurtenissen resulteren in Serine-701 inclusie/uitsluiting en α/β C-termini, kunnen worden gekwantificeerd.

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Leer 3' RACE-protocollen voor transcriptanalyse in kankercellen met verschillende DNA-polymerases. Deze methode brengt mRNA-sequenties in kaart en identificeert fusiegenen voor diagnostisch onderzoek.

Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Meer video's verkennen