Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Het algemene doel van deze procedure is om de sequenties van mRNA-transcripten vanuit het drie-prime-uiteinde tot regio's binnen het eiwitcoderende gebied te bepalen door transcript-specifieke geneste primers te gebruiken in twee opeenvolgende PCR's en de gezuiverde PCR-producten te sequencen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het genetische veld, zoals het bepalen van het polyadenyleringssignaal, het stopcodon en de sequentie van de drie-prime onvertaalde regio van het transcript. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het op elk transcript kan worden toegepast als de sequentie van het kleine gebied van de open leesraam bekend is. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot kankerdiagnose, omdat het tumorspecifieke fusiegenen en splice-varianten kan detecteren.

We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we nieuwe transcripten identificeerden met voorheen ongekarakteriseerde, drie-prime onvertaalde regio's. Om het protocol te starten, ontdooi de fenol en guanidine isothiocyanate celmix op ijs. Zodra het is ontdooid, voeg 100 microliter chloroform toe aan de microcentrifugebuis in een PCR-kap.

Vortex de monster gedurende 10 tot 15 seconden totdat het mengsel roze en ondoorzichtig is. Incubeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten op ijs. Na incubatie centrifugeert u het monster gedurende 15 minuten bij 20.800 g en vier graden Celsius.

Verwijder voorzichtig de bovenste kleurloze waterige fase en breng deze over in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuis. Ga vervolgens verder met precipitatie en voeg een gelijk volume isopropanol toe aan het monster. Voeg één microliter co-precipitant toe aan het monster om als drager voor het RNA te dienen en om het RNA in volgende stappen te helpen visualiseren.

Incubeer de monsters gedurende ten minste vier uur bij 80 graden Celsius. Na incubatie, breng het monster over naar een gekoelde centrifuge en centrifugeer gedurende 35 minuten bij 20.800 g en vier graden Celsius. Na het centrifugeren zal het RNA verschijnen als een blauwe vlek op de bodem van de buis.

Verwijder voorzichtig het isopropanol uit het monster. Voeg 500 microliter 80% ethanol toe en resuspendeer het pellet door kortstondig voor drie seconden te vortexen. Centrifugeer het monster opnieuw.

Verwijder alle ethanol uit het monster en laat het monster ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen. Zodra het monster droog is, resuspendeer het in 35 microliter RNase-vrij water. Plaats vervolgens het monster op een hitteblok.

Stel in op 65 graden Celsius gedurende vijf minuten om ervoor te zorgen dat het RNA volledig in oplossing is. Na het verwarmen, plaats de buis onmiddellijk op ijs. Voor een eindvolume van de reactie van 50 microliter, voeg vier microgram totaal RNA toe met toegevoegd water tot een totaal volume van 22 microliter in een nieuwe buis.

Voeg twee microliter van de Oligo dT 25 primer toe uit de 10 micromolaire primeroplossing. Voeg uit de reverse transcriptasekit twee microliter van de RNase-remmer, acht microliter van de 5x reactiebuffer, vier microliter van 10 millimolair dNTP's en twee microliter van de reverse transcriptase toe. Zet een reactie op zonder reverse transcriptase om als negatieve controle.

Incubeer de buis gedurende één uur bij 42 graden Celsius. Na incubatie, breng de buis direct op ijs voordat u deze naar de verwarmingsblok transporteert. Vervolgens verwarmt u de buis gedurende vijf minuten bij 75 graden Celsius.

Na het verwarmen bij 75 graden Celsius, plaats de buis op ijs. Breng twee microliter van het cDNA over naar een verse 0,5 milliliter PCR-buis. Voeg één microliter van de voorwaartse primer en één microliter van de achterwaartse primer toe uit een 10 millimolair primeroplossing.

Maak tot 12,5 microliter aan door 8,5 microliter nuclease-vrij water toe te voegen en voeg 12,5 microliter van de 2x PCR naar gel master mix toe. Voer vervolgens de PCR-thermocycluscondities in die op het scherm staan vermeld en voer de PCR uit. Na de PCR bereidt u een 1% agarosegel voor die is gekleurd met etidiumbromide.

Los een gram agarose op in 100 milliliter triacetaat of TAE-buffer in een 250 milliliter kolf. Kook de inhoud in een magnetron. Laat de gel een minuut afkoelen en voeg 7,5 microliter etidiumbromide-oplossing toe in een afzuigkast.

Meng goed door de kolf te schudden. Giet de inhoud in een horizontaal gelapparaat en laat de gel minimaal 30 minuten op kamertemperatuur stollen in de afzuigkast. Bedek de gel met 1x TAE-buffer en laad 10 microliter van het PCR-product samen met drie tot vijf microliter van de DNA-molecuulgewichtladder op de agarosegel.

Laat de gel 10 minuten bij 175 volt lopen. Voor de eerste PCR, breng één microliter cDNA over naar een PCR-buis en voeg vijf microliter van 10x Pfu-reactiebuffer toe. Voeg één microliter van de eerste geneste voorwaartse primer, één microliter van de T7 Oligo dT 25 primer en één microliter dNTP's toe uit een 10 millimolair oplossing.

Maak tot 49 microliter totaal volume aan door 40 microliter water toe te voegen. Voeg één microliter Pfu DNA-polymerase toe en meng goed. Vervolgens voert u de PCR uit.

Bereid vervolgens de tweede PCR voor. Breng twee microliter van de producten van de eerste PCR over naar een nieuwe PCR-buis en meng het met vijf microliter van 10x Pfu ultra twee reactiebuffer. Voeg één microliter van de tweede geneste PCR-primer, één microliter van de T7-primer en één microliter dNTP's toe.

Maak tot 49 microliter totaal reactievolume aan door 39 microliter water toe te voegen en voeg één microliter Pfu DNA-polymerase toe. Voer de PCR uit met hetzelfde PCR-profiel als de eerste PCR-opstelling. Als alternatief kan in plaats van Pfu DNA-polymerase een chimeerische DNA-polymerase worden gebruikt in de twee verschillende PCR's.

Neem vijf tot tien microliter van het tweede PCR-product en voer het uit op een agarosegel. Beeld tenslotte het resultaat af op een