Name: Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer een stroomcytometrieprotocol voor het isoleren en karakteriseren van immuuncellen uit menselijk vetweefsel. Deze methode maakt kwantitatieve en kwalitatieve analyse van immuuncelpopulaties mogelijk voor metabool onderzoek naar obesitas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedank J. van de Gaar en M. Vroomen (Universiteit Maastricht, Nederland) voor hun technische ondersteuning. Bovendien, we bedank K. Verboven, D. Hansen, J. Jocken, en E. Blaak voor het verstrekken van het bloed en weefsel biopsieën gebruikt voor het opzetten van dit protocol en de latere experimenten.

Viscerale en onderhuidse op monsters werden genomen uit de onderwerpen die zijn ingeschreven in de studie goedgekeurd door de medisch-ethische commissie Jessa ziekenhuis, Hasselt en Universiteit Hasselt (België), overeenkomstig de verklaring van Helsinki.
1. bereiding van reagentia
<ol><li>Collagenase oplossing<ol>
<li>Los 1 g van Collagenase ik in 10 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, zonder calcium en magnesium) te maken van een stamoplossing van 100 mg/mL. Bereiden van 200 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Los 1 g Collagenase XI in 10 mL PBS te maken van een stamoplossing van 100 mg/mL. Bereiden van 200 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Los 10 mg DNase ik in 10 mL PBS te maken van een stamoplossing van 10 mg/mL. Bereiden van 180 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Voeg 100 µL Collagenase I (100 mg/mL), 100 µL Collagenase XI (100 mg/mL) en 90 µL DNase I (10 mg/mL) tot en met 10 mL van de DMEM Ham F12. Maak collagenase oplossing vers voor elke isolatie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erytrocyt lysis-buffermengsel<ol>
<li>Ontbinden 0.84 g NH4Cl in 100 mL ultrazuiver water.</li>
		<li>De pH vastgesteldop 7.4 vóór gebruik. Opslaan in een maatkolf van glas bij 4 ° C.</li>
		<li>Plaats de erytrocyt lysis-buffermengsel op ijs vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FACS buffer<ol>
<li>Los 0,5 g bovien serumalbumine (BSA) in 100 mL PBS te verkrijgen van 0,5% BSA PBS.</li>
		<li>Los 65 mg NaN3 in 100 mL 0,5% BSA PBS te verkrijgen van 10 mM NaN3 0,5% BSA PBS. Winkel oplossing in een maatkolf van glas bij 4 ° C.</li>
		<li>Plaats FACS buffer op ijs vóór gebruik. Let op: NaN3 is zeer giftig. Werken in een zuurkast en Draag veiligheidsbril en handschoenen voor bescherming tijdens het verwerken van NaN3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menselijke IgG blok<ol>
<li>Los 10 mg van menselijke IgG in 10 mL PBS te verkrijgen van 1 mg/mL. Bereiden van 100 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Plaats het menselijke IgG-blok op ijs vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolatie van SVF van AT
<ol><li>1 g bij biopsie in kleine stukjes gesneden (± 2 mm2) met een scalpel en overdracht aan een 50 mL centrifugebuis (b.v., Falcon buis). Voeg 10 mL van collagenase oplossing aan elk op monster. Opmerking: Sluit het deksel van de buis volledig en draaien het deksel ¼ terug.</li>
	<li>Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C in een waterbad onder zacht schudden (60 cycli/min).</li>
	<li>De resulterende schorsing filteren met een 200 µM filter en het verzamelen van het monster in een nieuwe centrifugebuis van 50 mL. Voeg 7 mL PBS op de top van het filter te spoelen van het filter en het verkrijgen van alle cellen.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de zwevende adipocyte breuk door pipetteren. De cel pellet is de SVF. Opmerking: Verwijder de adipocyte-Fractie om te verkrijgen van SVF. Vermijd dompelen de hele tip in de steekproef omdat dit alleen de PBS en niet de drijvende adipocytes verwijdert.</li>
	<li>Resuspendeer de SVF in 5 mL PBS te verwijderen collagenase, filter de opschorting met een 70 µM filter spoelen van het filter met 5 mL PBS en Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 mL erytrocyt lysis-buffermengsel.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 min op ijs. Voeg 7 mL PBS na incubatie.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 280 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
</ol>3. kleuring van SVF Stroom Cytometry p.a.
<ol><li>Los van de cel pellet in 90 µL 4 ° C FACS buffer en voeg 10 µL van 1 mg/mL menselijke IgG blok. Verdeel de celsuspensie in 2 wells van een 96 v-vorm goed plaat. Plaats van de plaat op ijs en laat het menselijke IgG blok Incubeer gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Voeg 100 µL FACS buffer aan elk monster te wassen en centrifugeren van de plaat voor 5 min met 280 x g bij 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het kantelen van de plaat ondersteboven in één vloeiende beweging zonder te tikken op de plaat. Opmerking: Zorg ervoor dat alle resterende vloeistof verwijderen vanaf de bovenkant van de plaat met een tissue terwijl de plaat ondersteboven te houden.</li>
	<li>Antilichaam cocktails voor macrophage en DC deelverzamelingen (FACS panel 1) en voorbereiden voor T - en B-cel subsets (FACS panel 2) zoals beschreven in tabel 1 en tabel 2. De volumes beschreven in tabel 1 en tabel 2 worden geselecteerd na het optimaliseren van de antilichaam-concentraties en voldoende zijn voor een BTW- of zat monster. Opmerking: In FACS panel 1, de markers, CD303 en CD141 gebruiken om te bevestigen dat CD11C+ CD11Blaag cellen zijn DCs. Het is echter raadzaam om uit te sluiten van deze markers van het deelvenster te nemen een leven/dood kleuring. Beide FACS paneel 1 en 2 kan worden gecombineerd met de levensvatbaarheid van de LIVE/DEAD Fixable Red Dead cel Stain Kit kleuring wanneer ongebruikte exclusief CD303 in deelvenster 1 als het PE-kanaal zal zijn. Uitvoeren van levensvatbaarheid kleuring volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 29.5 µL antilichaam cocktail voor FACS paneel 1, en 23 µL antilichaam cocktail voor FACS panel 2. Incubeer gedurende 30 min. in het donker op het ijs.</li>
	<li>Voeg 150 µL FACS buffer aan elk putje en resuspendeer de pellet van de cel voor het uitvoeren van een tweede wassen stap. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 280 x g- en 4 ° C. Verwijder de bovendrijvende vloeistof door het kantelen van de plaat ondersteboven.</li>
	<li>Voeg 150 µL 1% formaldehyde oplossing aan elk putje te lossen van de cellen. De celsuspensie van elk putje overbrengen aan de overeenkomstige FACS buis door pipetteren met een pipet P200. Opslaan FACS buizen bij 4 ° C in het donker tot 7 dagen. Nota: Directe meting is ook mogelijk. 150 µL FACS buffer toevoegen aan elk putje in plaats van 1% formaldehyde, overdracht van de cellen door pipetteren met een pipet P200 aan de overeenkomstige FACS buizen en analyseren van de cellen. Let op: Formaldehyde is zeer giftig. Formaldehyde oplossingen voor te bereiden tijdens het werken in een zuurkast te voorkomen van inademing en draag handschoenen en veiligheidsbril voor bescherming.</li>
</ol>4. Stroom Cytometry analyse
<ol><li>Vóór de eerste meting, kunt een onbevlekt negatieve controle instellen de voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC). De spanningen van de stroom cytometer volgens de instructies van de fabrikant zodanig aanpassen dat alle populaties van belang zichtbaar in de FSC en SSC grafiek zijn en een onderscheid tussen het puin en levende cellen kan worden gemaakt.</li>
	<li>Multi kleur compensatie analyses uit te voeren met antilichaam vangen kralen volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Fluorescentie minus één (FMO) controles voor te bereiden door de mix van antilichaam maar uitsluiten van één antilichaam van de mix. Doe dit voor elke antilichaam, 8 antilichaam mixen voor FACS paneel 1 en 6 antilichaam mixen voor FACS panel 2 maken. Deze mixen FMO antilichaam worden gebruikt om vlekken van SVF zoals eerder is beschreven in dit protocol.</li>
	<li>Meet alle FMO besturingselementen en de gating strategie gebaseerd op FMO besturingselementen instellen. Gebruik de FMO-besturingselementen om te detecteren van mogelijke auto-fluorescentie van de cellen. Opmerking: Door het verwijderen van één antilichaam van de mix, elk niveau van de fluorescentie ontdekt in dit kanaal is een achtergrond/autofluorescent-signaal. Vandaar, door het vergelijken van de verschillende FMO controleresultaten FACS, poorten op specifieke populaties ervoor te zorgen dat de gatings zijn gebaseerd op positieve cellen en niet op basis van auto-fluorescentie kunnen worden getrokken.</li>
	<li>Vortex de FACS buizen bij 800 rpm alvorens hen te plaatsen in de cytometer van de stroom en begint de meting. Opmerking: Een minimum van 50.000 evenementen in de levende poort wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat voldoende cellen worden gemeten vanaf elke subpopulatie.</li>
</ol>

<ol><li>McNelis, J. C., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%2C+immunity%2C+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages, immunity, and metabolic disease.</a> Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).</li>
<li>Makki, K., Froguel, P., Wolowczuk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+obesity-related+inflammation+and+insulin+resistance%3A+cells%2C+cytokines%2C+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in obesity-related inflammation and insulin resistance: cells, cytokines, and chemokines.</a> ISRN Inflamm. 2013, 139239(2013).</li>
<li>DeFuria, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+inflammation+in+obesity+and+type+2+diabetes+through+regulation+of+T-cell+function+and+an+inflammatory+cytokine+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">B cells promote inflammation in obesity and type 2 diabetes through regulation of T-cell function and an inflammatory cytokine profile.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5133-5138 (2013).</li>
<li>Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+transiently+infiltrate+intra-abdominal+fat+early+in+the+course+of+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding.</a> J Lipid Res. 49 (9), 1894-1903 (2008).</li>
<li>Han, J. M., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+obesity-associated+adipose+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in obesity-associated adipose inflammation.</a> J Immunol. 191 (2), 527-532 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deficiency+and+pharmacological+stabilization+of+mast+cells+reduce+diet-induced+obesity+and+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice.</a> Nat Med. 15 (8), 940-945 (2009).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+effector+T+cells+contribute+to+macrophage+recruitment+and+adipose+tissue+inflammation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity.</a> Nat Med. 15 (8), 914-920 (2009).</li>
<li>Koh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+forms+profound+vascular+network+through+the+dynamic+reassembly+of+blood+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Stromal vascular fraction from adipose tissue forms profound vascular network through the dynamic reassembly of blood endothelial cells.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (5), 1141-1150 (2011).</li>
<li>Peinado, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal-vascular+fraction+of+adipose+tissue+contributes+to+major+differences+between+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The stromal-vascular fraction of adipose tissue contributes to major differences between subcutaneous and visceral fat depots.</a> Proteomics. 10 (18), 3356-3366 (2010).</li>
<li>Leggate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+inflammatory+and+prominent+proteomic+changes+in+plasma+and+adipose+tissue+after+high-intensity+intermittent+training+in+overweight+and+obese+males%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Determination of inflammatory and prominent proteomic changes in plasma and adipose tissue after high-intensity intermittent training in overweight and obese males.</a> Journal of Applied Physiology. 112 (8), 1353-1360 (2012).</li>
<li>Divoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+in+human+adipose+tissue%3A+link+with+morbid+obesity%2C+inflammatory+status%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mast cells in human adipose tissue: link with morbid obesity, inflammatory status, and diabetes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 97 (9), E1677-E1685 (2012).</li>
<li>Harford, K. A., Reynolds, C. M., McGillicuddy, F. C., Roche, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fats%2C+inflammation+and+insulin+resistance%3A+insights+to+the+role+of+macrophage+and+T-cell+accumulation+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Fats, inflammation and insulin resistance: insights to the role of macrophage and T-cell accumulation in adipose tissue.</a> Proc Nutr Soc. 70 (4), 408-417 (2011).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Morris, D. L., Singer, K., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+macrophages%3A+phenotypic+plasticity+and+diversity+in+lean+and+obese+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Clin+Nutr+Metab+Care%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue macrophages: phenotypic plasticity and diversity in lean and obese states.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14 (4), 341-346 (2011).</li>
<li>Wentworth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+CD11c%2BCD206%2B+adipose+tissue+macrophages+are+associated+with+insulin+resistance+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory CD11c+CD206+ adipose tissue macrophages are associated with insulin resistance in human obesity.</a> Diabetes. 59 (7), 1648-1656 (2010).</li>
<li>Wouters, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+classical+monocytes+are+associated+with+CD11c%2B+macrophages+in+human+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Circulating classical monocytes are associated with CD11c+ macrophages in human visceral adipose tissue.</a> Sci Rep. 7, 42665(2017).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> J Immunol. 189 (2), 946-955 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+contributes+to+false-positive+intracellular+Foxp3+staining+in+macrophages%3A+a+lesson+learned+from+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence contributes to false-positive intracellular Foxp3 staining in macrophages: a lesson learned from flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 386 (1-2), 101-107 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Deze methoden wordt beschreven hoe om te isoleren van de FØROYA van BTW en zat en kwantificeren van de relatieve hoeveelheden van immune cellen binnen deze weefsels. Bovendien staat de methoden het bepalen van de expressie van merkers op specifieke celtypes.
Stroom cytometry van weefsel immune cellen is een krachtige techniek om fenotype de immunologische toestand van weefsels. De kwantificering van weefsel immune cellen hebben vele toepassingen. Zoals beschreven in de resultaten, is het mogelijk om te vergelijken van de aanwezigheid van bepaalde immuuncellen tussen groepen van patiënten (b.v.mager vs. zwaarlijvige). Daarnaast door te voeren ook stroom cytometry op bloed van de dezelfde patiënten, kunnen associaties tussen circulerende cellen en weefselcellen worden onderzocht. Met deze toepassing konden wij vaststellen dat een specifieke subset van circulerende monocyten gekoppeld van pro-inflammatoire CD11C is+ adipeus weefsel macrofagen16.
Aanpassingen van het protocol beschreven zal haar toepassingen uitbreiden naarmate talrijke beschikbare fluorescerende antilichamen stroom cytometry zeer veelzijdig maken. Met verschillende antilichamen bijna alle celtypes kunnen worden onderscheiden en de uitdrukking van veel markers kan worden gedetecteerd. Daarnaast is het mogelijk om markeringen intracellulair vlek door het permeabilizing van de celmembraan zodat de intracellulaire binding van de fluorescerende antilichamen. Deze kenmerken kunnen onderscheid van de zeer uiteenlopende macrofaag bevolking buiten de overdreven vereenvoudigde M1 en M2 macrofaag subtypen. Naast meting van oppervlakte marker expressie, kunnen eiwitten (d.w.z., cytokines) worden gekleurd intracellulair voorlichting over macrofaag functionaliteit. Daarnaast worden proliferatie markeringen zoals Ki67 gebruikt voor het kwantificeren van proliferatie tarieven. Zoals beschreven, was onderscheid tussen macrofagen en DCs gebaseerd op MFI niveaus van DC markers. Een algemene macrofaag-marker, zoals CD68 kan worden opgenomen in de macrofaag deelvenster (FACS deelvenster 1). CD68 moet echter worden gekleurd intracellulair vereisen permeabilization van de celmembraan die niet beter en zou verlenging van het protocol. Andere macrofaag markers zijn deelverzameling markeringen zoals CD163 en CD206 of CD11c, de laatste wordt geïntegreerd in het deelvenster van de macrofaag hier gepresenteerd.
In onze FACS panelen, een marker te onderscheiden van levende en dode cellen werd niet opgenomen, die zou wenselijk zijn omdat hierdoor een nauwkeuriger uitsluiting van dode cellen dan het gebruik van FSC en WS. Vaak gebruikt zijn de DNA kleuring levensvatbaarheid kleurstoffen propidium jodide (PI) of 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), evenals gratis amine reageren kleurstoffen zoals de LIVE/DEAD Fixable dode cel Stain Kit, die beschikbaar is in verschillende kleurstof kleuren. Nochtans, PI en DAPI niet worden gebruikt bij de vaststelling van de cellen. Zoals beschreven in het protocol, kan de kleuring van de levensvatbaarheid van de LIVE/DEAD Fixable Red Dead cel worden geïntegreerd in beide panelen zonder de algehele FACS gating strategie.
Bovendien, worden de gegevens uitgedrukt als een percentage van levende cellen wat betekent dat alle gegevens zijn relatief. Alleen door het invoeren van een exacte, zou bekend aantal cellen in de stroom cytometer, het mogelijk om te bepalen van het exacte aantal elk celtype. Een geschatte aantal cellen kon worden berekend na het tellen van de cellen in de Fractie SVF met behulp van een tellen kamer. Dit aantal zou moeten worden aangepast voor de hoeveelheid biopsie weefsel gebruikt om te isoleren van de FØROYA, maar dit heeft beperkingen bij het vergelijken van mager tot zwaarlijvige op. Een soortgelijke massa van zwaarlijvige AT bestaat uit minder adipocytes zoals ze zijn gevuld met lipiden en aanzienlijk hebben uitgebreid. Dit kan leiden tot een onderschatting van immuun celaantal als aantal immuuncellen per gram op of per adipocyte.
In menselijke studies, wordt opneming van patiënten meestal gedaan over een langere periode van tijd, waardoor standaardisatie van experimentele procedures van groot belang. Voor vergelijking van stroom cytometry gegevens tussen patiënten zijn er verschillende opties. Zoals beschreven in dit protocol, kunnen cellen vóór de meting waardoor analyse van verschillende monsters op dezelfde dag worden vastgesteld. Dit kan ook worden bereikt door bevriezing van de FØROYA voordat kleuring hen, waardoor de kleuring procedure gelijk is tussen alle monsters, maar de levensvatbaarheid van de cellen kan worden beïnvloed. Tot slot, ook werkzaam in deze studie, zijn fluorescerende kralen installeren compensatie niveaus en cytometer bijhouden kralen bi-wekelijkse werden gebruikt voor het standaardiseren van dagelijkse metingen van de cytometer. Deze laatste optie is het meest efficiënt wanneer het meten van monsters uit een studie die verspreid over een lange periode van tijd.
Een beperkende factor voor stroom cytometry is in het algemeen het gebruik van fluorescentie. Het aantal fluorescerende etiketten die gelijktijdig kunnen worden ontdekt is beperkt als gevolg van overlapping in emissie spectra. Echter met slimme FACS deelvenster ontwikkeling en het gebruik van verschillende antilichaam cocktails per BTW- of zat monster, kan dit probleem worden opgelost zoals beschreven in dit protocol. Een belangrijk aspect van FACS deelvenster ontwikkeling is FMO besturingselementen. Met behulp van alle antilichamen van het deelvenster met uitzondering van één, kunnen de potentiële autofluorescence niveaus worden gewaardeerd bij het vergelijken van de FMO met het volledige deelvenster. Hierdoor is nauwkeurige gating van populaties en deze procedures moeten worden uitgevoerd bij het opzetten van een nieuw FACS paneel. Bovendien kunnen nieuwe generaties van FACS apparaten detecteren maximaal 50 parameters waardoor gelijktijdige detectie van vele kenmerken per cel. Een andere kwestie met betrekking tot het aspect van de fluorescentie is de autofluorescence van cellen, met name in macrofagen. Na excitatie van de cellen met de laser FACS (voornamelijk met 488 nm golflengte excitatie), deze cellen een fluorescent signaal uitstoten (voornamelijk < 640 nm) dat kan overlapping met de spectra van de emissie van het antilichaam labels17,18. Om dit te verklaren, moeten onbevlekt cellen worden gemeten om te bepalen van de autofluorescence in elk kanaal. Met deze kennis, moeten fluorochromes worden geselecteerd die een signaalsterkte die hoger is dan het signaal van de autofluorescent worden weergegeven. Dit autofluorescent achtergrond signaal moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de gating strategie van de bevolking. Dus, door toepassing van dit protocol en de intelligente FACS deelvenster ontwerp kan in diepte fenotype macrofaag subtypen. Nieuwe verschillende AT macrofagen en hun functie kunnen worden gekarakteriseerd.

Obesitas wordt gekenmerkt met low-grade AT ontsteking1 en infiltratie van pro-inflammatoire immuuncellen in zowel viscerale en onderhuidse op (BTW, zat). Accumulatie van pro-inflammatoire immuuncellen in de BTW leidt tot insulineresistentie die een primaire risicofactor is voor het ontwikkelen van type 2 diabetes2. Immune cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem zijn te vinden in de zwaarlijvige AT, zoals macrofagen, mestcellen, neutrofielen, CD4+ en CD8+ T-cellen en B-cellen3,4,5,6 ,7. Deze immuuncellen, samen met de endotheliale cellen, stromale cellen adipocyte progenitorcellen, fibroblasten en pericytes, vormen de SVF8 en zijn de belangrijkste bron van pro-inflammatoire stoffen in de AT-9.
De inflammatoire status van AT wordt vaak onderzocht door technieken en westelijke vlek10, qPCR11, immunohistochemistry11. Echter bij het gebruik van deze technieken, de gehele AT adipocytes en SVF, wordt gebruikt. Dit maakt het moeilijk om te bepalen van het bedrag en de deelverzamelingen van immune cellen aanwezig in de AT. Immune cellen hebben verschillende cel markeringen te definiëren en te categoriseren, zoals macrofagen. Macrofagen weergeven significante heterogeniteit in zowel de functie als de cel oppervlakte marker expressie12. Daarom zijn ze vaak onderverdeeld in twee macrofaag populaties: M1 en M2. M2 macrofagen worden meestal genoemd als alternatief geactiveerde macrofagen12,13 en wonen in het AT van mager, metabolisch normale mensen14. Echter, tijdens obesitas, een fenotypische switch komt uit M2 macrofagen M1 macrofagen. Deze klassiek M1 macrofagen express CD11C12 en accumuleren rond dood adipocytes om te vormen van de kroon-achtige structuren13geactiveerd. Het is aangetoond dat CD11C+ macrofagen in de AT aantasten insuline actie en zijn geassocieerd met insulineresistentie in zwaarlijvige mensen15. Als u wilt identificeren M1 en M2 macrofagen in de AT, is immunohistochemistry een optie. Deze techniek geeft informatie over de locatie van de macrofagen in de weefsels. Echter zal het beperken van het aantal markeringen die kan worden gebruikt in een kleuring. Bovendien, het is ook moeilijk te kwantificeren. Daarom, om te onderzoeken de verschillende immuun cel subsets in de BTW- en zat deposito's, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. Deze aanpak geeft ons de mogelijkheid om meerdere markers per cel met één stroom cytometry analyse gebruiken voor het definiëren van cel subsets en tellen van het aantal elke deelverzameling aanwezig in de AT-deposito's.

<table><tbody><tr><td>Centrifuge</td><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>5660</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium (DMEM)-Ham&rsquo;s F12</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI van Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657-1g</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I van Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I uit bovien pancreas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503-100</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Merck</td><td>1.06688.0100</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;M spuit Filcons</td><td>BD Biosciences</td><td>340613</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;M filter</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Fc blok / humane IgG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14506</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Merck</td><td>1.04003.2500</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV421</td><td>Biolegend</td><td>301324</td><td></td></tr><tr><td>CD19-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>561807</td><td></td></tr><tr><td>CD66b-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>CD56-Fitc</td><td>BD Biosciences</td><td>562794</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>337218</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td></td></tr><tr><td>CD19-BV421</td><td>Biolegend</td><td>302234</td><td></td></tr><tr><td>CD3-V500</td><td>BD Biosciences</td><td>561416</td><td></td></tr><tr><td>CD56-APC</td><td>Biolegend</td><td>318310</td><td></td></tr><tr><td>CD4-PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300528</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC-H7</td><td>BD Biosciences</td><td>641400</td><td></td></tr><tr><td>CD303-PE</td><td>Biolegend</td><td>354204</td><td></td></tr><tr><td>CD141-APC</td><td>Biolegend</td><td>344106</td><td></td></tr><tr><td>FACS-Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 v-vormige plaat met 96 putjes</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>PBS PH 7.4</td><td>Gibco ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FACS buis 5 mL polystyreen buis met ronde bodem</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>IgG uit humaan serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I4506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rat Ig, &kappa;/Negatieve Controle Compensatie Deeltjes Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552844</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Muis Ig, &kappa;/Negatieve Controle Compensatie Deeltjes Set</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Red Dode Cel Kleuring Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L23102</td><td></td></tr><tr><td>IKA&nbsp;MS 3 basis shaker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z645028-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

karakterisering van immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van stroom cytometry

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltratie van immuuncellen in de subcutane en viscerale adipeus weefsel (AT) deposito's leidt tot een low-grade ontsteking bij te dragen tot de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde complicaties, zoals diabetes type 2. Kwantitatief en kwalitatief onderzoek doen naar de immuun cel subsets in mens op deposito's, hebben wij een stroom cytometry aanpak ontwikkeld. De stromale vasculaire noemer (SVF), met de immuun cellen, is geïsoleerd van subcutane en viscerale op biopsieën door collagenase spijsvertering. Adipocytes worden verwijderd na het centrifugeren. De cellen van SVF zijn gekleurd voor meerdere membraan-gebonden markeringen geselecteerd om te differentiëren tussen immuun cel subsets en geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Als gevolg van deze aanpak, pro - en anti - inflammatory macrofaag deelverzamelingen, dendritische cellen (DC's), B-cellen, CD4+ en CD8+ T-cellen en NK-cellen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. Deze methode geeft gedetailleerde informatie over immuuncellen in AT en het bedrag van elke specifieke deelverzameling. Aangezien er talrijke fluorescerende antilichamen beschikbaar, kan onze stroom cytometry aanpak worden aangepast voor het meten van verschillende andere cellulaire en intracellulaire markeringen van belang.

De SVF geïsoleerd van BTW en zat werd gemeten met behulp van stroom cytometry. Stroom cytometry metingen genereren percelen tonen verschillende cel populaties op basis van cellulaire markeringen (figuur 1A en 1B). Eerst, door het uitzetten van de voorwaartse verstrooien breedte (FSC-W) en toekomen scatter gebied (FSC-A), cel aggregaten kunnen worden geëlimineerd uit verdere analyse door de afzonderlijke cellen gating als lage FSC-W. Volgende, levende cellen zijn geselecteerd, en cellulaire puin wordt uitgesloten door de cellen van de juiste grootte en complexiteit met behulp van FSC gating-A en de zijde verstrooien gebied (WS-A), respectievelijk. Dode cellen zijn klein en dus zichtbaar als een aparte populatie met een kleine FSC-A. Volgende, immuun cellen werden geselecteerd door gebruik van de pan-leukocyte markering CD45 (paneel 1 en 2, figuur 1A). Voor het analyseren van macrofagen, andere immune cellen zoals T-cellen (CD3), B-cellen (CD19), neutrofiele granulocyten (CD66b+ CD11b+), en NK-cellen (CD56) werden uitgesloten van verdere analyse met behulp van verschillende antilichamen gericht op deze cellen, maar met dezelfde fluorescerende. Verdere onderverdeling van de resterende cellen was gebaseerd op CD11b en CD11c expressie. Dit resulteerde in de volgende populaties: CD11b+ CD11c+ macrofagen, CD11b+ CD11c- -macrofagen en CD11blaag /- CD11c+ DCs (FACS panel 1, figuur 1B). Meting van de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) toegestaan de kwantificering van de uitdrukking van CD303 (plasmacytoid DC marker) en CD141 (DC marker), op CD11b+ CD11c+ macrofagen en CD11blaag /- CD11c+ DCs. Expressie van deze beide markeerders waren hoger in CD11blaag /- CD11c+ cellen bevestigen dat CD11blaag /- CD11c+ cellen werden DCs (Figuur 1 c).
De CD45+ cellen (figuur 1A) waren verdeeld in T-cellen en B-cellen met behulp van CD3 en CD19, respectievelijk. T-cellen werden onderverdeeld in T-helper cellen (CD4+) en cytotoxische T-cellen (CD8+). Tot slot, CD3-CD19-cellen werden getekend te kwantificeren van NK-cellen met behulp van de markering CD56 (FACS panel 2, Figuur 1 d). Het aantal cellen in elke poort wordt gekwantificeerd en kan worden gebruikt voor de berekening van het percentage van deze celtype van alle levende cellen (tabel 3).
Het percentage van levende cellen kan worden berekend voor elk onderwerp, waardoor de berekening van een gemiddelde van alle onderwerpen in een groep van bijvoorbeeld mager of zwaarlijvige mannen worden getoond van de overvloed van een specifieke immuun cel, dat wil zeggen, de pro-inflammatoire CD11b+ CD11c+ macrophage in viscerale AT (Figuur 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig1.jpg"> Figuur 1. FACS gating strategie van viscerale vetweefsel. (A) FACS plot van alle evenementen (zwart) met voorwaartse scatter breedte intensiteit (FSC-W) en voorwaartse scatter gebied intensiteit (FSC-A) die een poort Schakel alleen afzonderlijke cellen (rood) gevolgd door een perceel van FACS gebaseerd op FSC-A en zijde scatter gebied intensiteit (WS-A) die bevatten een selectie van levende cellen (lichtgroen) poort. Vervolgens plot met WS-A en CD45 fluorescentie intensiteit bevat een poort selecteren alle CD45+ (immuun) cellen (blauw). (B) FACS plot van CD19, CD3, CD66b en CD56 intensiteit van de fluorescentie versus CD11b fluorescentie intensiteit, en een poort selecteren alle cellen die CD19, CD3, CD66b en CD56 negatieve zijn (bruin) voor verdere opsplitsing in populaties. Verdere onderverdeling in de volgende plot op basis van CD11b en CD11c intensiteit van de fluorescentie. Poorten worden weergegeven met CD11b+ CD11c+ macrofagen (donkergroen), CD11b+ CD11c- macrofagen (paars), en CD11blaag /- CD11c+ dendritische cellen (blauw). (C) bedrag van CD11b+, CD11c+, of CD11blaag /- CD11c+ cellen (y-as) weer te geven van hun niveaus van intensiteit van de fluorescentie (x-as) voor CD303 en CD141 en de bijbehorende kwantificering van het gemiddelde de intensiteit van de fluorescentie (MFI's). (D) FACS perceel weergeven van de eerdere CD45+ bevolking (blauw) gebaseerd op CD3 en CD19 fluorescentie intensiteit met poorten selecteren van T-cellen (magenta), B-cellen (donkergroen) en niet-autofluorescent cellen (groen) negatieve voor beide CD3 en CD19. Het volgende verhaal is gebaseerd op CD4 en CD8 fluorescentie met poorten selecteren CD4+ (lichtgroen) en CD8+ (magenta) T-cellen. Een identieke gating strategie wordt gebruikt voor onderhuidse vetweefsel. Een identieke gating strategie wordt gebruikt voor onderhuidse vetweefsel. Dit cijfer is gewijzigd van Wouters et al. 16 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57319/57319fig2.jpg"> Figuur 2. Zwaarlijvige BTW bevat meer pro-inflammatoire macrofagen. De hoeveelheid CD11b+ CD11c+ macrofagen gepresenteerd als percentage van alle levende cellen in BTW van mager en zwaarlijvige mannen. Alle gegevens zijn middelen ± SEM; n = 20 voor lean en n = 31 voor zwaarlijvige. p ≤ 0.01 vs. mager. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57319/57319fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doel</td>
			<td>Definitie doel</td>
			<td>Presenteren op</td>
			<td>Fluorescerende</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
			<td>Kloon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11B</td>
			<td>myeloïde integrine marker</td>
			<td>Granulocyten, monocyten/macrofagen, dendritische cellenlage en natural killer cellen</td>
			<td>BV421</td>
			<td>2.5 ΜL</td>
			<td>ICRF44</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeenschappelijk antigeen van de B-cel</td>
			<td>B-cel ontwikkeling van pro-B cel tot blastoid-B-cel en plasma B-cel</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeenschappelijke T cel antigeen</td>
			<td>T-lymfocyten, natuurlijke killer T cellen en thymocytes</td>
			<td>FITC</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD66B</td>
			<td>lid van het carcino-antigeen (CEA)-glycoproteïne familie graag</td>
			<td>Granulocyten</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>G10F5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>zwaar geglycosyleerde hechting eiwit</td>
			<td>Natural killer cellen en natuurlijke killer T cellen</td>
			<td>FITC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>B159</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD303</td>
			<td>type II transmembraan glycoproteïne</td>
			<td>plasmacytoid dendritische cellen</td>
			<td>PE</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>201A</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD141</td>
			<td>thrombomodulin</td>
			<td>monocyten/macrofagenlage, subpopulatie van dendritische cellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>M80</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C</td>
			<td>Typ ik transmembraan glycoproteïne; integrine-αx</td>
			<td>dendritische cellen, Granulocyten, monocyten/macrofagen, natural killer cellen, deelverzameling van B- en T-cellen</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
			<td>Bu15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeenschappelijke leukocyte antigeen</td>
			<td>alle menselijke leukocyten, met inbegrip van lymfocyten, monocyten, Granulocyten, eosinofielen en thymocytes</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS buffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Antilichaam cocktail voor FACS panel 1 te identificeren macrofaag deelverzamelingen en dendritische cellen populaties. Hoeveelheid antilichaam beschreven is voor de analyse van een monster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doel</td>
			<td>Definitie doel</td>
			<td>Presenteren op</td>
			<td>Fluorescerende</td>
			<td>Hoeveelheid</td>
			<td>Kloon</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>gemeenschappelijk antigeen van de B-cel</td>
			<td>B-cel ontwikkeling van pro-B cel tot blastoid-B-cel en plasma B-cel</td>
			<td>BV421</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HIB19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>gemeenschappelijke T cel antigeen</td>
			<td>T-lymfocyten, natuurlijke killer T cellen en thymocytes</td>
			<td>V500</td>
			<td>3 ΜL</td>
			<td>UCHT1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD56</td>
			<td>zwaar geglycosyleerde hechting eiwit</td>
			<td>Natural killer cellen en natuurlijke killer T cellen</td>
			<td>APC</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>HCD56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>IG superfamilie, typ ik transmembraan glycoproteïne</td>
			<td>T helper cel, thymocytes, monocyten/macrofagen, type II natuurlijke killer T cellen</td>
			<td>PerCP-Cy5.5</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>RPA-T4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Α-subunit van een bisulfide-verbonden bimolecular complex</td>
			<td>cytotoxische T-cellen, thymocytes, subset van natural killer cellen</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>gemeenschappelijke leukocyte antigeen</td>
			<td>alle menselijke leukocyten, met inbegrip van lymfocyten, monocyten, Granulocyten, eosinofielen en thymocytes</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>HI30</td>
		</tr>
<tr>
<td>FACS buffer</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10 µl</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. Antilichaam cocktail voor FACS deelvenster 2T - en B-cel populaties identificeren. Hoeveelheid antilichaam beschreven is voor de analyse van een monster.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Macrophage paneel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>De naam van de poort</td>
			<td># Cellen</td>
			<td>% van live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afzonderlijke cellen</td>
			<td>183054</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Live</td>
			<td>10477</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>4100</td>
			<td>39.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>dump-
</td>
			<td>771</td>
			<td>7.36</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C- CD11B+
</td>
			<td>430</td>
			<td>4.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11B+
</td>
			<td>104</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD11C+ CD11Blaag /-
</td>
			<td>15</td>
			<td>0.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>T-cel, B-cellen, NK-cel paneel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>De naam van de poort</td>
			<td>#Cells</td>
			<td>% van live</td>
		</tr>
<tr>
<td>Afzonderlijke cellen</td>
			<td>34616</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Live</td>
			<td>3728</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45+
</td>
			<td>1589</td>
			<td>42.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>NK-cellen</td>
			<td>29</td>
			<td>0.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3+
</td>
			<td>953</td>
			<td>25.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4+
</td>
			<td>601</td>
			<td>16.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8+
</td>
			<td>328</td>
			<td>8.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19+
</td>
			<td>20</td>
			<td>0.54</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Immuun cel overvloed van verschillende celtypes in BTW. Aantal cellen in elke poort en het percentage van de verschillende soorten cellen op basis van het totale bedrag van levende cellen.

Dit artikel beschrijft een methode voor het analyseren van immuun celinhoud van adipeus weefsel door isolatie van immuuncellen uit vetweefsel en latere analyse met behulp van stroom cytometry.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Het algemene doel van deze procedure is om flowcytometrie te gebruiken om de stromale vasculaire fractie van menselijk vetweefsel te isoleren voor fenotypering van de verschillende immuuncellpopulaties die in het vetweefsel worden aangetroffen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in metabole onderzoek, zoals welke immuuncellen zich ophopen in het vetweefsel van obese personen en in welke mate. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de gelijktijdige meting van meerdere markers op immuuncellen en de identificatie en kwantificering van deze immuuncellen in vetweefsel mogelijk maakt.Hoewel deze techniek cruciale inzichten kan bieden in ontsteking van vetweefsel, kan deze ook worden toegepast op andere organen en weefsels. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze techniek vooral worstelen met contaminatie van stromale vasculaire cellen en verlies van cellen tijdens de kleuringsprocedure. Twee van mijn promovendi, Suzan Wetzels en Mitchell Bijnen, zullen het protocol uitvoeren.Begin met het gebruik van een scalpel om één gram vetweefselbiopsie in stukjes van ongeveer twee millimeter in het vierkant te snijden. Breng de stukjes over in een centrifugeerbuis van 50 milliliter en voeg 10 milliliter collagenase-oplossing toe aan de monsters. Incubeer de weefselfragmenten gedurende 60 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius bij 60 cycli per minuut.Volg dit door filtratie door een 200 micrometer zeef in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Spoel de filter af met zeven milliliter PBS voor centrifugatie. Gebruik vervolgens een pipet om het supernatant te verwijderen zonder de hele pipettip in de oplossing te onderdompelen.De pellet moet duidelijk zichtbaar zijn en verwijder bijna al het supernatant om contaminatie van de stromale vasculaire fractie met vetcellen te voorkomen. We suspenderen de pellet van stromale vasculaire cellen met vijf milliliter vers PBS en filteren de stromale vasculaire fractie door een 70 micrometer zeef in een nieuwe buis. Na centrifugatie suspenderen we de gewassen pellet van de stromale vasculaire fractie in drie milliliter erytrocytlysebuffer gedurende vijf minuten op ijs.Stop vervolgens de lyse met zeven milliliter PBS en pellet de cellen door centrifugatie. Om de stromale vasculaire fractie te kleuren voor flowcytometrische analyse, suspendeer de pellet in 90 microliters van vier graden Celsius fluorescentie geactiveerde celsortering, of FACS-buffer, en blokkeer de niet-specifieke kleuring met tien microliters humane IgG. Verdeel de celsuspensie tussen twee putjes van een 96-wels v-vormige bodemplaat en plaats de cellen gedurende 15 minuten op ijs.Aan het einde van de incubatie, was elk monster met 100 microliters FACS-buffer, draai de plaat met een vloeiende beweging ondersteboven zonder te tikken om de supernatanten aan het einde van de centrifugatie weg te gooien. Zorg ervoor dat u de pellet duidelijk aan de onderkant van de plaat kunt zien voordat u deze ondersteboven draait om verlies van uw cellen tijdens de procedure te voorkomen. Suspendeer de eerste pellet in 29,5 microliters antilichaamcocktail voor het eerste FACS-paneel en de tweede pellet in 23 microliters antilichaamcocktail voor het tweede FACS-paneel.Na 30 minuten op ijs in het donker, was de cellen met 150 microliters FACS-buffer per putje en fixeer de celpellets in 150 microliters van een oplossing van een procent formaldehyde. Breng de celsuspensies van elk putje over in de corresponderende FACS-buis en plaats de monsters op ijs. Laad voor hun analyse een ongekleurde, negatieve controle op de flowcytometer om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters in te stellen.Pas vervolgens de spanningen van de flowcytometer aan volgens de instructies van de fabrikant totdat alle populaties van belang zichtbaar zijn in de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsgrafieken, en een onderscheid kan worden gemaakt tussen het puin en de levende cellen. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, vortex de eerste experimentele steekproef bij 800 tpm om de cellen grondig te resuspenderen en laad de steekproef op de cytometer. Lees een minimum van 50.000 gebeurtenissen in de live gate, vortex vervolgens en laad de tweede steekproef voor analyse zoals zojuist is gedemonstreerd.Om analyse van de macrofaagpopulaties in vetweefsel mogelijk te maken in dit representatieve experiment, werden andere immuuncellen, zoals T-cellen, B-cellen, neutrofielen en natuurlijke killercellen uitgesloten om de aanwezigheid van CD11b+CD11c+macrofagen, CD11B+CD11C-macrofagen en CD11Blow-CD11C+dendritische cellen te onthullen. Kwantificering van de belangrijkste fluorescentie-intensiteit van deze cellen onthulde de expressie van plasmacytoïde dendritische cel- en generieke dendritische celmarkers op de CD11B+CD11C+en CD11Blow-CD11C+cellen, met een hogere expressie van beide markers waargenomen op de CD11Blow-CD11C+cellen, wat bevestigt dat de CD11Blow-CD11C+cellen in feite dendritische cellen waren. Gating van de CD45-positieve cellen onthulde CD19-positieve B- en CD3-positieve T-celpopulaties, waarvan de laatste verder kon worden onderverdeeld in CD3+CD4+T-helper- en CD3+CD8+cytotoxische T-celsubsets, en CD3-CD56+natuurlijke killercellen.Het percentage van levensvatbare immuuncellen werd vervolgens berekend voor elke proefpersoon, wat een significante toename aantoonde in het percentage pro-inflammatoire CD11B+CD11C+macrofagen in het viscerale vetweefsel van obese volwassen mannelijke proefpersonen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek binnen vier uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de buffers en celfracties op ijs te houden en tijdens het labelen van de cellen met antilichamen is het erg belangrijk om ze in het donker te houden.Na de ontwikkeling ervan, stelde deze techniek onderzoekers op het gebied van metabool onderzoek in staat om de immuuncelveranderingen in het vetweefsel van mensen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u immuuncellen uit vetweefsel kunt

characterization-immune-cells-human-adipose-tissue-using-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Een eenvoudige en betrouwbare dieet-geïnduceerde knaagdier model voor niet-alcoholische Steatohepatitis (NASH) wordt beschreven, bereikt door niet-SPF huisvesting van de dieren en het beheer van een specifieke high-fat dieet. Wij beschrijven de identificatie van de lever-en vetweefsel immuun cel subsets aan recapituleren menselijke immunologische omstandigheden door bloot muizen aan milieu-kiemen.

Een geavanceerd muizen model voor niet-alcoholische Steatohepatitis in samenwerking met type 2 diabetes

Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.

Menselijke vetweefsel micro-fragmentatie voor Celfenotyping en Secretome karakterisatie

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun karakterisering door middel van flowcytometrie kan aanzienlijk bijdragen aan het begrijpen van het patroon van immuunrespons tegen implantaten. Dit artikel beschrijft een nauwkeurige methode voor de isolatie van cellen uit ontlede implantaten en hun kleuring voor flowcytometrische analyse.

Flowcytometrie met hoge dimensionaliteit voor analyse van de immuunfunctie van ontlede implantaatweefsels

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren, kweken en fenotyperen van microvasculaire endotheelcellen uit menselijk onderhuids vetweefsel (hSATMVEC's). Daarnaast beschrijven we een experimenteel model van hSATMVEC-adipocyte overspraak.

Bestudering van overspraak van vet-endotheelcellen en adipocyten in menselijk onderhuids vetweefsel

Leer een stroomcytometrieprotocol voor het isoleren en karakteriseren van immuuncellen uit menselijk vetweefsel. Deze methode maakt kwantitatieve en kwalitatieve analyse van immuuncelpopulaties mogelijk voor metabool onderzoek naar obesitas.

Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Meer video's verkennen