Karakterisering van Immune cellen in menselijke adipeus weefsel met behulp van Stroom Cytometry

Het algemene doel van deze procedure is om flowcytometrie te gebruiken om de stromale vasculaire fractie van menselijk vetweefsel te isoleren voor fenotypering van de verschillende immuuncellpopulaties die in het vetweefsel worden aangetroffen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in metabole onderzoek, zoals welke immuuncellen zich ophopen in het vetweefsel van obese personen en in welke mate. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de gelijktijdige meting van meerdere markers op immuuncellen en de identificatie en kwantificering van deze immuuncellen in vetweefsel mogelijk maakt.

Hoewel deze techniek cruciale inzichten kan bieden in ontsteking van vetweefsel, kan deze ook worden toegepast op andere organen en weefsels. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze techniek vooral worstelen met contaminatie van stromale vasculaire cellen en verlies van cellen tijdens de kleuringsprocedure. Twee van mijn promovendi, Suzan Wetzels en Mitchell Bijnen, zullen het protocol uitvoeren.

Begin met het gebruik van een scalpel om één gram vetweefselbiopsie in stukjes van ongeveer twee millimeter in het vierkant te snijden. Breng de stukjes over in een centrifugeerbuis van 50 milliliter en voeg 10 milliliter collagenase-oplossing toe aan de monsters. Incubeer de weefselfragmenten gedurende 60 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius bij 60 cycli per minuut.

Volg dit door filtratie door een 200 micrometer zeef in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Spoel de filter af met zeven milliliter PBS voor centrifugatie. Gebruik vervolgens een pipet om het supernatant te verwijderen zonder de hele pipettip in de oplossing te onderdompelen.

De pellet moet duidelijk zichtbaar zijn en verwijder bijna al het supernatant om contaminatie van de stromale vasculaire fractie met vetcellen te voorkomen. We suspenderen de pellet van stromale vasculaire cellen met vijf milliliter vers PBS en filteren de stromale vasculaire fractie door een 70 micrometer zeef in een nieuwe buis. Na centrifugatie suspenderen we de gewassen pellet van de stromale vasculaire fractie in drie milliliter erytrocytlysebuffer gedurende vijf minuten op ijs.

Stop vervolgens de lyse met zeven milliliter PBS en pellet de cellen door centrifugatie. Om de stromale vasculaire fractie te kleuren voor flowcytometrische analyse, suspendeer de pellet in 90 microliters van vier graden Celsius fluorescentie geactiveerde celsortering, of FACS-buffer, en blokkeer de niet-specifieke kleuring met tien microliters humane IgG. Verdeel de celsuspensie tussen twee putjes van een 96-wels v-vormige bodemplaat en plaats de cellen gedurende 15 minuten op ijs.

Aan het einde van de incubatie, was elk monster met 100 microliters FACS-buffer, draai de plaat met een vloeiende beweging ondersteboven zonder te tikken om de supernatanten aan het einde van de centrifugatie weg te gooien. Zorg ervoor dat u de pellet duidelijk aan de onderkant van de plaat kunt zien voordat u deze ondersteboven draait om verlies van uw cellen tijdens de procedure te voorkomen. Suspendeer de eerste pellet in 29,5 microliters antilichaamcocktail voor het eerste FACS-paneel en de tweede pellet in 23 microliters antilichaamcocktail voor het tweede FACS-paneel.

Na 30 minuten op ijs in het donker, was de cellen met 150 microliters FACS-buffer per putje en fixeer de celpellets in 150 microliters van een oplossing van een procent formaldehyde. Breng de celsuspensies van elk putje over in de corresponderende FACS-buis en plaats de monsters op ijs. Laad voor hun analyse een ongekleurde, negatieve controle op de flowcytometer om de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsparameters in te stellen.

Pas vervolgens de spanningen van de flowcytometer aan volgens de instructies van de fabrikant totdat alle populaties van belang zichtbaar zijn in de voorwaartse en zijwaartse verstrooiingsgrafieken, en een onderscheid kan worden gemaakt tussen het puin en de levende cellen. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, vortex de eerste experimentele steekproef bij 800 tpm om de cellen grondig te resuspenderen en laad de steekproef op de cytometer. Lees een minimum van 50.000 gebeurtenissen in de live gate, vortex vervolgens en laad de tweede steekproef voor analyse zoals zojuist is gedemonstreerd.

Om analyse van de macrofaagpopulaties in vetweefsel mogelijk te maken in dit representatieve experiment, werden andere immuuncellen, zoals T-cellen, B-cellen, neutrofielen en natuurlijke killercellen uitgesloten om de aanwezigheid van CD11b+CD11c+macrofagen, CD11B+CD11C-macrofagen en CD11Blow-CD11C+dendritische cellen te onthullen. Kwantificering van de belangrijkste fluorescentie-intensiteit van deze cellen onthulde de expressie van plasmacytoïde dendritische cel- en generieke dendritische celmarkers op de CD11B+CD11C+en CD11Blow-CD11C+cellen, met een hogere expressie van beide markers waargenomen op de CD11Blow-CD11C+cellen, wat bevestigt dat de CD11Blow-CD11C+cellen in feite dendritische cellen waren. Gating van de CD45-positieve cellen onthulde CD19-positieve B- en CD3-positieve T-celpopulaties, waarvan de laatste verder kon worden onderverdeeld in CD3+CD4+T-helper- en CD3+CD8+cytotoxische T-celsubsets, en CD3-CD56+natuurlijke killercellen.

Het percentage van levensvatbare immuuncellen werd vervolgens berekend voor elke proefpersoon, wat een significante toename aantoonde in het percentage pro-inflammatoire CD11B+CD11C+macrofagen in het viscerale vetweefsel van obese volwassen mannelijke proefpersonen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek binnen vier uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de buffers en celfracties op ijs te houden en tijdens het labelen van de cellen met antilichamen is het erg belangrijk om ze in het donker te houden.

Na de ontwikkeling ervan, stelde deze techniek onderzoekers op het gebied van metabool onderzoek in staat om de immuuncelveranderingen in het vetweefsel van mensen te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u immuuncellen uit vetweefsel kunt