Name: Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Leer een protocol voor het isoleren van muizen alvleesklier isletcellen om xenobiotica te screenen op ROS-inductie. Deze methode identificeert potentiële diabetogene chemicaliën die de alvleesklierfunctie beïnvloeden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het proefproject van CREH center gesponsord door NIEHS en door nationale Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende agentschappen. Het protocol wordt gedemonstreerd werd uitgevoerd onder leiding en goedkeuring van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Texas A & M Instituut voor Genomic geneeskunde.
1. oplossing voorbereiding
<ol><li>Verdun 10 x Henks evenwichtige zout oplossing 1 x met dubbel gedestilleerd H2O en bewaren bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereid de isolatie-oplossing door het toevoegen van HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) en glucose (5 mM). Breng de pH op 7.4 en houd op ijs.</li>
	<li>Bereid de oplossing collagenase van collagenase Type 4. Opmerking: In het bijzonder bevat collagenase Type 4 160 U per mg droog gewicht. 1 g collagenase Type 4 wordt in 5 mL dubbel gedestilleerd H2O met een concentratie van 200 mg/mL verdund. 2 mL van de verdunde Collagenase aan 30 mL ijs koude isolatie-oplossing is toegevoegd, en 6 mL collagenase oplossing wordt overgedragen aan een tube van 50 mL voor elke muis.</li>
	<li>Bereid de oplossing van wassen door toevoeging van 1 mM CaCl2 aan de isolatie-oplossing.</li>
	<li>Bereid de oplossing van de zuivering met koude polysucrose/natrium diatrizoate oplossing (1.1119 g/mL, 5 mL).</li>
	<li>500 mL islet kweekmedium voorbereiden door toevoeging van L-glutamine (20 mM), penicilline (100 U/mL), streptomycine (100 µg/mL) en foetale runderserum (FBS) (10%) tot RPMI medium.</li>
	<li>De DCFH-DA-stockoplossing voorbereiden door de ontbinding van het poeder in gedistilleerd water van 200 µM en winkel bij-20 ° C. Opmerking: De ROS kleurstofoplossing wordt vers gemaakt door verdunning van de stockoplossing van het DCFH-DA aan de uiteindelijke concentratie van 5 µM in RPMI. Dit reagens moet worden beschermd tegen licht.</li>
</ol>2. chirurgische voorbereiding
<ol><li>Intraperitoneally injecteren (I.P.) een muis met avertin (2.5% avertin, 0.4 mL/20 g). Nadat de muis is volledig verdoofd en niet langer reageert op achterste voet snuifjes, euthanaseren van de muis en verplaats naar de biologische kap.</li>
	<li>Plaats de euthanized muis met de abdominale zijde naar boven en spray de huid met 70% ethanol voor sterilisatie.</li>
	<li>Open de buikholte met een 1 cm U-incisie op de bovenbuik en intrekken van de huid in de rostraal richting over de borst te bloot van de buikholte.</li>
</ol>3. de alvleesklier perfusie en verwijdering
<ol><li>Zoals geïllustreerd in Figuur 1, vinden de locatie van de Papil. Gebruik een paar gebogen pincet naar de twaalfvingerige darm klem dicht bij de positie van de sfincter van Oddi. Gebruik een ander paar van gebogen verlostang om de klem van de wand van de twaalfvingerige darm om te blokkeren van het traject van de gal in de twaalfvingerige darm. Opmerking: De ampul is niet geplaatst in deze stap. Deze stap is bedoeld om te blokkeren van het traject van de gal in de twaalfvingerige darm.</li>
	<li>Verplaats de muis met het proximale hoofd en de voeten distale met betrekking tot de onderzoeker.</li>
	<li>Vind de Galgang en 3 mL collagenase oplossing langzaam te injecteren met een 30 G naald en 5 mL spuit. Zorg ervoor dat de Galgang en de alvleesklier worden opgeblazen na de injectie.</li>
	<li>Verwijder de opgezwollen alvleesklier met behulp van de gebogen pincet en fijne schaar te scheiden van de dalende dikke darm, darmen, maag en milt. De alvleesklier plaats in een 50 mL-buis met 3 mL collagenase oplossing en bewaar deze op ijs.</li>
</ol>4. de alvleesklier, spijsvertering
<ol><li>Elke 50 mL-buis in een waterbad 37 ° C te plaatsen. Incubeer gedurende 15-20 min (tijd varieert met de stam en leeftijd van de muizen).</li>
	<li>Het trillen van de buis met behulp van een vortex.</li>
	<li>Groep 4-5 verteerd alvleesklier in een grote steriele wastafel zeef en een bolletje gebruik te maken van de alvleesklier grondig uit elkaar vallen. Gebruik een 23 G naald en 10 mL spuit met wassen oplossing om krachtig Pipetteer de verteerd cellen vandoor naar de zeef. Verzamel de wash-oplossing in een 50 mL-buis.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 97 x g bij 4 ° C voor 1 min en decanteren van de bovendrijvende substantie.</li>
	<li>Voeg 25 mL wassen oplossing buizen en resuspendeer de weefsel door zachte vortexing. Spin down de weefsels bij 97 x g bij 4 ° C voor 1 min en decanteren van de bovendrijvende substantie. Herhaal dit voor 3 keer. Wees voorzichtig niet te verjagen de Ingehuld weefsel.</li>
</ol>5. reiniging van eilandjes
<ol><li>Voeg 10 mL van de reiniging oplossing aan de pellet van gewassen en voorzichtig resuspendeer de inhoud.</li>
	<li>Zachtjes overlay 5 mL van de oplossing van de isolatie op de reiniging oplossing. Wees voorzichtig met het houden van een scherpe vloeibare interface tussen de twee oplossingen.</li>
	<li>Centrifugeer de buis op 560 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten met langzame acceleratie en geen rem. Plaats de pipet in de interface en het verzamelen van de eilandjes laag in nieuwe 50 mL buizen.</li>
	<li>Wassen de eilandjes zoals beschreven in stap 3.5.</li>
</ol>6. plating en behandelingvan eilandjecellen
<ol><li>Resuspendeer de eilandjes in 10 mL eilandjes cultuur oplossing voorzichtig meng goed en plaats 100 µL per putje met een meerkanaalspipet aan een 96-wells-plaat. Ongeveer 5 eilandjes per 96 goed plaatsen.</li>
	<li>Plaats de plaat in de weefselkweek incubator voor 12u.</li>
	<li>Centrifugeer (112 x g) de 96-wells-plaat en verwijder het kweekmedium.</li>
	<li>Verdun de milieu chemische stoffen in het kweekmedium eilandjes. Voeg 100 µL van elk van de chemische verdunningsmiddelen in aparte putjes van de plaat. Resuspendeer de eilandjes in elk putje en incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C (de concentratie varieert voor de verschillende milieu chemische stoffen).</li>
</ol>7. ROS kleuring en meting
<ol><li>Na behandeling van de eilandjes, wassen met 1 x PBS (200 µL voor elke 96-Wells). Opmerking: De concentratie van de chemicaliën is als volgt: AFB1: 3 µM, Atrazine: 100 µM, BaP: 10 µM, BPA: 100 µM, β-oestrogeen, PCB126: 10 µM, nonylfenol en BPA: 100 µM.</li>
	<li>N-Acetyl-cysteïne (NAC) als een antioxidant gebruiken om quench ROS. Voeg van 5 mM van NAC aan de ROS-geïnduceerde chemische verdunningsmiddelen en incubeer gedurende 12 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>De 96-wells-plaat bij 112 x g centrifugeren en met 5 µM oplossing van fluorescente sonde (H2-DCFH-DA opgelost in RPMI media) incuberen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.</li>
	<li>Wassen van het behandelde eilandjecellen 3 keer met PBS en meten van de fluorescentie met een microplate-lezer op 488 nm. Opmerking: De accumulatie van DCF in cellen kan worden gemeten door een toename in de fluorescentie bij 530 nm wanneer het monster is enthousiast op 488 nm.</li>
	<li>De glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS) assay9 uitvoeren op ROS-inducerende xenobioticum eilandjes en onbehandelde eilandjes om te meten de xenobiotische effecten op de fysiologische functie van de alvleesklier eilandjes behandeld.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Vergaren van bewijs suggereert dat de blootstelling aan chemicaliën milieu speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van T2DM. Xenobiotica-geïnduceerde ROS is erkend als een potentiële etiologische factor die bijdraagt tot de ontwikkeling van T2DM. Mensen worden blootgesteld aan een breed scala van xenobiotische chemische stoffen en er is een grote behoefte aan nieuwe onderzoekstechnieken effectief de alvleesklier toxische stoffen te identificeren en te onderzoeken van het mechanisme van toxiciteit die specifiek zijn...

Stijgingen in de prevalentie van T2DM zijn een wereldwijde gezondheidscrisis geworden in de afgelopen jaren, die een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid1. Vele factoren hebben gevonden causaal verband met de ontwikkeling van T2DM, waaronder, terugkerende bevindingen suggereren dat een gemeenschappelijk convergerende punt voor deze factoren is de inductie van oxidatieve stress die tot de generatie van buitensporige ROS2 leidt , 3.
Een breed spectrum van milieu chemische stoffen zoals PCB's, dioxinen en BaP is gebleken voor het opwekken van oxidatieve stress, die kan de functie van de alvleesklier β-cellen aantasten en leiden tot insulineresistentie en T2DM4. Hoewel het fysiologische niveau van ROS een belangrijke rol in de cellulaire functies speelt, blootstelling aan ROS die hoger is dan de capaciteit van de antioxidant-systeem resulteert in de schade aan de cellen/weefsels en leidt tot ziekten5. Cellen van de alvleesklier β express een laag niveau van anti-oxidant enzym en zijn dus een gevoelige doelgroep voor de oxidatieve stress-gemedieerde schade6,7. Chronische blootstelling aan hoge niveaus van ROS is aangetoond dat het stress-geïnduceerde alvleesklier cel dysfunctie5 veroorzaken evenals insulineresistentie in de lever en het vetweefsel8.
Het algemene doel van dit project is het ontwikkelen van een cel-gebaseerde bepaling aan scherm chemicaliën voor hun potentieel van de diabetogenic op basis van hun inductie van ROS in cellen van de alvleesklier. De alvleesklier mist metabole ontgifting en is een gevoelige doelwit voor xenobioticum veroorzaakte schade6,7. Dus, door het direct meten van de ROS gegenereerd in de cellen in de alvleesklier, deze bepaling dient een directe benadering van de chemische stof veroorzaakte schade in de alvleesklier. Ontwikkeling van deze methode, wij geïsoleerd muis alvleesklier eilandjes, gekweekt van de geïsoleerde islet onder cel cultuur voorwaarde met chemicaliën en de chemische-geïnduceerde ROS generatie als de uitlezing gebruikt. Deze procedure is eenvoudig en effectief in het identificeren van ROS-inducerende chemicaliën in het geïsoleerde rotseilandje; het kan verder worden ontwikkeld voor onderzoek van de mechanismen van toxiciteit die specifiek voor de alvleesklier in vitro zijn.

<table><tbody><tr><td>10&times;Hank&rsquo;s balanced salt solution&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>polysucrose/sodium diatrizoate solution&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2&rsquo;,7&rsquo;-dichlorofluorescein (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence microplate reader&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA Kit</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>voor 96-well plate centrifuge</td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>voor fluorescentiemeting</td></tr></tbody></table>

een lymfkliertest alvleesklier islet cel-gebaseerde screening voor diabetogenic milieu chemische stoffen

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Blootstelling aan bepaalde ecologische stoffen in mens en dier heeft gevonden om cellulaire schade van de alvleesklier β-cellen die tot de ontwikkeling van type 2 diabetes mellitus (T2DM leiden zal). Hoewel de mechanismen voor de chemische-geïnduceerde β celbeschadiging waren onduidelijk en waarschijnlijk te complex, is een terugkerende bevinding dat deze chemische stoffen veroorzaken oxidatieve stress die leidt tot de generatie van buitensporige reactieve zuurstof soorten (ROS), die het veroorzaken van schade aan de β-cel. Voor de identificatie van potentiële diabetogenic milieu chemicaliën zijn we geïsoleerd alvleesklier eilandjecellen van C57BL/6 muizen en gekweekte eilandjecellen in 96-Wells cel cultuur platen; vervolgens de eilandjecellen waren gedoseerd met chemicaliën en de ROS-generatie werd ontdekt door 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescente kleurstof. Met behulp van deze methode, wij gevonden dat Bisfenol A (BPA), Benzo [a] pyreen (BaP) en polychloorbifenylen (PCB's), kunnen induceren hoge niveaus van ROS, suggereren dat ze mogelijk schade in eilandjecellen veroorzaken. Deze methode moet zinvol zijn voor het screenen van diabetogenic xenobiotica. De gekweekte eilandjecellen kunnen daarnaast ook worden aangepast voor in vitro analyse van chemische-geïnduceerde toxiciteit in cellen van de alvleesklier.

Een opname van het gezonde geïsoleerd eiland is afgebeeld in Figuur 2, waarin eilandjes een ronde of ovale vorm met relatief uniforme grootte hebben (hoewel uniformiteit van de grootte van stam tot stam variëren kan). Wij onderzocht vervolgens de alvleesklier islet functies in een in vitro assay door isoleren het rotseilandje en stimuleren de secretie van insuline in de eilandjes van de cultuur. Figuur 3 toont onze typis...

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de alvleesklier eilandjecellen muis voor het screenen van de ROS inducties door de xenobiotica teneinde de potentiële diabetogenic xenobiotische chemische stoffen.

Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Alvleeskliercellen zijn een gevoelig doelwit voor ROS-geïnduceerde schade, wat geassocieerd is met de ontwikkeling van type-2 diabetes. Een op alvleeskliercellen gebaseerde test helpt bij het identificeren van ROS-inducerende chemicaliën. Het grote voordeel van deze techniek is het gebruik van geïsoleerde alvleesklier-eilandjescellen voor een eenvoudige en effectieve identificatie van de ROS-inducerende chemicaliën die diabetogeen potentieel kunnen hebben.Deze methode kan ook worden gebruikt voor een in vitro-analyse van de effecten van chemicaliën op een fysiologische functie van de alvleesklier, zoals glucose-geïnduceerde insulinesecretie. Gebruik een paar gebogen pincetten om het duodenum dicht bij de positie van de sphincter van Oddi vast te klemmen. Met een ander paar gebogen pincetten, klemt u de duodenumwand om de galweg te blokkeren.Zoek de galwegen en injecteer met een naald van 30 gauge en een spuit van vijf milliliter langzaam drie milliliter collagenase-oplossing. Draai vervolgens de muis om met de kop proximaal en de voeten distaal. Zorg ervoor dat de galwegen en de alvleesklier geïnfiltreerd zijn na de injectie.Gebruik de gebogen pincetten en fijne schaar om het opgeblazen pancreas te verwijderen om het te scheiden van de dikke darm, darmen, maag en milt. Plaats vervolgens het orgaan in een buis van 50 milliliter met drie milliliter collagenase-oplossing en houd het op ijs. Plaats elke buis van 50 milliliter in een waterbad van 37 graden Celsius en incubeer ze gedurende 15 tot 20 minuten.Vortex de buizen, verzamel vervolgens vier tot vijf gedigesteerde organen in een grote steriele spoelbak en gebruik een schep om het pancreas grondig te breken. Gebruik een naald van 23 gauge en een spuit van tien milliliter met wasoplossing om de gedigesteerde cellen krachtig van het scherm te pipetten. Verzamel vervolgens de wasoplossing in een buis van 50 milliliter.Centrifugeer de buizen bij 97g en vier graden Celsius gedurende één minuut en decanteer het supernatant. Voeg 25 milliliter wasoplossing toe aan de buizen en resuspendeer het weefsel door voorzichtig te vortexen. Draai vervolgens het weefsel omlaag en decanteer het supernatant.Herhaal het wassen drie keer, zorg ervoor dat het gepelleteerd weefsel niet loskomt. Om de eilandjes te zuiveren, voegt u tien milliliter zuiveringsoplossing toe aan het gewassen weefselpellet en resuspendeer de inhoud voorzichtig. Breng voorzichtig vijf milliliter isolatieoplossing aan op de zuiveringsoplossing.Zorg ervoor dat er een scherp vloeistofvlak tussen de twee oplossingen wordt gehandhaafd. Centrifugeer de buis bij 560g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten, met langzame acceleratie en geen rem. Breng vervolgens de pipet in het vlak in en verzamel de eilandjeslaag.Breng de oplossing over in nieuwe buizen van 50 milliliter voordat u het eilandje wast zoals zojuist is aangetoond. Na het verwijderen van de laatste was, voegt u tien milliliter eilandjecultuuroplossing toe en mengt u voorzichtig en grondig om de eilandjes te resuspenderen. Gebruik vervolgens een multikanaals pipet om 100 microliter per putje over te brengen naar de putjes van een 96-putjesplaat.Incubeer de plaat gedurende 12 uur in een weefselkweekincubator. Centrifugeer vervolgens de plaat bij 112g en verwijder het kweekmedium. Verdun de omgevingschemicaliën in eilandjecultuurmedium.Voeg 100 microliter van elk van de chemische verdunningen toe aan afzonderlijke putjes van de plaat. Resuspendeer de eilandjes in elke put en incubeer de plaat gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Na chemische behandeling van de eilandjes, gebruik 1x PBS om de monsters te wassen.Voeg vervolgens vijf millimolair N-acetylcysteïne of NAC toe aan de putjes als antioxidant om ROS te dempen en incubeer de platen gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius. Centrifugeer de 96-putjesplaat bij 112g, voeg vervolgens een vijf micromolaire oplossing van fluorescerende sonde toe en incubeer de plaat gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik PBS om de behandelde eilandjescellen drie keer te wassen en gebruik een microplaatreader bij 480 nanometer om de fluorescentie te meten.Ten slotte voert u de glucose-geïnduceerde insulinesecretie, of GSIS-test, uit op de ROS-inducerende xenobioticum-behandelde en onbehandelde eilandjes, om de xenobiotische effecten op de fysiologische functie van de pancreaseilandjes te meten. Hier zijn gezonde pancreaseilandjes weergegeven, geïsoleerd uit C57 Black/6 muizen, die rond of ovaal van vorm zijn en relatief uniform van grootte. In deze GSIS-test, met gebruik van geïsoleerde eilandjes gestimuleerd met glucose om insuline af te scheiden, werd een dosisafhankelijk effect waargenomen.Toen geïsoleerde eilandjes werden behandeld met de hier genoemde xenobiotica, veroorzaakten verschillende chemicaliën, waaronder Atrazine, BaP, BPA en PCB, een significante inductie van reactieve zuurstofsoorten. De toevoeging van NAC kon echter de productie van ROS door de chemische behandelingen onderdrukken. Bovendien vertoonden pancreaseilandjes die vooraf werden behandeld met PCB126 en BPA een significante afname van insulinesecretie in vergelijking met de controlegroep, wat de belangrijke rol van ROS bij het veroorzaken van schade aan de fysiologische functie van pancreatische bètacellen bevestigt, wat leidt tot T2DM.Eenmaal beheerst, kan de isolatie van de pancreaseilandjes in twee uur worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om gradiëntcentrifugering te gebruiken om de eilandjes te zuiveren van de andere pancreasdeeltjes. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals glucose-geïnduceerde insulinesecretie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de effecten van de chemicaliën op de fysiologische functies van de pancreaseilandjes.Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek het onderzoekers op het gebied van toxicologie mogelijk gemaakt om het diabetogeen potentieel van omgevingschemicaliën in geïsoleerde muis-pancreas-eilandjescellen te onderzoeken. Na

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

In vitro testen van kolonies op zelfvernieuwing en differentiatie van progenitorcellen geïsoleerd uit volwassen muizen pancreas gedetecteerd worden gepland. In deze testen pancreatische voorlopercellen leiden tot cel kolonies in 3-dimensionale ruimte-methylcellulose bevattende halfvaste medium. Protocollen voor het manipuleren van enkelvoudige cellen en karakterisering van individuele kolonies worden beschreven.

In Vitro Kolonie assays voor het karakteriseren van Tri-potente Progenitor Cellen Geïsoleerd van de volwassen muizen alvleesklier

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.

Eencellige Transcriptomic Analyses van muis alvleesklier endocriene cellen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Leer een protocol voor het isoleren van muizen alvleesklier isletcellen om xenobiotica te screenen op ROS-inductie. Deze methode identificeert potentiële diabetogene chemicaliën die de alvleesklierfunctie beïnvloeden.

Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen

Meer video's verkennen