Name: Dual effecten van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg Adipocytes differentiatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Leer een cocultuursysteem voor het bestuderen van interacties tussen melanoomcellen en beenmergvetcellen. Deze methode onthult dubbele effecten op adipocytendifferentiatie en biedt inzicht in mechanismen van botmetastase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dov Zipori (het Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israël) vriendelijk voor het verstrekken van ons de lymfkliertest beenmerg stromale cel 14F1.1 lijn. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Chinese National Natural Science Foundation (Nos. 81771729) en het Yongchuan ziekenhuis van Chongqing medische universiteit (Nos. YJQN201330; YJZQN201527).

Opmerking: Alle cellen die worden gebruikt in dit protocol moeten worden gekweekt voor minstens drie generaties na het ontdooien van bevroren voorraad cellen.
1. de oogst van melanoom cel-afgeleide factoren
<ol><li>
Voorbereidingen
	<ol>
<li>B16F10 cellen en een muis melanoom cellijn verkrijgen. Opmerking: Voor dit protocol, een muis melanoom cellijn werd verkregen van de Bank van de cel van de stam van de Chinese Academie van Wetenschappen.</li>
		<li>Maak een volledige medium voor de cultuur van de cel B16F10 (100 mL). Gebruik de Dulbecco bewerkt Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 50 U/mL penicilline, en 50 µg/mL streptomycine.</li>
		<li>Maak een serumvrij medium voor de honger van de B16F10 cellen (50 mL). Gebruik DMEM medium zonder FBS, 50 U/mL penicilline, en 50 µg/mL streptomycine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiden van melanoom-geconditioneerd medium (CM)
	<ol>
<li>Zaad 2.0 x 105 B16F10 cellen in een 100 mm schotel met 10 mL 10% FBS DMEM. Vervolgens Incubeer de cellen in een incubator van de 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 gedurende 24 uur.</li>
		<li>Wanneer de cellen ongeveer 80% van de samenvloeiing bereikt, verwijderen van het kweekmedium, de cellen tweemaal met 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (1 x, pH 7.4) wassen en vervangen het medium met een 10 mL serumvrij medium voor de honger.</li>
		<li>De cellen terugkomen in de incubator voor 18 – 24 h.</li>
		<li>Na de honger, de geconditioneerde medium (CM) met een precisiepipet verzamelen en overbrengen naar een centrifugebuis verse 50 mL. Opmerking: Het geconditioneerde medium is het supernatant van de celculturen B16F10. Zorg ervoor dat de B16F10 cellen zijn in goede conditie voor het verzamelen van de CM.</li>
		<li>Centrifugeer het CM voor 5 min op 1000 x g bij 4 ° C.</li>
		<li>Pipetteer het supernatant en overbrengen naar een nieuwe steriele buis of fles. Opmerking: Vermijd pipetteren uit de pellet aan de onderkant van de buis.</li>
		<li>Als u wilt verwijderen van het puin van de cel, de CM te filteren door het passeren van een spuit-verbonden 0,45 µm filter op de top van een steriele fles of buis. Opmerking: 0,22 µm filters zijn optimaal voor het filteren van de CM.</li>
		<li>De gefilterde supernatant bij-20 ° C bewaren tot gebruik. Opmerking: Het is het beste om niet op te slaan het supernatant bij-20 ° C voor meer dan één maand. U kunt ook slaan de CM-80 ° c voor meer langere tijd voor de differentiatie van adipocyte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de inductie van beenmerg Adipocytes door melanoom cel-afgeleide factoren
<ol><li>
Voorbereidingen
	<ol>
<li>Breng 100 mL adipogenic inductie middellange28. Gebruik een volledige DMEM aangevuld met 5 µg/mL 1 µM dexamethason, insuline en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine. Het opslaan van twee weken bij 4 ° C.</li>
		<li>100 mL adipogenic onderhoud voedingsbodem voor te bereiden. Gebruik van een complete DMEM of vermengd met 50% melanoom CM aangevuld met 5 µg/mL van insuline.</li>
		<li>Het maken van een stamoplossing olie Red O. Los op 30 mg olie Red O poeder in 10 mL isopropanol (≥ 99,5%) en meng ze goed door vortex. Opmerking: Het tot opslaan 1 jaar bij 4 ° C.</li>
		<li>Een werkoplossing olie Red O maken Verdun de olie Red O stockoplossing (uit stap 2.1.3) met gedeïoniseerd water in een verhouding van 3:2 in de zuurkast. Laat het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur inwerken en filtreer het door een 0,22 µm filter vóór gebruik. Opmerking: Gebruik uitsluitend de verse werkoplossing binnen 2 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocyte differentiatie
	<ol>
<li>Cultuur een stromale cel lijn 14F1.1 van muis beenmerg29 in een schotel van 60 mm met een compleet DMEM op 80% confluentie in een incubator 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. Opmerking: U kunt ook vervangen door 14F1.1 primaire mesenchymale beenmerg-afgeleide cellen30.</li>
		<li>Trypsinize van de cellen met 1,5 mL van een 0,25% trypsine-oplossing in een incubator voor 1-2 min.</li>
		<li>Voeg 5 mL van 10% FBS medium aan de cellen en tellen de cel nummers met een glas hemocytometer; Pas vervolgens de celdichtheid tot ongeveer 1 – 2 x 105/mL.</li>
		<li>Beënt, 5 x 10-4 van 14F1.1 cellen per putje in een 24-well plaat met 0,5 mL van adipogenic inductie medium. Na twee dagen incubatie bereiken de cellen ongeveer 90% van de samenvloeiing. Opmerking: Deze stap is zeer kritisch. Beenmerg stromale cellen kunnen niet worden aangezet te adipocytes zonder een adipogenic inductie medium.</li>
		<li>Verwijder het medium van de inductie en wassen de cellen tweemaal met 1 mL PBS telkens.</li>
		<li>1 mL van adipogenic onderhoud medium verandert en blijven aan de cultuur van de cellen tot rijping van de adipocyte. Opmerking: Onder een Microscoop, adipocytes lijken op kleine of grote zeepbellen en zijn zeer eenvoudig te herkennen. Meestal zijn volwassen adipocytes op de 6th of 8th dag aanwezig.</li>
		<li>De volwassen adipocytes met olie Red O vlek of verzamelen van de adipocytes voor de analyse van een kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipocyte kleuring
	<ol>
<li>Wash de gedifferentieerde 14F1.1 cellen 2 x met PBS en corrigeren in 3,7% formaldehyde gedurende 1 uur.</li>
		<li>Spoel de cellen in 60% isopropanol en laten drogen.</li>
		<li>Toevoegen van 0,2 mL van de werkoplossing olie Red O de putjes en na het bebroeden bij kamertemperatuur voor 0,5 tot 2 h.</li>
		<li>Wassen van de cellen met water te verwijderen van de niet-afhankelijke kleurstoffen.</li>
		<li>Foto van de geverfde adipocytes onder een lichte Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coculture van het beenmerg Adipocytes met melanoom cellen
<ol><li>
Voorbereidingen
	<ol>
<li>Volwassen bot beenmerg adipocytes bereiden: induceren van de 14F1.1 cellen in volwassen BM adipocytes in 24-Wells-platen met het medium van de inductie adipogenic voor 2 dagen en dan voor een extra 6-8 dagen in het adipogenic onderhoud medium handhaven.</li>
		<li>Voorbereiden van de B16F10 cellen: cultuur van de B16F10 cellen in 60 mm gerechten met 5 mL van DMEM medium.</li>
		<li>Bevochtig het membraan invoegen (bv transwell): 150 µL van FBS-vrije DMEM medium toevoegen aan de 0.4 µm poriegrootte membraan inserts en dompel ze op de putten van 24-Wells-platen gevuld met 500 µL van FBS-vrije DMEM medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coculture instelling
	<ol>
<li>Pipetteer langzaam uit het medium voor elke toevoeging. Opmerking: Niet vernietigen het membraan bij het verwijderen van het medium.</li>
		<li>Zaad de B16F10 cellen (0/103/105/106) in de porie 0.4 µm wordt ingevoegd vanaf stap 3.2.1.</li>
		<li>Het adipogenic onderhoud medium in de putten wordt vervangen door de adipocytes van de volwassen beenmerg uit stap 3.1.1. met 600 µL van volledige DMEM medium.</li>
		<li>Overdracht van de inserts gevuld met de cellen van de B16F10 (uit stap 3.2.2) op de putjes met de adipocytes van de volwassen beenmerg (uit stap 3.2.3) voor de coculture-experimenten.</li>
		<li>Incubeer de cocultures bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 2 dagen.</li>
		<li>Na 48u van incubatie, verwijder de inserts voor de coculture en daarna wassen de adipocytes 2 x met 500 µL van 1 x PBS. Opmerking: Optioneel, verzamelen de B16F10 cellen in de inzetstukken voor analyse, indien nodig.</li>
		<li>De adipocytes met de werkoplossing olie Red O vlek of verzamelen van de adipocytes voor qPCR analyse. Opmerking: Zie de kleuring procedure in stap 2.3.</li>
		<li>Foto van de geverfde adipocytes onder een lichte Microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. qPCR analyse van de Adipocyte-specifieke Gene Signature
<ol><li>Voeg 0,5 mL van kant-en-klare RNA isolatie reagens per putje in een 24-well plaat in welke volwassen adipocyte is klaar om op te sporen.</li>
	<li>Volg een standaardprotocol voor de extractie van RNA en de cDNA synthese31.</li>
	<li>Gebruik de primer voor 18S en GAPDH als de controle, en CEBPα/β, PPARγ, FABP4, leptine, Pref-1 of adiponectin voor de adipocyte-specifieke gen handtekening (tabel 1).</li>
	<li>De volgende reactie uitgevoerd in een thermische cycler: 95 ° C gedurende 20 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 1 s, en 60 ° C gedurende 20 s.</li>
	<li>Gebruik de 2-ΔΔCt methode voor het berekenen van dat de vouw verandert32.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenic+niches+for+melanoma+cell+colonization+and+growth+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipogenic niches for melanoma cell colonization and growth in bone marrow.</a> Laboratory Investigation. 97 (6), 737-745 (2017).</li>
<li>Trotter, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-Lineage+Cells+Support+Growth+and+Dissemination+of+Multiple+Myeloma+in+Bone%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-Lineage Cells Support Growth and Dissemination of Multiple Myeloma in Bone.</a> The American Journal of Pathology. 186 (11), 3054-3063 (2016).</li>
<li>Morris, E. V., Edwards, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bone+marrow+adipocytes+in+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of bone marrow adipocytes in bone metastasis.</a> Journal of Bone Oncology. 5 (3), 121-123 (2016).</li>
<li>Diedrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+the+Warburg+phenotype+in+metastatic+prostate+tumors+via+HIF-1alpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote the Warburg phenotype in metastatic prostate tumors via HIF-1alpha activation.</a> Oncotarget. 7 (40), 64854-64877 (2016).</li>
<li>Chkourko Gusky, H., Diedrich, J., MacDougald, O. A., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+and+bone+marrow%3A+how+adipocyte-rich+organs+create+tumour+microenvironments+conducive+for+metastatic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Omentum and bone marrow: how adipocyte-rich organs create tumour microenvironments conducive for metastatic progression.</a> Obesity Reviews. 17 (11), 1015-1029 (2016).</li>
<li>Chen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+increases+melanoma+cell+growth+in+the+bone+marrow+by+inducing+osteopontin+and+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High fat diet increases melanoma cell growth in the bone marrow by inducing osteopontin and interleukin 6.</a> Oncotarget. 7 (18), 26653-26669 (2016).</li>
<li>Balaban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+lipolysis+links+obesity+to+breast+cancer+growth%3A+adipocyte-derived+fatty+acids+drive+breast+cancer+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte lipolysis links obesity to breast cancer growth: adipocyte-derived fatty acids drive breast cancer cell proliferation and migration.</a> Cancer & Metabolism. 5, 1(2017).</li>
<li>Huang, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+malignant+growth+of+breast+tumours+with+monocarboxylate+transporter+2+expression+via+beta-hydroxybutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote malignant growth of breast tumours with monocarboxylate transporter 2 expression via beta-hydroxybutyrate.</a> Nature Communications. 8, 14706(2017).</li>
<li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+adipocytes+stimulate+breast+cancer+invasion+through+metabolic+remodeling+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells.</a> JCI Insight. 2 (4), 87489(2017).</li>
<li>Wang, C., Gao, C., Meng, K., Qiao, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipocytes+stimulate+invasion+of+breast+cancer+MCF-7+cells+by+secreting+IGFBP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human adipocytes stimulate invasion of breast cancer MCF-7 cells by secreting IGFBP-2.</a> PLoS One. 10 (3), 0119348(2015).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Herroon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+adipocytes+promote+tumor+growth+in+bone+via+FABP4-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Bone marrow adipocytes promote tumor growth in bone via FABP4-dependent mechanisms.</a> Oncotarget. 4 (11), 2108-2123 (2013).</li>
<li>Tabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow+Adipocytes+Facilitate+Fatty+Acid+Oxidation+Activating+AMPK+and+a+Transcriptional+Network+Supporting+Survival+of+Acute+Monocytic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow Adipocytes Facilitate Fatty Acid Oxidation Activating AMPK and a Transcriptional Network Supporting Survival of Acute Monocytic Leukemia Cells.</a> Cancer Research. 77 (6), 1453-1464 (2017).</li>
<li>Wen, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+activate+mitochondrial+fatty+acid+oxidation+and+autophagy+to+promote+tumor+growth+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adipocytes activate mitochondrial fatty acid oxidation and autophagy to promote tumor growth in colon cancer.</a> Cell Death & Differentiation. 8 (2), 2593(2017).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocytes+in+bone+marrow+protect+myeloma+cells+against+chemotherapy+through+autophagy+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mature adipocytes in bone marrow protect myeloma cells against chemotherapy through autophagy activation.</a> Oncotarget. 6 (33), 34329-34341 (2015).</li>
<li>Ye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+Stem+Cells+Evade+Chemotherapy+by+Metabolic+Adaptation+to+an+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Leukemic Stem Cells Evade Chemotherapy by Metabolic Adaptation to an Adipose Tissue Niche.</a> Cell Stem Cell. 19 (1), 23-37 (2016).</li>
<li>Templeton, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cell+Colonization+of+the+Human+Bone+Marrow+Adipose+Tissue+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cell Colonization of the Human Bone Marrow Adipose Tissue Niche.</a> Neoplasia. 17 (12), 849-861 (2015).</li>
<li>Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+engineering+in+three-dimensional+levitation+tissue+culture+system+based+on+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (5), 336-344 (2013).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+3D+Culture+System+to+Differentiate+Visceral+Adipocytes+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using a 3D Culture System to Differentiate Visceral Adipocytes In Vitro.</a> Endocrinology. 156 (12), 4761-4768 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>Herroon, M. K., Diedrich, J. D., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+3D-Culture+Approaches+to+Study+Interactions+of+Bone+Marrow+Adipocytes+with+Metastatic+Prostate+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">New 3D-Culture Approaches to Study Interactions of Bone Marrow Adipocytes with Metastatic Prostate Cancer Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 84(2016).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Laboratory Investigation. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer.</a> Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+perturbation+in+vitro--a+growing+case+for+three-dimensional+%283D%29+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Dirat, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+exhibit+an+activated+phenotype+and+contribute+to+breast+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion.</a> Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Zipori, D., Toledo, J., von der Mark, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+among+stromal+cell+lines+from+mouse+bone+marrow+disclosed+in+their+extracellular+matrix+composition+and+interactions+with+normal+and+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity among stromal cell lines from mouse bone marrow disclosed in their extracellular matrix composition and interactions with normal and leukemic cells.</a> Blood. 66 (2), 447-455 (1985).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Culture%2C+and+Differentiation+of+Bone+Marrow+Stromal+Cells+and+Osteoclast+Progenitors+from+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Quantification+of+Plasma+MicroRNA+Levels+in+Cynomolgus+Monkeys%2C+Using+Quantitative+Real-time+Reverse+Transcription+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56850(2018).</li>
<li>Bozec, A., Hannemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Regulation+of+Adipocyte+Numbers+in+Adult+Organisms+Through+Differentiation+and+Apoptosis+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e53822(2016).</li>
<li>Shafat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemic+blasts+program+bone+marrow+adipocytes+to+generate+a+protumoral+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment.</a> Blood. 129 (10), 1320-1332 (2017).</li>
<li>Gazi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+lipid+translocation+between+adipocytes+and+prostate+cancer+cells+with+imaging+FTIR+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of lipid translocation between adipocytes and prostate cancer cells with imaging FTIR microspectroscopy.</a> The Journal of Lipid Research. 48 (8), 1846-1856 (2007).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+omega-6+PUFA+arachidonic+acid+and+bone+marrow+adipocytes+on+metastatic+spread+from+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of omega-6 PUFA arachidonic acid and bone marrow adipocytes on metastatic spread from prostate cancer.</a> British Journal of Cancer. 102 (2), 403-413 (2010).</li>
<li>Hardaway, A. L., Herroon, M. K., Rajagurubandara, E., Podgorski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+adipocyte-derived+CXCL1+and+CXCL2+contribute+to+osteolysis+in+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 32 (4), 353-368 (2015).</li>
<li>Aebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+metastasis+in+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal metastasis in the elderly.</a> European Spine Journal. 12, Suppl 2 202-213 (2003).</li>
<li>Wagner, M., Bjerkvig, R., Wiig, H., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+adipocyte+specification+and+necrosis+augment+tumor-associated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Loss of adipocyte specification and necrosis augment tumor-associated inflammation.</a> Adipocyte. 2 (3), 176-183 (2013).</li>
<li>Bochet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes+promotes+breast+tumor+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes promotes breast tumor radioresistance.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 411 (1), 102-106 (2011).</li>
<li>Hirano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+adipogenesis+induction+by+conditioned+media+obtained+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhancement of adipogenesis induction by conditioned media obtained from cancer cells.</a> Cancer Letters. 268 (2), 286-294 (2008).</li>
<li>Gordeev, A. A., Chetverina, H. V., Chetverin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+arrangement+of+eukaryotic+cells+in+merged+hydrogels+combines+the+advantages+of+3-D+and+2-D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Planar arrangement of eukaryotic cells in merged hydrogels combines the advantages of 3-D and 2-D cultures.</a> Biotechniques. 52 (5), 325-331 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

Cocultures met inzetstukken hebben wijd gebruikt om te studeren van cel naar cel interacties. Het 2D coculture-systeem is een effectieve manier om te observeren hoe de twee delen Overspraak in vitro, waaraan we hier twee verschillende kanker cel-gedreven effecten op het beenmerg adipocytes toonden. Veel laboratoria hebben gebruikt deze methode om te onderzoeken de Overspraak tussen adipocytes en kanker cellen6,12,27<sup...

Botmetastasen zijn wijdverspreid onder Geavanceerde kankerpatiënten, maar een curatieve behandeling is nog steeds niet beschikbaar. Verder gespecialiseerd in energie op te slaan als vet, kan adipocytes ondersteunen tumorgroei en uitzaaiing in het beenmerg en andere organen1,2,3,4,5,6 Bovendien spelen adipocytes een essentiële rol bij het reguleren van kanker cel biologie7,8,9,10 en metabolisme4,11,12 ,13,14,15,16, zo goed als in bot metastase1,4,12. In de niche van het beenmerg, adipocytes kan ook invloed hebben op de biologische werking van kanker cellen,4,,6,17. Het samenspel tussen het beenmerg adipocytes en kankercellen met osteotropism is belangrijk voor een goed begrip van bot metastase. Echter, er is weinig bekend.
Op basis van de huidige studies, worden verschillende methoden toegepast op adipocytes, met inbegrip van twee - of drie - dimensional (2/3D) en ex vivo culturen17,18,19,20,21. Herroon et al. ontworpen onlangs, een nieuwe aanpak van het 3D-cultuur te bestuderen van interacties van beenmerg adipocytes met kanker cellen22. Hoewel de 3D coculture is optimaal voor het nabootsen van fysiologische interacties tussen adipocytes en kanker cellen in vivo, het lijdt aan slechte reproduceerbaarheid22,23. In vergelijking met een 2D coculture-systeem kunnen een 3D coculture-systeem verschillende cellulaire fenotypen, zoals cel morfologie21,22,24,25,26. Bovendien, de ex vivo cultuur van geïsoleerde spongieuze weefsel fragmenten kan leiden tot een robuuste uitvloeisel van adipocytes van gekweekte beenmerg cellen17.
In tegenstelling tot deze eerdere modellen blijft de 2D cell cultuur model echter een klassieke, betrouwbare en gemakkelijke techniek voor snel scannen van kandidaat-moleculen en de fenotypes veranderd in adipocytes of kanker in vitro1cellen, 4,6,12,15,27. Om beter te begrijpen de Overspraak tussen beenmerg adipocytes en melanoom cellen, bieden wij een gedetailleerd protocol voor een 2D coculture-systeem van het beenmerg adipocytes met melanoom cellen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000&ndash; 044</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methyl-xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red o</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>Transwell insert</td><td>Millipore</td><td>MCHT24H48</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Bio-Rad</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Culture incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL falcon</td><td>Corning</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L pipet tips</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP620</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL pipet tips</td><td>BeyoGold</td><td>FTIP628</td><td></td></tr></tbody></table>

dual effecten van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg adipocytes differentiatie

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

De Overspraak beenmerg adipocytes à tumorcellen kan spelen een cruciale rol in het proces van bot metastase. Een verscheidenheid van methoden zijn beschikbaar voor de studie van de significante Overspraak; een twee-dimensionale transwell systeem voor coculture blijft echter een klassiek, betrouwbaar, en gemakkelijke manier voor deze studie overspraak. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarin de coculture van het beenmerg adipocytes en melanoom cellen. Echter zou zulk een coculture systeem niet alleen bijdragen tot de studie van cel signaal transductions van kankercellen geïnduceerd door het beenmerg adipocytes, maar ook naar de toekomst mechanistische studie van bot metastase, die nieuwe therapeutische streefcijfers voor bot kan onthullen metastase.

In het beenmerg, adipocytes kunnen worden weergegeven in de tumor communicatie1,13,33,34,35 in een vroeg stadium voor de ondersteuning van de tumor progressie door oplosbare factoren of het activeren van osteoclastogenesis6,12,36, met ...

Hier presenteren we een betrouwbare en eenvoudige tweedimensionale (2D) coculture-systeem voor de studie van de interactie tussen tumorcellen en beenmerg adipocytes, die een dubbele effect van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg-adipocytes onthult differentiatie en vormt ook een klassieke methode voor de mechanistische studie van bot metastase.

Dual effecten van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg Adipocytes differentiatie

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het onderzoeksgebied van botmetastasen, zoals welke veranderingen worden geïnduceerd in de groei van beenmergadipocyten en hun ontwikkeling in een kankermicro-omgeving. De grote voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig uit te voeren is en dat de kandidaatmoleculen snel verkregen kunnen worden. Deze methode kan inzicht bieden in de interactie tussen beenmergadipocyten en de melanoomcellen.Het kan ook worden toegepast op andere celtypen, zoals osteoblasten. Begin met het zaaien van twee keer 10 tot de vijfde B16F10 melanoomcellen in een 100-millimeter schaal met 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS, voor een 24-uurs incubatie bij 37 graden Celsius en 5%CO2. De volgende dag, was de ongeveer 80%confluente celcultuur twee keer met vijf milliliter PBS per wasbeurt en laat de cellen 18 tot 24 uur verhongeren met 10 milliliter serumvrij cultuurmedium in de celcultuurincubator.De volgende dag, gebruik een pipet om de geconditioneerde supernatant over te brengen naar een 50-milliliter conische buis voor centrifugatie en laad het medium in een spuit die is uitgerust met een 0,45 micron-poreuze filter. Filter v

dual-effects-melanoma-cell-derived-factors-on-bone-marrow-adipocytes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the differentiation of bone marrow stromal cells (BMSCs) into adipocytes. In the two-step process, in the presence of specific growth factors and hormones, undifferentiated BMSCs first differentiate into preadipocytes. The second step involving treatment with glucose and insulin leads to the formation of mature adipocytes with multiple lipid droplets.

In Vitro Mouse Bone Marrow Stromal Cell Differentiation into Adipocytes

Vetweefsel (AT) kan de homeostase van het hele lichaam beïnvloeden, daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen van adipocytendifferentiatie en -functie van belang. We bieden een protocol voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in deze processen door adipocytenhomeostase, differentiatie en blootstelling aan hypoxie te analyseren als een model voor geïnduceerde adipocytenapoptose.

Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis

Bij meercellige organismen veroorzaken uitgescheiden oplosbare factoren reacties van verschillende celtypen als gevolg van paracriene signalering. Co-cultuursystemen bieden een eenvoudige manier om de veranderingen aan te brengen die worden veroorzaakt door uitgescheiden oplosbare factoren in de afwezigheid van cel-celcontact.

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

Traditionele methoden voor de beoordeling van de differentiatie van de adipogenic zijn goedkoop en makkelijk te gebruiken, maar zijn niet specifiek voor wijzigingen in genexpressie. Hebben we een test om te kwantificeren mesenchymale celdifferentiatie in volwassen adipocytes met behulp van een specifieke marker van afkomst. Deze bepaling heeft diverse toepassingen in basisonderzoek en klinische geneeskunde.

Visualisatie en kwantificering van mesenchymale cel Adipogenic differentiatie mogelijkheden met een Lineage specifieke Marker

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC's te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Dit artikel beschrijft een protocol voor de voortplanting van cerebrale spinale wervelvocht-circulerende tumorcellen (CSF-CTC's) verzameld van patiënten met melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte (M-LMD) om preklinische modellen te ontwikkelen om M-LMD te bestuderen.

Ex Vivo Kweek van circulerende tumorcellen in het cerebrale ruggenmergvocht van melanoompatiënten om melanoom-geassocieerde leptomeningeale ziekte te bestuderen

Leer een cocultuursysteem voor het bestuderen van interacties tussen melanoomcellen en beenmergvetcellen. Deze methode onthult dubbele effecten op adipocytendifferentiatie en biedt inzicht in mechanismen van botmetastase.

Dual effecten van melanoom cel-afgeleide factoren op het beenmerg Adipocytes differentiatie

Meer video's verkennen