Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren
April 25th, 2018
Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om een transgene zebravislijn te creëren die het mogelijk maakt om cellulaire elektrische veranderingen te observeren tijdens embryogenese, larvale beweging en tumorgenese. Deze methode zou kunnen helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsbiologie, fysiologie en kankercelbiologie, zoals wat zijn de fundamentele rollen van cellulaire elektrische signalering tijdens embryogenese en in tumorcellen? Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om cellulaire elektrische signalering in vivo en in real time te volgen.
Na het prepareren van Tol2 transposase mRNA en injectieoplossing volgens het tekstprotocol, stel 's middags voorafgaand aan de injectie vier tot zes kweektanks in met minimaal twee mannetjes en twee vrouwtjes. Om de hoeveelheid visresten te verminderen en om een kweekreactie te induceren, vermijd het voeren van de vissen in de middag. De volgende ochtend haalt u de bereide injectieoplossing uit de vriezer van min 80 graden Celsius en plaatst deze op ijs.
Trek de verdelers in de viskweektanks en laat de vissen paren. Over het algemeen leggen vissen eieren binnen 20 tot 30 minuten. Terwijl u wacht, trekt u met behulp van een micropipettrekker met de volgende parameters naalden uit capillairglas.
Gebruik een laboratoriumdoekje om het uiteinde van de naald te breken en een afgeschuinde rand te maken. Een kleinere diameter is te verkiezen om de embryomortaliteit te verminderen. Zodra de vissen eieren hebben gelegd, verzamel ze in een petrischaal met een diameter van 10 centimeter.
Onmiddellijk onder de dissectiemicroscoop verwijdert u alle abnormale embryo's en visresten. Pipetteer vervolgens de bevruchte embryo's in een voorbereide 3% agarose injectievorm. Verwijder overtollig water om de embryo's op hun plaats te houden.
Zodra alle rijen gevuld zijn met levensvatbare embryo's, rangschik ze zodat de enkele cellen allemaal horizontaal onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de naald staan. Dit zal de injectie later veel gemakkelijker maken. Draag vervolgens handschoenen en gebruik een 20 microliter laadpipettip om vijf microliter van de bereide construct uit de buis op ijs te verwijderen.
Breng de pipettip voorzichtig in het achterste uiteinde van de gebroken capillaire buis tot waar deze begint te taps te lopen om het reagens zo dicht mogelijk bij de punt te krijgen en spuit het in de capillair. Als er nog luchtbellen zijn, schud de naald en zorg ervoor dat u de punt niet breekt. Steek de naald recht in de micro-injectienaaldenhouder en draai voorzichtig vast tot de naald op zijn plaats blijft.
Stel vervolgens de hoek in op ongeveer 45 graden. Zodra de naald is voorbereid en bevestigd, zet u de microscoop en gasdruktank aan. Pas het injectievolume aan door ongeveer 0,5 PSI voor het vasthouden en 30 PSI voor het uitwerpen te gebruiken.
Controleer of de oplossing uit de naald spuit wanneer u op het pedaal drukt. Pas het volume en de stroom van de oplossing aan met behulp van een trapmicrometer met een druppel mineraalolie tot ongeveer 10 micrometer in diameter. Zorg ervoor dat de tegendruk een kleine hoeveelheid oplossing laat druppelen uit de naald.
Als er niet genoeg tegendruk is, zal capillaire werking ervoor zorgen dat er vloeistof in de naald komt en het mRNA vernietigt. Zodra de naald is gekalibreerd, steekt u de naald in de enkele cel van de bevruchte embryo's door de rand van de gelnotch te gebruiken om een ondersteuning te bieden die het embryo op zijn plaats houdt en de naald toelaat om druk uit te oefenen zonder het embryo te verplaatsen. Zodra de punt van de naald in de enkele cel is, drukt u op het pedaal om de gewenste hoeveelheid oplossing vrij te geven.
Het is belangrijk om de oplossing in de cel te injecteren, niet in de dooier, om transgene zebravissen te genereren. Herhaal dit proces voor alle embryo's. Wanneer u klaar bent, gebruikt u een wegwerp 3,4 milliliter transferpipet en vissysteem water om de geïnjecteerde embryo's over te brengen in een gelabelde schaal door ze uit de agarose notch te spoelen.
Bewaar de embryo's in een 28,5 graden Celsius incubator om ze te laten ontwikkelen. Controleer gedurende de dag om dode visembryo's te verwijderen en vervang het water door 0,1% methyleenblauw in viswater. Ongeveer zes tot acht uur na de injectie, gebruik 10 geïnjecteerde visembryo's en de hotshot-methode om genomisch DNA te bereiden.
De volgende ochtend gebruikt u een dissectiemicroscoop met een fluorescentielichtbron om de embryo's te sorteren die GFP in de niet-dooierweefsels laten zien. Deze embryo's zouden het geïnjecteerde construct moeten bevatten. Voer een Tol2 excisie-assay uit om de transposon-activiteit te controleren zoals eerder beschreven.
Als er excisieplasma kan worden gedetecteerd, bewaar dan de geïnjecteerde visembryo's en kweek ze. Anders herhaalt u het Tol2 mRNA-synthese- en micro-injectieproces totdat u positieve resultaten bereikt van de Tol2 excisie-assay. Om zebravisembryo's te beeldvormen, kruist u meerdere F2 generatie stichtingsvissen met wilde type vissen in individuele paren.
Verzamel visembryo's in verschillende gewenste ontwikkelingsstadia volgens de zebravis-stadiumsgids. Voor de vroege stadium visembryo's in vissysteemwater, gebruikt u onder een dissectiescoop een tang om voorzichtig de chorionen te pellen en te verwijderen. Gebruik een wegwerptransferpipet om een paar embryo's over te brengen naar een holle glazen glijbaan met 3% methylcellulose.
Vervolgens, met behulp van een naald onder een dissectiescoop, pas de embryo's aan naar de gewenste posities om de cellulaire GFP-activiteit te bekijken. Voor embryo's in het stadium van minder dan 12 somieten, gebruikt u een epifluorescentie compound microscoop met een compatibele camera en software voor beeldvorming. Voor embryo's na het stadium van 12 somieten, gebruikt u een fluorescentie dissectiemicroscoop.
Om tumorcelspanning af te beelden, identificeert u eerst vissen met maligne perifere zenuwschedetumoren of MPNST. Plaats de vis
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert de creatie van een transgene zebravislijn die is ontworpen om cellulaire elektrische veranderingen tijdens embryonale ontwikkeling, larvale beweging en tumorvorming in vivo te visualiseren. Deze innovatieve aanpak maakt real-time tracking van cellulaire elektrische signalering mogelijk en biedt inzichten in ontwikkelingsbiologie en kankeronderzoek.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Fysiologie
- Kankercelbiologie
Achtergrond
- Begrip van cellulaire elektrische signalering is cruciaal voor ontwikkelingsprocessen.
- Cellulaire elektrische veranderingen spelen een belangrijke rol in tumorgenese.
- Het volgen van deze veranderingen in vivo kan onze kennis van biologische mechanismen verbeteren.
- Transgene modellen zoals zebravissen zijn waardevol voor live-beeldvormingsstudies.
Doel van studie
- Creëer een zebravislijn om cellulaire elektrische veranderingen te observeren.
- Onderzoek de rollen van elektrische signalering tijdens embryogenese.
- Onderzoek elektrische signalering in tumorcellen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van Tol2 transposase mRNA en injectieoplossing.
- Installatie van kweektanks met mannelijke en vrouwelijke zebravissen.
- Induceren van kweekreactie door het beheersen van voedingsschema's.
- Injectie van de bereide oplossing in zebravisembryo's.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van een transgene zebravislijn.
- Real-time visualisatie van cellulaire elektrische veranderingen bereikt.
- Inzichten in de dynamiek van embryonale ontwikkeling en tumorvorming.
- Mogelijke toepassingen in het bestuderen van ontwikkelings- en kankerbiologie.
Conclusies
- Het transgene zebravismodel is effectief voor het observeren van elektrische signalering.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor onderzoek in de ontwikkelingsbiologie.
- Verdere studies zouden de rol van elektrische signalering in gezondheid en ziekte kunnen verduidelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Real-time visualization of cellular electrical activity in vivo enables mechanistic de-risking and target validation in developmental and cancer biology. The transgenic zebrafish model expressing a genetically encoded voltage indicator provides a scalable platform for interrogating bioelectric signaling during embryogenesis and tumorigenesis. This capability supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points for biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of endogenous electrical signaling in live vertebrate systems.
- Supports functional validation of ion channel and membrane potential targets in development and disease.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking electrical activity to phenotypic outcomes.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of bioelectric pathways.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo system for quantitative imaging of voltage changes.
- Enables reproducible measurement of membrane potential dynamics across developmental stages and tumor contexts.
- Supports assay standardization for downstream compound evaluation targeting bioelectric mechanisms.
- Allows for scalable imaging workflows using standard epifluorescent microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying tumor cell polarization and developmental patterning.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation of bioelectric targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo functional readouts.
- Supports identification of translational biomarkers linked to electrical signaling states.
Pipeline & Workflow Integration
This transgenic zebrafish voltage reporter system integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional target validation in a live vertebrate model.
- Discovery Biology: Supports in vivo hypothesis testing of electrical signaling roles in development and tumorigenesis.
- Screening: Provides quantitative, reproducible voltage imaging for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers real-time, quantitative readouts of membrane potential changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant models and potential biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for diverse bioelectric research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo voltage imaging and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early functional readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of bioelectric targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish genetics, microinjection, and fluorescence imaging.
- Needs access to epifluorescent or compound microscopes and imaging software.
- Demands cross-team standardization of injection and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of transgenesis and reporter expression.
- Practical limitations include embryo stage specificity and technical proficiency in microinjection.
