Name: Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryos en tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer hoe je cellulaire elektrische veranderingen visualiseert in zebravis embryo's en tumoren met behulp van een transgenen lijn. Deze methode maakt real-time in vivo beeldvorming van bio-elektrische signalering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoekswerk gemeld in deze publicatie werd gesteund door de National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder de Award nummer R35GM124913, Purdue University PI4D incentive programma en PVM interne concurrerende Basisonderzoek fondsen programma. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de financiering agenten. Wij danken Koichi Kawakami voor de Tol2 constructie, Michael Lin voor constructie voor de ASAP1 en Leonard Zon voor de ubi -promotor bouwen via Addgene.

De zebravis zijn gehuisvest in een AAALAC-goedgekeurd dier faciliteit, en alle experimenten werden uitgevoerd volgens de protocollen die zijn goedgekeurd door de Purdue Animal Care en gebruik Comité (PACUC).
1. Tol2 Transposon plasmide Construct voorbereiding
Opmerking: Tol2, een transposon die werd ontdekt in medaka, vis is wijd gebruikt in de zebravis onderzoek Gemeenschap8,9. Het is met succes aangenomen om de site-specifieke recombinatie gebaseerde klonen gatewaysysteem en bekend als de Tol2 kit10. De Tol2 kit voorziet in een handige methode voor het maken van aangepaste expressie constructies, terwijl het ook het verhogen van de efficiëntie van Transgenese. Dus was het geen gemakkelijke beslissing om te profiteren van dit systeem, en maak een alomtegenwoordige ASAP1 expressie zebrafish regel met behulp van een gevalideerde ubiquitin promotor te rijden ASAP111.
<ol><li>Creëren van een constructie midden vermelding ASAP1: pDONR221-ASAP1<ol>
<li>Verwerven genetisch gecodeerde voltage sensor ASAP1 constructie voor de pcDNA3.1/Puro-CAG-ASAP1 (plasmide #52519), van Addgene. Om te vullen de ASAP1 codering regio, ingesteld een PCR met behulp van de aangepaste inleidingen (attB1-ASAP1F en attB2-ASAP1R) geflankeerd door attB sequenties aan het einde 5' van de inleidingen (Figuur 1). Phusion DNA-polymerase werd gekozen voor zijn hoge efficiëntie en PCR voorwaarden werden geoptimaliseerd op basis van de eerder gepubliceerde protocol12.</li>
		<li>De 50 µL PCR producten in een 1% TAE gel met behulp van een regelmatige precisiepipet met 200 µL tips laden en uitvoeren van elektroforese op 160 V in een horizontale gel bak voor ongeveer 30 min.</li>
		<li>Controleer de gel onder een UV-transilluminator (353 nm), accijnzen uit de gewenste band met behulp van een mes/scalpel onder een UV-transilluminator als de eerder gepubliceerde13,14, en zet het DNA met gel monster in een schone 1,5 mL microcentrifuge buis.</li>
		<li>Reiniging van het gel voor de ASAP1 PCR producten uitvoeren. Herstellen van het DNA in de verwijderde gel met behulp van een commerciële DNA gel zuivering kit volgens instructies van de fabrikant, en elueer de DNA in 20 ÂµL van water. 1 µL als een monster nemen en de concentratie van de DNA met een spectrofotometer meet. De instructies van de software met behulp van water als een blancocontrole15stromen.</li>
		<li>Neem 100 ng van PCR product gezuiverd en meng het met 150 ng van pDONR221 plasmide in 10 µL van TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0)16. Voeg 2 µL van BP Clonase II in de reactie en de reactie bij kamertemperatuur 's nachts uit te broeden.</li>
		<li>Op de tweede dag, voeg 1 µL van proteïnase K in de reactie en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.</li>
		<li>Transformatie uitvoeren Breng de reactie en meng het met 50 µL van Top10 bevoegde E. coli cellen en Incubeer de cellen op het ijs gedurende 30 minuten. Dan, breng de reactiebuis in een waterbad van 42 ° C voor 1 min. onmiddellijk verwijderen van de buis en incubeer op ijs gedurende 2 minuten. Vervolgens zet de buis in een shaker 37 ° C en het Incubeer gedurende 1 uur.</li>
		<li>Neem de buis en plaat van de cellen op een bord kanamycine LB. Volgende, Incubeer de plaat 's nachts (16-18 h) bij 37 ° C.</li>
		<li>Kies eenpersoons- en goed gescheiden kolonies en enten ze in 14 mL cel cultuur buizen met 3 mL van LB medium. Cultuur ze 's nachts bij 37 ° C in een shaker met een rotatiesnelheid van 250 rpm (rotatie per minuut).</li>
		<li>Uitvoeren van miniprep met behulp van een commerciële miniprep kit na de instructie handleiding17.</li>
		<li>Volgnummer 3-4 plasmiden met Sanger klonen rangschikken identificeren van positieve pDONR221-ASAP1 met behulp van M13F en M13R sequencing inleidingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maken van de constructie van de Tol2 voor microinjection: pDestTol2 -ubi-ASAP1<ol>
<li>Kies dat de volgorde gecontroleerd pDONR221-ASAP1 kloon en maatregel zijn DNA-concentratie met een spectrofotometer volgende de instructie van de software met behulp van water als een blanco controle15.</li>
		<li>Neem 100 µg voor pDONR221-ASAP1 en meng het met 100 µg Tol2 kit 5-end plasmide (pENTR5'_ubi, Addgene #27320), 100 µg p3E-polyA (Tol2 kit #302) en 150 µg voor pDestTol2pA2 (Tol2 kit #394). Totale volume aan 8 µL aanpassen met behulp van TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) in een microcentrifuge van 1,5 mL tube en meng goed door een 2-5 s korte vortex. Dan, voeg 2 µL van LR Clonase II plus, en de reactie bij kamertemperatuur 's nachts uit te broeden.</li>
		<li>Op de tweede dag, voeg 1 µL van proteïnase K in de reactie met behulp van een precisiepipet µL 10, en de reactie bij 37 ° C gedurende 30 minuten uit te broeden.</li>
		<li>Het uitvoeren van transformatie en identificeren van positieve klonen zoals hierboven (stappen 1.1.7-11) beschreven.</li>
		<li>Maatregel de DNA-concentratie van sequencing gecontroleerd pDestTol2-ubi-ASAP1 kloon (figuur 1B) met behulp van een spectrofotometer15. De concentratie is meestal rond de 200ng/µL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tol2 Transposase mRNA en injectie oplossing voorbereiden
<ol><li>Streak E. coli glycerol voorraad van pCS2FA-transposase plasmide (Tol2 kit #396) op een bord LB (met 100 µg/mL ampicilline) met een gesteriliseerde inoculatie-lus. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een broedstoof 's nachts. De volgende dag, kies een één kolonie en het in 3 mL LB (100 µg/mL ampicilline) met behulp van een gesteriliseerde 10 µL pipette uiteinde worden geënt. Cultuur het 's nachts bij 37 ° C in een shaker met een rotatiesnelheid van 250 rpm.</li>
	<li>Miniprep op de cultuur van de E. coli met behulp van een commerciële miniprep kit na haar handleiding uitvoeren. Elueer plasmide DNA in 30-50 µL van TE buffer door 1 minuut centrifuge op 14.000 rpm en de concentratie ervan DNA meten met een spectrofotometer.</li>
	<li>Linearize 1-2 µg plasmide met niet ik endonuclease en te zuiveren van het DNA met een DNA reinigingsset niet ik de handleiding na vertering. Elueer de DNA in 5 µL van water door centrifugatie bij 14.000 omwentelingen per minuut gedurende 1 minuut. De verwachte concentratie is ongeveer 200-300 ng/µL.</li>
	<li>In vitro transcriptie uitvoeren met Not ik gelineariseerde pCS2FA-transposase als een DNA-sjabloon met behulp van een commerciële SP6 transcriptie kit.</li>
	<li>Zodra de reactie wordt gebeëindigd, zuiveren Tol2 transposase mRNA met behulp van een commerciële RNA reiniging kit na instructies van de fabrikant. Tenslotte Elueer mRNA in 20 µL van de RNAase-vrij van het water en de concentratie van RNA in een spectrofotometer meten. De verwachte concentratie is ongeveer 1-3 µg / µL. monsters kunnen worden opgeslagen in een vriezer-80 ° C, indien nodig.</li>
	<li>Bereid de oplossing van microinjection door het mengen van 20 ng/µL pDestTol2 -ubi-ASAP1 en Tol2 transposase mRNA (100 ng/µL) in een microcentrifuge-buis door pipetteren. Ter voorkoming van aantasting van de nucleic zuur veroorzaakt door herhaalde ontdooien en refreezing, aliquoot 6 µL per buis en opslaan in een vriezer-80 ° C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>3. microinjection
<ol><li>Instellen van 4-6 fokken tanks met ten minste 2 reutjes en 2 teefjes de middag vóór injectie. Deze vis moet niet worden gevoed in de middag. Deze stap zal verminderen de hoeveelheid visafval en Bespaar tijd om ze schoon uit de volgende ochtend, terwijl ook het helpen voor het opwekken van een reactie van de fokkerij.</li>
	<li>De volgende ochtend Verwijder de oplossing bereid injectie (pDestTol2 -ubi-ASAP1 construct en Tol2 mRNA) uit de diepvries-80 ° C, en plaats deze op het ijs.</li>
	<li>Trek de scheidingslijnen in de vis fokken van tanks en laat de vis om te paren. In het algemeen, leggen vis eieren binnen 20-30 minuten na het uittrekken van de scheidslijn. Als niet, 1-2 uur langer wachten. Sommige vissen kunnen niet het leggen van eieren helemaal. In dit geval, herhaal dit experiment voor vis embryo's worden verzameld.</li>
	<li>Terwijl we wachten, zorg ervoor dat er naalden bereid met de tip gebroken onder een hoek maken een afgeschuinde rand met een tang, of door te breken op een delicate taak wisser.<ol>
<li>Haal de naalden van capillaire glas op een trekker van de micropipet met de volgende parameters: warmte 545; Trek 60; snelheid 80; tijd 250; Druk 500. Breken de naald met pincet onder een dissectie scope (met oog-delige liniaal voor diameter schatting) door de verlostang op een hoek van ongeveer 45 °. Gewenste naald diameters kunnen variabele afhankelijk van de instellingen van de microinjector, maar kleinere diameter is de voorkeur voor het verminderen van embryo sterfte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de vis hebben eieren gelegd, verzamelen ze in een 10-cm diameter petrischaal en breng ze naar de dissectie reikwijdte. Verwijder alle abnormale embryo's en vissen afval.</li>
	<li>Pipetteer de bevruchte embryo's in de bereide 3% agarose injectie schimmel. Verwijder overtollig water om te helpen bewaren van de embryo's op plaats.</li>
	<li>Zodra alle rijen gevuld zijn met levensvatbare embryo's, moet u deze ordenen zodat de afzonderlijke cellen alle geconfronteerd met de dezelfde richting van de naald, die ongeveer een hoek van 45° horizontaal is. Dit zal gemakkelijker injectie veel later.</li>
	<li>Terwijl het dragen van handschoenen, gebruik een Pipetteer 20 µL laden uiteinde en 5 µL van de voorbereide constructie verwijderen uit de buis op ijs.</li>
	<li>Breng zorgvuldig de tip in de back-end van het gebroken capillair helemaal naar waar het begint te tapper, over het krijgen van het reagens zo dicht mogelijk bij de tip. Als er nog luchtbellen, schud de naald, ervoor zorgend om de tip niet te breken.</li>
	<li>Plaats de naald direct in de microinjection naald houder en draai voorzichtig vast totdat de naald op zijn plaats blijft. Aanpassen van de hoek tot ongeveer 45°.</li>
	<li>Zodra de naald is opgesteld en aangesloten, zet de Membraanreservoir Microscoop en gas. Commerciële CO2 tanks zijn over het algemeen goed voor dit doel. Het geïnjecteerde volume wordt afgesteld door de holding en uitwerpen druk: geschatte 0.5 psi voor bedrijf en 30 psi voor uitwerpen. Moet u controleren dat de oplossing komt uit bij het indrukken van het pedaal.</li>
	<li>Gebruik een micrometer fase met een daling van minerale olie, pas het volume en de stroom van de oplossing voor ~ 150 µm in diameter (ongeveer 2 nL). Zorg ervoor dat de tegendruk een kleine hoeveelheid druppelen laat uit van de naald. Als er niet genoeg tegendruk, zal capillair actie veroorzaken vloeistof om te gaan van de naald en vernietigen de mRNA.</li>
	<li>Zodra de naald is gekalibreerd, beginnen de constructie injecteren in een enkele cel van de bevruchte embryo's. Opmerking: Dit gaat een grote hoeveelheid van de praktijk, geduld en finesse, als gevolg van de celmembraan wordt hard te doorboren. Het is belangrijk om te injecteren de oplossing in de cel, niet de dooier, voor het genereren van transgene zebrafish. Dit is anders dan morfolino injectie. Het maakt niet uit welke kant de naald treedt de cel zolang de constructie gaat in de cel. De Transgenese heeft een zeer laag tarief van succes als geïnjecteerd in de dooier in plaats van de cel. Eencellige fase injectie is ook belangrijk, of somatische chimera vis zal worden gecreëerd. Dit zal verminderen de kans op de transgenic gaan in de geslachtscellen.</li>
	<li>De rand van de inkeping gel gebruiken om een steun die houdt van het embryo in plaats en kan de naald druk uitoefenen zonder te verplaatsen van het embryo. Zodra de punt van de naald in een enkele cel is, druk op de pedaal om de gewenste hoeveelheid oplossing vrij te geven. Herhaal dit proces voor alle van de embryo's.</li>
	<li>Wanneer voltooid, overdracht van de geïnjecteerde embryo's in een gelabelde schotel door ze te spoelen uit de agarose inkeping met vis systeem water en een wegwerp 3,4 mL overdracht pipet. De embryo's worden opgeslagen in een incubator 28,5 ° C te laten ontwikkelen. Controleer terug gedurende de dag verwijderen dode vissen embryo's en vervang water met 0,1% methyleenblauw in water van de vis.</li>
	<li>Ongeveer 6-8 uur na de injectie, nemen 10 individuele geïnjecteerd vissen van embryo's en bereiden van genomic DNA van hen met behulp van de Hotshot methode18.</li>
	<li>De volgende ochtend, gebruik een dissectie Microscoop met een lichtbron van fluorescentie uitzoeken van de embryo's GFP in de weefsels van de niet-dooier tonen. Deze vis embryo's moeten de ingespoten construct bevatten.</li>
	<li>Tol2 accijnzen test om te controleren de transposon activiteit zoals eerder beschreven19uit te voeren. Als de verwijderde plasmide kan worden opgespoord, houden de ingespoten vissen van embryo's en hen te verhogen. Als geen verwijderde plasmide kan worden opgespoord, herhaalt u de Tol2 mRNA-synthese en microinjection proces tot het bereiken van de positieve resultaten van de bepaling van de accijnzen Tol2.</li>
</ol>4. vaststellen van de transgene ASAP1 vis, GS (ubi: ASAP1)
<ol><li>Verhogen de ingespoten vis (F0 generatie) naar volwassenheid, zoals eerder is beschreven in de zebravis boek20. Dit duurt meestal ongeveer 4 maanden.</li>
	<li>Neem een enkele volwassen F0 vis en het Kruis met een honkslag tegenover geslacht wildtype vis. Het verzamelen van vis embryo's na fokken later op de dag. Houd de verzamelde vis embryo's in de incubator 28,5 ° C in vis water met 0,1% methyleenblauw.</li>
	<li>Op de derde dag, neem contact op de vis embryo's onder een Microscoop fluorescerende dissectie met een GFP-filter. Groene vis embryo's, uitzoeken, als die er zijn, en hen te verhogen naar volwassenheid als F1 generatie transgene vis, GS (ubi: ASAP1). Opmerking: Mendelian verhouding wordt niet verwacht aangezien de meeste van de ouderlijke F0 vis germinale genetische Chimaera.</li>
	<li>Kruis één F1 volwassen vis met wildtype vis en vis embryo's te verzamelen. Groene vis embryo's uitzoeken en ze naar volwassenheid als F2 generatie vis te verhogen. Opmerking: Groen en niet-groene vis embryo's moeten zijn dicht bij 1:1 als er een enkele transgenic.</li>
	<li>Elektrische potentiële om wijzigingen te bekijken in de tumor als maligne perifere zenuw schede tumoren (MPNST), kruis de F2 generatie GS (ubi: ASAP1) vis met rpl35hi258/wt vis. Het is bekend dat zichtbare tumoren beginnen te vinden in de 6-8 maand oud volwassenen21,22.</li>
</ol>5. beeldvorming
<ol><li>Beeld van de zebravis embryo's, meerdere F2 generatie oprichter vis en kruis hen met wildtype vis in enkele letterparen. Vis embryo's verzamelen op verschillende gewenste ontwikkelingsstadia volgens de zebravis enscenering gids23.</li>
	<li>Voor de vroege stadia van vis embryo's, schil en chorions van de embryo's zorgvuldig met behulp van een paar pincet onder het toepassingsgebied van een dissectie in een 10-cm diameter petrischaal met vis systeem water verwijderen.</li>
	<li>Pipetteer een paar vis embryo's op een concaved glasplaatje met 3% methylcellulose met behulp van een precisiepipet 3,4 mL wegwerp overdracht. Aanpassen van de embryo's naar de gewenste posities te bekijken van de cellulaire GFP activiteit met behulp van een naald onder een fluorescente dissectie-scope.</li>
	<li>Voor de bewegende fasen van vis gebruiken embryo's (ouder dan 12 Somiet stadium), 0.05% tricaïne mesylaat om te anesthetize de vis embryo's voordat u ze overbrengt op dia's. Kort, vis embryo's waren ontstaan in 0.05% tricaïne mesylaat in vis water totdat ze gestopt met zwemmen en verlies lichaam evenwicht. Ook het toevoegen van een daling van 0,05% tricaïne mesylaat met de methylcellulose op de dia.</li>
	<li>Voor minder dan 12 Somiet stadium vis embryo's, gebruik een epi-fluorescentie samengestelde microscoop met een compatibele camera en software voor beeldbewerking. Voor ouder dan 12 Somiet stadium vis-embryo's, gebruikt u een fluorescentie dissectie Microscoop.</li>
	<li>Beeld van de tumor cel spanning, eerst het identificeren van de vis met MPNST tumoren. Dan anesthetize de vis met 0,05% tricaïne mesylaat. Voor hele mount imaging, zet u de vis in een 10-cm diameter petrischaal. Als u wilt weergeven van de cel van de elektrische activiteit van tumor, kunnen uit na hele mount imaging vis tumoren worden ontleed.</li>
</ol>

<ol><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bioelectricity%3A+how+endogenous+voltage+potentials+control+cell+behavior+and+instruct+pattern+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular bioelectricity: how endogenous voltage potentials control cell behavior and instruct pattern regulation in vivo.</a> Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3835-3850 (2014).</li>
<li>Storace, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Better+Genetically+Encoded+Sensors+of+Membrane+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential.</a> Trends in Neuroscience. 39 (5), 277-289 (2016).</li>
<li>Inagaki, S., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+genetically+encoded+voltage+indicators+for+neural+activity+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Current progress in genetically encoded voltage indicators for neural activity recording.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 95-100 (2016).</li>
<li>St-Pierre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+reporting+of+neuronal+electrical+activity+with+an+ultrafast+fluorescent+voltage+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical reporting of neuronal electrical activity with an ultrafast fluorescent voltage sensor.</a> Nature Neuroscience. 17 (6), 884-889 (2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Mosimann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+transgene+expression+and+Cre-based+recombination+driven+by+the+ubiquitin+promoter+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 169-177 (2011).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Ordovas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+small-size+DNA+fragments+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Separation of small-size DNA fragments using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Molecular Biology. 110, 35-42 (1998).</li>
<li>Downey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from agarose gels.</a> Methods Mol Biol. 235, 137-139 (2003).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. 45 (45), (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610, 612, 614 (2007).</li>
<li>Kawakami, K., Koga, A., Hori, H., Shima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+the+tol2+transposable+element+of+the+medaka+fish%2C+Oryzias+latipes%2C+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Excision of the tol2 transposable element of the medaka fish, Oryzias latipes, in zebrafish, Danio rerio.</a> Gene. 225 (1-2), 17-22 (1998).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edn, Univ. of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+ribosomal+protein+genes+are+cancer+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish.</a> PLoS Biology. 2 (5), E139(2004).</li>
<li>Lai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+ribosomal+protein+mutations+are+associated+with+growth+impairment+and+tumor+predisposition+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Many ribosomal protein mutations are associated with growth impairment and tumor predisposition in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 238 (1), 76-85 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+oncogenomic+analysis+of+copy+number+alterations+in+human+and+zebrafish+tumors+enables+cancer+driver+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative oncogenomic analysis of copy number alterations in human and zebrafish tumors enables cancer driver discovery.</a> PLoS Genetics. 9 (8), e1003734(2013).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+aneuploid+zebrafish+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+have+genetic+alterations+similar+to+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Highly aneuploid zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors have genetic alterations similar to human cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107 (39), 16940-16945 (2010).</li>
<li>Urrego, D., Tomczak, A. P., Zahed, F., Stuhmer, W., Pardo, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+cell+cycle+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in cell cycle and cell proliferation.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B. 369 (1638), 20130094(2014).</li>
<li>Yang, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Imaging+of+Voltage+and+Calcium+Signals+Reveals+Neural+Processing+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subcellular Imaging of Voltage and Calcium Signals Reveals Neural Processing In Vivo.</a> Cell. 166 (1), 245-257 (2016).</li>
<li>Chamberland, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+imaging+of+subcellular+voltage+dynamics+in+neuronal+tissue+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel de cellulaire en weefsel niveau elektrische activiteiten tijdens de embryonale ontwikkeling en ziekten bij de mens lang geleden ontdekt waren, nog de in vivo dynamische elektrische veranderingen en hun biologische rollen grotendeels onbekend. Een van de grootste uitdagingen is het visualiseren en kwantificeren van de elektrische veranderingen. Patch-clamp-technologie is een doorbraak voor het bijhouden van afzonderlijke cellen, maar de toepassing ervan op gewervelde embryo's is beperkt, omdat ze samengest...

Bioelectriciteit verwijst naar het endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen, gelegen op de celmembraan1. Ionische exchanges over de cellulaire membraan, en de gekoppelde elektrische potentiële en huidige wijzigingen, zijn essentieel voor de signalering van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen. Bovendien, hebben bioelectriciteit en ion verlopen allerlei andere belangrijke biologische functies zoals energieopslag, biosynthese en transport metaboliet. Bioelectrische signalen werd ook ontdekt als een regulator van embryonale patroonformatie, zoals lichaam assen, de celcyclus en cel differentiatie1. Het is dus cruciaal voor het begrip van vele aangeboren ziekten bij de mens die uit de verkeerde regulering van dit type van signalering voortvloeien. Hoewel patch-clamp wijd verbeid gebruikt is voor het opnemen van de afzonderlijke cellen, is het nog steeds verre van ideaal voor de gelijktijdige bewaking van meerdere cellen tijdens de embryonale ontwikkeling in vivo. Spanning gevoelige kleine moleculen zijn bovendien ook niet ideaal voor in vivo toepassingen als gevolg van hun specifieke kenmerken, gevoeligheden en toxicities.
De oprichting van een verscheidenheid van genetisch gecodeerd fluorescerende spanning indicatoren (GEVIs) biedt een nieuw mechanisme om deze kwestie te overwinnen, en zorgt voor gemakkelijke toepassing te bestuderen van de embryonale ontwikkeling, hoewel zij oorspronkelijk waren bedoeld voor het toezicht op neurale cellen2,3. Een van de momenteel beschikbare GEVIs is de versnelde Sensor van actie Potentials 1 (ASAP1)4. Het is samengesteld uit een extracellulaire lus van een spanning-sensing domein van spanning gevoelige fosfatase en een circulair permuted groen fluorescent proteïne. Daarom, ASAP1 kunt visualisatie van cellulaire elektrische potentiële veranderingen (polarisatie: heldergroen; depolarisatie: donkergroen). ASAP1 heeft 2 ms op-en-off kinetiek en subthreshold potentiële verandering4kunt bijhouden. Dus, deze genetische tool zorgt voor een nieuw niveau van werkzaamheid in real-time bioelectrische bewaking in levende cellen. Verder begrip van de rol van bioelectriciteit in de embryonale ontwikkeling en vele menselijke ziekten, zoals kanker, zal nieuwe licht werpen op de onderliggende mechanismen, die is van cruciaal belang voor de behandeling van de ziekte en preventie.
Zebravis hebben bewezen een krachtige diermodel ontwikkelingsbiologie en menselijke ziekten waaronder kanker5,6te gaan studeren. Zij 70% orthologous genen delen met mensen, en ze hebben soortgelijke gewervelde biologie7. Zebravis bieden relatief gemakkelijk te onderhouden, de grootte van een grote koppeling van eieren, hanteerbare genetica, gemakkelijk Transgenese en transparante externe embryonale ontwikkeling, waardoor ze een superieur systeem voor in vivo imaging5,6. Met een grote bron van mutant vis lijnen al aanwezig en een volledig gesequenceerd genoom zorgt zebravis voor een relatief onbeperkt scala aan wetenschappelijke ontdekking.
Om te onderzoeken de in vivo real-time elektrische activiteit van cellen, profiteren we van de zebravis modelsysteem en ASAP1. In deze paper, we beschrijven hoe de fluorescerende spanning biosensor ASAP1 geïntegreerd in het genoom van de zebravis met behulp van Tol2 transposon Transgenese en visualiseren van cellulaire elektrische activiteit tijdens de embryonale ontwikkeling, vis larvale beweging, en in levende tumor .

<table><tbody><tr><td>14mL cell culture tubes</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td>E.Coli culture</td></tr><tr><td>Agarose electrophoresis tank</td><td>Thermo Scientific</td><td>Owl B2</td><td>DNA eletrophoresis</td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605-500G</td><td>Voor het maken van de injectie gels</td></tr><tr><td>Attb1-ASAP1-F primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACAAGTTTGTACAAAAAA GCAGGCTTCACCATGGAGACGA CTGTGAGGTATGAACA</td><td>ASAP1 coderingsgebied versterking voor subcloning</td></tr><tr><td>Attb2-ASAP1-R primer</td><td>IDT DNA</td><td>GGGGACCACTTTGTACAAGAAA GCTGGGTCTTAGGTTACCACTTC AAGTTGTTTCTTCTGTGAAGCCA</td><td>ASAP1 coderingsgebied versterking voor subcloning</td></tr><tr><td>Bright field dissection scope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Dechorionation, micro-injectie, montage</td></tr><tr><td>Color camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRc</td><td>Vis embryo beeldopname</td></tr><tr><td>Concave slide</td><td>VWR</td><td>48336-001</td><td>Voor het vasthouden van vis embryo's tijdens het beeldvormingsproces</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette 3.4 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Vis embryo's en wateroverdracht</td></tr><tr><td>Endonuclease enzyme, Not I</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td>Voor het lineariseren van plasmide DNA</td></tr><tr><td>Epifuorescent compound scope</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager.A2</td><td>Vis embryo beeldvorming</td></tr><tr><td>Epifuorescent stereo dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>Stereo Discovery.V12</td><td>Vis embryo beeldvorming</td></tr><tr><td>Fluorescent light source</td><td>Lumen dynamics</td><td>X-cite seris 120</td><td>Lichtbron voor fluorescentie microscopen</td></tr><tr><td>Forceps #5</td><td>WPI</td><td>500342</td><td>Dechorionation en naald breken</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>11789020</td><td>Gateway BP recombinatie kloning</td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Plus enzyme</td><td>Thermo Scientific</td><td>12538120</td><td>Gateway LR recombinatie kloning</td></tr><tr><td>Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td>DNA gel zuivering</td></tr><tr><td>Loading tip</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Voor het laden van injectie oplossing in capillaire naalden</td></tr><tr><td>Methylcellulose (1600cPs)</td><td>Alfa Aesar</td><td>43146</td><td>Vis embryo montage</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Drukt schimmeluitbraken in petrischalen tegen</td></tr><tr><td>Microinjection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>Om een agarose mal lade voor het vasthouden van vis embryo's tijdens injectie voor te bereiden</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>WPI</td><td>Pneumatic Picopump PV820</td><td>Micro-injectie injector</td></tr><tr><td>Micro-manipulator</td><td>WPI</td><td>Microinjector MM3301R</td><td>Micro-injectie operatie</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td>Voor het bereiden van capillaire naald</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Amresco</td><td>J217-500ml</td><td>Voor het kalibreren van injectie volume</td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1340</td><td>mRNA in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>Monocolor camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm</td><td>Vis embryo beeldopname</td></tr><tr><td>Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4020</td><td>Kleine hoeveelheid plasmide DNA voorbereiden</td></tr><tr><td>Plastic Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Voor het vasthouden van vis of vis embryo's tijdens het beeldvormingsproces</td></tr><tr><td>RNA Clean &amp; Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>mRNA schoonmaken na in vitro transcriptie</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>Voor het meten van DNA en RNA concentraties</td></tr><tr><td>Stage Micrometer</td><td>Am Scope</td><td>MR100</td><td>Micro-injectie volume kalibratie</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td>DNA versterking voor gen klonering</td></tr><tr><td>Thin wall glass capillaries</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>Ruwe glas voor het maken van capillaire naald</td></tr><tr><td>Tol2-exL1 primer</td><td>IDT DNA</td><td>GCACAACACCAGAAATGCCCTC</td><td>Tol2 excisie assay</td></tr><tr><td>Tol2-exR primer</td><td>IDT DNA</td><td>ACCCTCACTAAAGGGAACAAAAG</td><td>Tol2 excisie assay</td></tr><tr><td>TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404006</td><td>Gebruikt voor transformatie tijdens gen klonering</td></tr><tr><td>Tricaine mesylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Voor het anesthetiseren van vis of vis embryo's</td></tr><tr><td>UV trans-illuminator 302nm</td><td>UVP</td><td>M-20V</td><td>DNA visualisatie</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>2853</td><td>Voor het transformatieproces van gen klonering</td></tr></tbody></table>

visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectriciteit, endogene elektrische signalering gemedieerd door ionenkanalen en pompen gelegen op de celmembraan, speelt belangrijke rol in het signaleren van processen van prikkelbaar neuronale en motorische cellen en vele andere biologische processen, zoals embryonale Developmental patronen. Er is echter behoefte aan een in vivo elektrische Activiteitencontrole in gewervelde embryogenese. De voorschotten van genetisch gecodeerde fluorescerende spanningsindicatoren (GEVIs) hebben het mogelijk gemaakt te bieden een oplossing voor deze uitdaging. Hier beschrijven we hoe maak je een transgene voltage indicator zebrafish met behulp van de gevestigde voltage-indicator, ASAP1 (versnelde Sensor van actie Potentials 1), als voorbeeld. De Tol2 kit en een promotor van de alomtegenwoordige zebrafish, ubi, werden gekozen in deze studie. We leggen ook de processen van Gateway site-specific klonen, Tol2 transposon gebaseerde zebrafish Transgenese en de procedure voor beginnende vis embryo's en vis tumoren met behulp van reguliere epifluorescerende microscopen. Met behulp van deze vis lijn, vonden wij dat er veranderingen van cellulaire elektrische spanning tijdens de embryogenese van zebravis en vis larvale beweging. Bovendien werd naar voren gebracht dat in een paar zebrafish maligne perifere zenuw schede tumoren, de tumor cellen waren over het algemeen gepolariseerde ten opzichte van het omliggende normale weefsel.

In een succesvolle injectie, meer dan 50% geïnjecteerd vis embryo's verschijnt een zekere mate van groene fluorescentie in de lichaamscellen, maar de meeste van hen zullen positief door Tol2 transposon accijnzen assay (Figuur 2). Na 2-4 generaties van uitgaande kruis met wildtype vis (totdat de fluorescerende vis 50 procent, de verwachte Mendelian verhouding tot), werden de transgene vis gebruikt voor de beeldvorming experiment om bij te houden van de celmemb...

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Het algemene doel van deze procedure is om een transgene zebravislijn te creëren die het mogelijk maakt om cellulaire elektrische veranderingen te observeren tijdens embryogenese, larvale beweging en tumorgenese. Deze methode zou kunnen helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsbiologie, fysiologie en kankercelbiologie, zoals wat zijn de fundamentele rollen van cellulaire elektrische signalering tijdens embryogenese en in tumorcellen? Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om cellulaire elektrische signalering in vivo en in real time te volgen.Na het prepareren van Tol2 transposase mRNA en injectieoplossing volgens het tekstprotocol, stel 's middags voorafgaand aan de injectie vier tot zes kweektanks in met minimaal twee mannetjes en twee vrouwtjes. Om de hoeveelheid visresten te verminderen en om een kweekreactie te induceren, vermijd het voeren van de vissen in de middag. De volgende ochtend haalt u de bereide injectieoplossing uit de vriezer van min 80 graden Celsius en plaatst deze op ijs.Trek de verdelers in de viskweektanks en laat de vissen paren. Over het algemeen leggen vissen eieren binnen 20 tot 30 minuten. Terwijl u wacht, trekt u met behulp van een micropipettrekker met de volgende parameters naalden uit capillairglas.Gebruik een laboratoriumdoekje om het uiteinde van de naald te breken en een afgeschuinde rand te maken. Een kleinere diameter is te verkiezen om de embryomortaliteit te verminderen. Zodra de vissen eieren hebben gelegd, verzamel ze in een petrischaal met een diameter van 10 centimeter.Onmiddellijk onder de dissectiemicroscoop verwijdert u alle abnormale embryo's en visresten. Pipetteer vervolgens de bevruchte embryo's in een voorbereide 3% agarose injectievorm. Verwijder overtollig water om de embryo's op hun plaats te houden.Zodra alle rijen gevuld zijn met levensvatbare embryo's, rangschik ze zodat de enkele cellen allemaal horizontaal onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de naald staan. Dit zal de injectie later veel gemakkelijker maken. Draag vervolgens handschoenen en gebruik een 20 microliter laadpipettip om vijf microliter van de bereide construct uit de buis op ijs te verwijderen.Breng de pipettip voorzichtig in het achterste uiteinde van de gebroken capillaire buis tot waar deze begint te taps te lopen om het reagens zo dicht mogelijk bij de punt te krijgen en spuit het in de capillair. Als er nog luchtbellen zijn, schud de naald en zorg ervoor dat u de punt niet breekt. Steek de naald recht in de micro-injectienaaldenhouder en draai voorzichtig vast tot de naald op zijn plaats blijft.Stel vervolgens de hoek in op ongeveer 45 graden. Zodra de naald is voorbereid en bevestigd, zet u de microscoop en gasdruktank aan. Pas het injectievolume aan door ongeveer 0,5 PSI voor het vasthouden en 30 PSI voor het uitwerpen te gebruiken.Controleer of de oplossing uit de naald spuit wanneer u op het pedaal drukt. Pas het volume en de stroom van de oplossing aan met behulp van een trapmicrometer met een druppel mineraalolie tot ongeveer 10 micrometer in diameter. Zorg ervoor dat de tegendruk een kleine hoeveelheid oplossing laat druppelen uit de naald.Als er niet genoeg tegendruk is, zal capillaire werking ervoor zorgen dat er vloeistof in de naald komt en het mRNA vernietigt. Zodra de naald is gekalibreerd, steekt u de naald in de enkele cel van de bevruchte embryo's door de rand van de gelnotch te gebruiken om een ondersteuning te bieden die het embryo op zijn plaats houdt en de naald toelaat om druk uit te oefenen zonder het embryo te verplaatsen. Zodra de punt van de naald in de enkele cel is, drukt u op het pedaal om de gewenste hoeveelheid oplossing vrij te geven.Het is belangrijk om de oplossing in de cel te injecteren, niet in de dooier, om transgene zebravissen te genereren. Herhaal dit proces voor alle embryo's. Wanneer u klaar bent, gebruikt u een wegwerp 3,4 milliliter transferpipet en vissysteem water om de geïnjecteerde embryo's over te brengen in een gelabelde schaal door ze uit de agarose notch te spoelen.Bewaar de embryo's in een 28,5 graden Celsius incubator om ze te laten ontwikkelen. Controleer gedurende de dag om dode visembryo's te verwijderen en vervang het water door 0,1% methyleenblauw in viswater. Ongeveer zes tot acht uur na de injectie, gebruik 10 geïnjecteerde visembryo's en de hotshot-methode om genomisch DNA te bereiden.De volgende ochtend gebruikt u een dissectiemicroscoop met een fluorescentielichtbron om de embryo's te sorteren die GFP in de niet-dooierweefsels laten zien. Deze embryo's zouden het geïnjecteerde construct moeten bevatten. Voer een Tol2 excisie-assay uit om de transposon-activiteit te controleren zoals eerder beschreven.Als er excisieplasma kan worden gedetecteerd, bewaar dan de geïnjecteerde visembryo's en kweek ze. Anders herhaalt u het Tol2 mRNA-synthese- en micro-injectieproces totdat u positieve resultaten bereikt van de Tol2 excisie-assay. Om zebravisembryo's te beeldvormen, kruist u meerdere F2 generatie stichtingsvissen met wilde type vissen in individuele paren.Verzamel visembryo's in verschillende gewenste ontwikkelingsstadia volgens de zebravis-stadiumsgids. Voor de vroege stadium visembryo's in vissysteemwater, gebruikt u onder een dissectiescoop een tang om voorzichtig de chorionen te pellen en te verwijderen. Gebruik een wegwerptransferpipet om een paar embryo's over te brengen naar een holle glazen glijbaan met 3% methylcellulose.Vervolgens, met behulp van een naald onder een dissectiescoop, pas de embryo's aan naar de gewenste posities om de cellulaire GFP-activiteit te bekijken. Voor embryo's in het stadium van minder dan 12 somieten, gebruikt u een epifluorescentie compound microscoop met een compatibele camera en software voor beeldvorming. Voor embryo's na het stadium van 12 somieten, gebruikt u een fluorescentie dissectiemicroscoop.Om tumorcelspanning af te beelden, identificeert u eerst vissen met maligne perifere zenuwschedetumoren of MPNST. Plaats de vis

visualization-cellular-electrical-activity-zebrafish-early-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

De hier beschreven protocollen maken de studie van de elektrische eigenschappen van prikkelbare cellen mogelijk in de meest niet-invasieve fysiologische omstandigheden door het gebruik van zebravis-embryo's in een in vivo systeem, samen met een op fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde, genetisch gecodeerde spanningsindicator (GEVI) die selectief wordt tot expressie gebracht in het celtype van belang.

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer hoe je cellulaire elektrische veranderingen visualiseert in zebravis embryo's en tumoren met behulp van een transgenen lijn. Deze methode maakt real-time in vivo beeldvorming van bio-elektrische signalering mogelijk.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Meer video's verkennen