Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Het algemene doel van deze procedure is om een transgene zebravislijn te creëren die het mogelijk maakt om cellulaire elektrische veranderingen te observeren tijdens embryogenese, larvale beweging en tumorgenese. Deze methode zou kunnen helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsbiologie, fysiologie en kankercelbiologie, zoals wat zijn de fundamentele rollen van cellulaire elektrische signalering tijdens embryogenese en in tumorcellen? Het grote voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om cellulaire elektrische signalering in vivo en in real time te volgen.

Na het prepareren van Tol2 transposase mRNA en injectieoplossing volgens het tekstprotocol, stel 's middags voorafgaand aan de injectie vier tot zes kweektanks in met minimaal twee mannetjes en twee vrouwtjes. Om de hoeveelheid visresten te verminderen en om een kweekreactie te induceren, vermijd het voeren van de vissen in de middag. De volgende ochtend haalt u de bereide injectieoplossing uit de vriezer van min 80 graden Celsius en plaatst deze op ijs.

Trek de verdelers in de viskweektanks en laat de vissen paren. Over het algemeen leggen vissen eieren binnen 20 tot 30 minuten. Terwijl u wacht, trekt u met behulp van een micropipettrekker met de volgende parameters naalden uit capillairglas.

Gebruik een laboratoriumdoekje om het uiteinde van de naald te breken en een afgeschuinde rand te maken. Een kleinere diameter is te verkiezen om de embryomortaliteit te verminderen. Zodra de vissen eieren hebben gelegd, verzamel ze in een petrischaal met een diameter van 10 centimeter.

Onmiddellijk onder de dissectiemicroscoop verwijdert u alle abnormale embryo's en visresten. Pipetteer vervolgens de bevruchte embryo's in een voorbereide 3% agarose injectievorm. Verwijder overtollig water om de embryo's op hun plaats te houden.

Zodra alle rijen gevuld zijn met levensvatbare embryo's, rangschik ze zodat de enkele cellen allemaal horizontaal onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de naald staan. Dit zal de injectie later veel gemakkelijker maken. Draag vervolgens handschoenen en gebruik een 20 microliter laadpipettip om vijf microliter van de bereide construct uit de buis op ijs te verwijderen.

Breng de pipettip voorzichtig in het achterste uiteinde van de gebroken capillaire buis tot waar deze begint te taps te lopen om het reagens zo dicht mogelijk bij de punt te krijgen en spuit het in de capillair. Als er nog luchtbellen zijn, schud de naald en zorg ervoor dat u de punt niet breekt. Steek de naald recht in de micro-injectienaaldenhouder en draai voorzichtig vast tot de naald op zijn plaats blijft.

Stel vervolgens de hoek in op ongeveer 45 graden. Zodra de naald is voorbereid en bevestigd, zet u de microscoop en gasdruktank aan. Pas het injectievolume aan door ongeveer 0,5 PSI voor het vasthouden en 30 PSI voor het uitwerpen te gebruiken.

Controleer of de oplossing uit de naald spuit wanneer u op het pedaal drukt. Pas het volume en de stroom van de oplossing aan met behulp van een trapmicrometer met een druppel mineraalolie tot ongeveer 10 micrometer in diameter. Zorg ervoor dat de tegendruk een kleine hoeveelheid oplossing laat druppelen uit de naald.

Als er niet genoeg tegendruk is, zal capillaire werking ervoor zorgen dat er vloeistof in de naald komt en het mRNA vernietigt. Zodra de naald is gekalibreerd, steekt u de naald in de enkele cel van de bevruchte embryo's door de rand van de gelnotch te gebruiken om een ondersteuning te bieden die het embryo op zijn plaats houdt en de naald toelaat om druk uit te oefenen zonder het embryo te verplaatsen. Zodra de punt van de naald in de enkele cel is, drukt u op het pedaal om de gewenste hoeveelheid oplossing vrij te geven.

Het is belangrijk om de oplossing in de cel te injecteren, niet in de dooier, om transgene zebravissen te genereren. Herhaal dit proces voor alle embryo's. Wanneer u klaar bent, gebruikt u een wegwerp 3,4 milliliter transferpipet en vissysteem water om de geïnjecteerde embryo's over te brengen in een gelabelde schaal door ze uit de agarose notch te spoelen.

Bewaar de embryo's in een 28,5 graden Celsius incubator om ze te laten ontwikkelen. Controleer gedurende de dag om dode visembryo's te verwijderen en vervang het water door 0,1% methyleenblauw in viswater. Ongeveer zes tot acht uur na de injectie, gebruik 10 geïnjecteerde visembryo's en de hotshot-methode om genomisch DNA te bereiden.

De volgende ochtend gebruikt u een dissectiemicroscoop met een fluorescentielichtbron om de embryo's te sorteren die GFP in de niet-dooierweefsels laten zien. Deze embryo's zouden het geïnjecteerde construct moeten bevatten. Voer een Tol2 excisie-assay uit om de transposon-activiteit te controleren zoals eerder beschreven.

Als er excisieplasma kan worden gedetecteerd, bewaar dan de geïnjecteerde visembryo's en kweek ze. Anders herhaalt u het Tol2 mRNA-synthese- en micro-injectieproces totdat u positieve resultaten bereikt van de Tol2 excisie-assay. Om zebravisembryo's te beeldvormen, kruist u meerdere F2 generatie stichtingsvissen met wilde type vissen in individuele paren.

Verzamel visembryo's in verschillende gewenste ontwikkelingsstadia volgens de zebravis-stadiumsgids. Voor de vroege stadium visembryo's in vissysteemwater, gebruikt u onder een dissectiescoop een tang om voorzichtig de chorionen te pellen en te verwijderen. Gebruik een wegwerptransferpipet om een paar embryo's over te brengen naar een holle glazen glijbaan met 3% methylcellulose.

Vervolgens, met behulp van een naald onder een dissectiescoop, pas de embryo's aan naar de gewenste posities om de cellulaire GFP-activiteit te bekijken. Voor embryo's in het stadium van minder dan 12 somieten, gebruikt u een epifluorescentie compound microscoop met een compatibele camera en software voor beeldvorming. Voor embryo's na het stadium van 12 somieten, gebruikt u een fluorescentie dissectiemicroscoop.

Om tumorcelspanning af te beelden, identificeert u eerst vissen met maligne perifere zenuwschedetumoren of MPNST. Plaats de vis