Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

Het algemene doel van deze titratie ELISA is om de affiniteitsconstante van twee bindpartners op een reproduceerbare en efficiënte manier te bepalen met behulp van een nieuw algoritme. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen, niet alleen op het gebied van de interactie tussen eiwit en ligand en receptoronderzoek, maar ook in toegepaste levenswetenschappen zoals farmaceutisch onderzoek en farmacologie. Het grote voordeel van deze techniek is dat de affiniteitsconstante van een receptor-ligand interactie eenvoudig kan worden bepaald door een receptor met een ligand te titreren op een ELISA-plaat en door een nieuw evaluatiealgoritme te gebruiken.

Begin deze procedure door de stockoplossing van Integrine Alpha 2 A Domein te verdunnen tot een eindconcentratie van vijf microgram per milliliter in TBS magnesiumchloride buffer. Zowel een wild type als een mutant Integrine Alpha 2 A Domein zullen in deze demonstratie worden gebruikt. Vul elke put van een rij op een halfgebied microtiterplaat met 50 microliters van de Integrine Alpha 2 A Domein coatingoplossing.

Voer elke titratierij minimaal in duplicaten uit. In dit voorbeeld wordt elke titratierij in quadrupletten uitgevoerd. Sluit de plaat af met folie en laat de plaat een nacht bij vier graden Celsius staan.

Verwijder de volgende dag de coatingoplossing en vul elke put met 15 microliters TBS magnesiumchloride buffer. Verwijder de wasoplossing en vul de putten met nieuwe wasoplossing. De wasbeurten zullen oplosbare receptormoleculen verwijderen die niet door fysische absorptie aan het plastic oppervlak zijn geïmmobiliseerd.

De volgende stap is het blokkeren van niet-specifieke bindingsplaatsen door 50 microliters van een oplossing van één procent BSA in TBS magnesiumchloride buffer toe te voegen aan elke put. Sluit de plaat weer af en incubeer een uur bij kamertemperatuur. Terwijl de putten van de microtiterplaat worden geblokkeerd met BSA, bereidt u een seriële verdunning van de ligand Rhodocetin voor.

Een startconcentratie van 243 email-erodeerde Rhodocetin en een verdunningsfactor van 2,3 worden in dit geval gebruikt. Bereid voor de acht titratiecurven in dit experiment 920 microliters Rhodocetin oplossing met de hoogste concentratie in één procent BSA in TBS magnesiumchloride in reageerbuis nummer één. Pipetteer 520 microliters van één procent BSA oplossing in TBS magnesiumchloride in elk van de andere tien reageerbuizen gelabeld twee tot en met elf.

Breng 400 microliters van de Rhodocetin oplossing over van reageerbuis naar reageerbuis twee. Meng beide oplossingen door schudden en breng vervolgens 400 microliters van dit mengsel over naar reageerbuis drie. Ga zo door met de seriële verdunning tot reageerbuis elf.

Voor het succes van deze procedure is het belangrijk om elke put altijd snel met oplossing te vullen om ervoor te zorgen dat de putten niet uitdrogen. Bij het einde van de incubatie van een uur, verwijder de blokkeringsoplossing van de putten van de microtiterplaat. Voeg onmiddellijk 50 microliters van de Rhodocetin oplossing uit reageerbuis één toe aan de putten van kolom één, de oplossing uit reageerbuis twee aan de putten van kolom twee, en ga zo door tot kolom elf.

Voeg 50 microliters van één procent BSA en TBS magnesiumchloride toe als ligand-vrije controle aan de putten van kolom twaalf. Sluit de plaat weer af en incubeer een anderhalf uur bij kamertemperatuur. Om niet-gebonden ligandmoleculen te verwijderen, verwijder de bindingsoplossing en vul elke put met 50 microliters HBS magnesiumchloride buffer.

Verwijder vervolgens de HBS buffer en voeg nieuwe HBS buffer toe. Om de receptor en gebonden ligand chemisch te fixeren, vult u elke put van de microtiterplaat met 50 microliters van een 2,5 procent glutaraldehyde oplossing in HBS magnesiumchloride buffer. Incubeer de microtiterplaat een tien minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder en inactiveer overtollig glutaraldehyde door de fixatieoplossing te verwijderen en elke put te vullen met 50 microliters TBS magnesiumchloride buffer. Verwijder de wasbuffer en voeg nieuwe wasbuffer toe aan elke put. Om deze test te beginnen, verwijdert u de wasbuffer van alle putten van de microtiterplaat en voegt u toe aan elke put 50 microliters van de primaire antilichaamoplossing, verdund één op tweeduizend in één procent BSA TBS magnesiumchloride.

Sluit de plaat weer af en incubeer deze bij kamertemperatuur. Verwijder de primaire antilichaamoplossing van alle putten en voeg toe aan elke put 50 microliters TBS magnesiumchloride buffer. Was drie keer met TBS magnesiumchloride buffer.

Voeg vervolgens aan elke put 50 microliters van de secundaire antilichaamoplossing toe, verdund één op tweeduizend in één procent BSA in TBS magnesiumchloride. Sluit de plaat weer af en laat deze staan bij kamertemperatuur. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing uit de putten en voeg toe aan elke put 50 microliters TBS magnesiumchloride buffer.

Was drie keer. Na de derde wassing, tikt u de microtiterplaat op een tissuedoek om alle sporen van vloeistof te verwijderen. Voeg snel 50 microliters van de alkalische fosfatase detectieoplossing toe aan elke put van de microtiterplaat met behulp van een meerkanaalspipet om de enzymatische conversie zo gelijktijdig mogelijk te starten.

Incubeer de plaat bij kamertemperatuur tot de oplossing in de putten met de hoogste ligandconcentratie geel wordt. Afhankelijk van de signaalintensiteit, kan de incubatietijd variëren tussen vijf minuten en een uur. Stop de conversie van het fosfatase substraat door met behulp van een meerkanaalspipet 50 microliters van een 1,5 molare natriumhydroxideoplossing toe te voegen aan elke put in dezelfde volgorde waarin de alkalische fosfatase detectieoplossing werd toegevoegd.

Laat de plaat enkele minuten staan om een vlekvrij mengsel van beide oplossingen te garanderen. Meet de optische dichtheid bij 405 nanometer van elke put met behulp van een ELISA lezer. Begin de gegevensanalyse door de tabel met ruwe gegevens te openen.

Kopieer de kolommen uit het Excel-bestand, open Graph Pad Prism Vijf, open een nieuw projectbestand in het hoofdmenu en kies onder nieuwe gegevens en grafiek de X Y-indeling. Kies voor elke waarde voor