Implantatie van Electrospun vaattransplantaten met geoptimaliseerde structuur in een Rat-Model
27 juni 2018
Hier presenteren we een gewijzigde electrospinning methode voor het fabriceren van PCL vaattransplantaten met dikke vezels en grote poriën en een protocol ter evaluatie van de prestaties in vivo in rat model van abdominale aorta vervanging beschrijven.
Het algemene doel van deze chirurgische ingreep is om een elektrogesponnen vasculair implantaat in de buikslagader van een rat te transplanteren en de langetermijnprestaties van het implantaat te evalueren. Deze methode is ontwikkeld door professor Deling Kong en andere collega's in onze groep en kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van elektrogesponnen vasculaire implantaten, zoals het effect van structuur en de oppervlakte-eigenschappen van het implantaat op de vasculaire regeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze goede herhaalbaarheid heeft en een hoge overlevingskans bij dieren.
Bovendien is het diermodel gemakkelijk te beheren tegen lage kosten. Dit werk zal worden uitgevoerd door onze collega, doctor Wang. Om te beginnen, bereid de polymeeroplossing voor door polycaprolacton op te lossen in een 1-op-5 mengsel van methanol en chloroform, en roer het 12 uur bij kamertemperatuur.
Laad de polymeeroplossing in een glasinjectiespuit van 10 milliliter en voorzie deze van een stompe naald van 21 gauge. Plaats vervolgens een roestvrijstalen mandrel op het opvanginstrument en zorg ervoor dat deze goed geaard is. Pas de werkafstand aan van naaldpunt tot collector tot 17 centimeter voor de 25% polycaprolactonoplossing.
Stel vervolgens de stroomsnelheid op de spuitpomp in op acht milliliter per uur. Stel vervolgens de spanning op de voeding in op 11 kilovolt en start de mandrelspin met 40 RPM om elektrogesponnen vezels te verzamelen voor een geschikte vezelverdeling. Met alles nu ingesteld, zet de voeding en de spuitpomp aan om te beginnen met het verzamelen van de elektrogesponnen vezels.
Na 4,5 minuten zet u de spuitpomp, voeding en de mandrelmotor uit. Laat het implantaat een uur in de kap drogen. Verwijder vervolgens het implantaat van de mandrel met absoluut alcohol en plaats het een nacht in een vacuüm om het resterende oplosmiddel te verwijderen.
Steriliseer het implantaat met ethyleenoxide en laat het drogen in een steriele biologische beveiligingskamer. Gebruik standaardtechnieken om SEM-beelden van het lumen van de implantaten te verkrijgen en importeer ze in ImageJ. Gebruik de meetinstrumenten om zowel de vezeldiameter als het gemiddelde poriënformaat in elk beeld te meten, om consistentie tussen de monsters te garanderen.
Om informatie over de mechanische eigenschappen van het implantaatmateriaal te verkrijgen, snijdt u eerst een buisvormig schaaltje in drie millimeter secties met behulp van een scheermesje. Gebruik vervolgens een schuifmaat om de dikte van de schalotten te meten. Laad vervolgens de schalotten in de grijpers van een trektestmachine, zodat er één millimeter tussen de grijpers is.
Houd de schalotten axiaal vast, met een snelheid van 10 millimeter per minuut, totdat ze breken. Zorg ervoor dat u zowel de treksterkte als de uiteindelijke verlenging bij breuk voor de monsters registreert. Voorafgaand aan de operatie vast u mannelijke Sprague Dawley ratten, die 240 tot 270 gram wegen, gedurende 24 uur voorafgaand aan de implantatieoperatie.
Verdoofd de rat en bereid deze voor op de operatie zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bevestig adequate verdoving door ervoor te zorgen dat de rat ontspannen spieren en stabiele ademhaling heeft. Plaats vervolgens de rat onder de operatiemicroscoop in een rugligging.
Voer met chirurgische schaar een vier tot vijf centimeter lange midline laparotomiesnede uit en leg de buikholte bloot. Trek voorzichtig de darmen terug en wikkel ze in met gaas dat is bevochtigd met zoutoplossing. Terwijl u door de operatiemicroscoop kijkt, verwijdert u de buikslagader van het aangrenzende weefsel.
Identificeer en bind alle kleine takken van de aflopende aorta, met behulp van 9-0 monofilament nylondraad. Gebruik vervolgens vaatklemmen om een geïsoleerde sectie van de aorta tot een centimeter te klemmen. Snijd vervolgens de buikslagader met een stel microschaar tussen de klemmen door.
Spuit de twee uiteinden van de aorta met heparine-zoutoplossing om het resterende bloed te verwijderen. Verwijder de adventitia van de geklemde aorta met microschaar. Plaats vervolgens een centimeter lang stukje van het gesteriliseerde implantaat in de opening die is ontstaan door het verwijderde deel van de aorta.
Gebruik 9-0 monofilament nylondraad om vier anastomosen te construeren met behulp van een figuur achtnaaldpatroon op negen uur, drie uur, twaalf uur en vervolgens zes uur posities van de proximale zijde. Bouw vervolgens de andere vier anastomosen tussen elk van de naden in de proximale zijde. Plaats het implantaat verticaal om het gelijke interval tussen de acht steken onder de operatiemicroscoop te tonen.
Nadat u de proximale naad hebt voltooid, herhaalt u het proces aan de distale zijde. Zodra het implantaat is bevestigd, verwijdert u de distale klem om het bloed in het implantaat te laten stromen en verwijdert u vervolgens de proximale klem. Gebruik een steriele katoenen bal om druk uit te oefenen om eventueel waargenomen bloeden bij de hechtingspunten te stoppen.
Druk ongeveer drie minuten lang, totdat hemostase optreedt. Breng vervolgens de darmen terug in de buikholte en spoel de buikholte met warme fysiologische zoutoplossing met gentamicine. Naai vervolgens de buikwand dicht met 3-0 nylondraad in de spier- en huidlagen.
Gebruik slechts één keer jodium op de incisie na de operatie. Breng de rat terug naar de gezelschap van anderen zodra deze volledig is hersteld. De concentratie van polycaprolacton in de elektrospinoplossing kan zowel de vezeldiameter als de mechanische eigenschappen van de implantaten beïnvloeden.
De hogere concentratie 25% oplossing produceert vasculaire implantaten met dikkere vezels en grotere poriën dan de 10% oplossing. Na drie maanden in vivo toonde histologisch kleuring een laag nieuw weefsel aan op het lumen van het implantaat en een aanzienlijke hoeveelheid collageenafzetting binnen het implantaat zelf. Deze nieuwe weefsellaag is bekleed met endotheelcellen, waaronder een laag gladde spiercellen en
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een gemodificeerde electrospinning-methode voor het fabriceren van polycaprolacton (PCL) vasculaire grafts met dikke vezels en grote poriën. Het protocol evalueert daarnaast de in vivo prestaties van deze grafts in een ratmodel voor vervanging van de abdominale aorta.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biomedische Techniek
- Vasculaire Tissue Engineering
- Electrospinning Technieken
Achtergrond
- Electrogesponnen vasculaire grafts zijn essentieel voor vasculaire regeneratie.
- Het doel van de studie is om de impact van de graftstructuur en oppervlakte-eigenschappen te begrijpen.
- Eerdere methoden vertoonden een gebrek aan consistentie in de prestaties van de grafts.
- Het ratmodel is kosteneffectief en hanteerbaar voor langetermijnstudies.
Doel van de studie
- Een elektrogesponnen vasculair transplantaat transplanteren in de abdominale aorta van een rat.
- De prestaties van het transplantaat op lange termijn evalueren.
- De reproduceerbaarheid en overlevingspercentages van de chirurgische techniek beoordelen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van de polymeeroplossing met gebruik van polycaprolacton.
- Oplossen van PCL in een mengsel van methanol en chloroform in een verhouding van 1:5.
- Het roeren van de oplossing gedurende 12 uur bij kamertemperatuur.
- Transplantatie van het transplantaat in het ratmodel.
Belangrijkste resultaten
- De gemodificeerde electrospinning-methode produceerde transplantaten met wenselijke eigenschappen.
- Tijdens de studie werden hoge overlevingspercentages bij de dieren waargenomen.
- De transplantaten vertoonden potentieel voor effectieve vasculaire regeneratie.
- De resultaten wezen op het belang van structurele en oppervlaktekenmerken.
Conclusies
- De studie heeft met succes een betrouwbare methode voor de vervaardiging van grafts vastgesteld.
- In vivo evaluaties lieten veelbelovende resultaten zien voor vasculaire toepassingen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om de prestaties van de graft te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Elektrogesponnen vasculaire grafts met een geoptimaliseerde macroporeuze structuur pakken een cruciale uitdaging in vasculaire weefseltechniek aan: het mogelijk maken van celinfiltratie en weefselregeneratie, terwijl de langdurige doorgankelijkheid behouden blijft. Deze aanpak vergroot de voorspellende betrouwbaarheid in preklinische modellen door aan te tonen dat de graftfunctionaliteit gedurende 12 maanden in stand blijft zonder nadelige remodellering. De methode biedt een reproduceerbaar, kosteneffectief ratmodel voor het evalueren van arteriesubstituten, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in ontwikkelingspipelines voor vasculaire grafts.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar structuur-eigenschapsrelaties in biomaterialen, specifiek hoe vezeldiameter en poriegrootte de vasculaire regeneratie beïnvloeden.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare chirurgische techniek met hoge overlevingspercentages bij dieren, waardoor de variabiliteit in preklinische studies wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert transplantaten met kwantificeerbare structurele parameters (vezeldikte ~5-6 μm, poriegrootte ~30 μm) die correleren met functionele resultaten zoals celingroei en collageendepositie.
- Operationele waarde: Faciliteert gestandaardiseerde fabricage en evaluatie van transplantaten, wat de assay-gereedheid ondersteunt voor comparatieve biomateriaalscreening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert langdurige openheid, weefselintegratie en de afwezigheid van calcificatie of aneurysmavorming, wat zorgt voor mechanische risicoreductie voor kandidaten voor vasculaire grafts.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale beoordeling mogelijk via echografie en histologie, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in preklinische pipelines ondersteunt.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en ondersteunt de evaluatie van biomaterialen in een vroeg stadium via langetermijnimplantatiestudies in een klinisch relevant model voor arteriële vervanging.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing over hoe de architectuur van het transplantaat de vasculaire regeneratie en remodellering beïnvloedt.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde productie en evaluatie mogelijk van elektrogesponnen transplantaten met instelbare structurele eigenschappen voor comparatieve analyse.
- Analytica: Levert kwantitatieve resultaten, waaronder treksterkte, vezeldiameter, poriegrootte, echografische doorgankelijkheid en histologische weefselintegratie.
- Translationeel onderzoek: Toont continuïteit aan van acute implantatie tot langdurige weefselremodellering, in lijn met eindpunten voor preklinische validatie.
- Bedrijfsthernieuwbare toepassing: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van diverse elektrogesponnen biomaterialen in vasculaire toepassingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de prestaties van het transplantaat door aangetoonde weefselregeneratie en de afwezigheid van nadelige remodellering.
- Operationele waarde: Hoge reproduceerbaarheid, lage kosten en eenvoudige beheersbaarheid in ratmodellen ondersteunen schaalbare preklinische tests.
- Strategische waarde: Informeert betere go/no-go beslissingen door biologische risico's in een laat stadium te verminderen via langdurige functionele validatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van vaattransplantaatkandidaten mogelijk op basis van structurele optimalisatie en in vivo duurzaamheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in electrospinningtechnieken, vasculaire chirurgie en biomateriaalcharacterisering.
- Necessiteert instrumentarium voor electrospinning, trekproeven, SEM-beeldvorming en echografische monitoring.
- Vereist standaardisatie van de protocollen voor graftfabricage, chirurgische implantatie en postoperatieve evaluatie.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij de vertaling van ratmodellen naar grotere preklinische systemen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van steriele verwerking, solventverwijdering en sterilisatie met ethyleenoxide om de veiligheid van de graft te waarborgen.
