Name: Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Leer een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van cerebrale haarvaten uit vers menselijk hersenweefsel met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode maakt onderzoek naar bloed-hersenbarrièrefunctie en signaleringsroutes mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken en erkennen van Dr. Peter Nelson en Sonya Anderson in de UK-ADC hersenen weefselbank voor het verstrekken van alle menselijke hersenen weefselmonsters (NIH grant nummer: P30 AG028383 van het National Institute on Aging). Wij danken Matt Hazzard en Tom Dolan, Information Technology Services, academische technologie en de betrokkenheid van de faculteit, Universiteit van Kentucky voor grafische bijstand. Dit project werd ondersteund door subsidie nummer 1R01NS079507 van het nationale Instituut van Neurological Disorders and Stroke (naar B.B.) en nummer 1R01AG039621 van de subsidie van het National Institute on Aging (te A.M.S.H.). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van het National Institute of Neurological Disorders en lijn of het nationale Instituut op veroudering. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De informatie hieronder is gebaseerd op de huidige veiligheids- en wettelijke normen aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY, Verenigde Staten. Als voorzorgsmaatregel inzake veiligheid, verwijzen naar de biologische veiligheidsprogramma van de instelling en de meest recente verordeningen en aanbevelingen voor het werken met menselijk weefsel.
Let op: Menselijk weefsel kan ook een bron van bloed overgedragen ziekteverwekkers, met inbegrip van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV) en anderen. Werken met menselijk weefsel brengt het risico van infectie door bloed overgebrachte ziekteverwekkers. Bepaalde overwegingen regelgevings- en veiligheid zijn dus noodzakelijk bij het werken met menselijk weefsel te beschermen van laboratoriumpersoneel. Werken met menselijk weefsel in de VS vereist een niveau 2-laboratorium van bioveiligheid, alsmede voorzorgsmaatregelen betreffende veiligheid en opleiding overeenkomstig NIH sectie IV-B-7, OSHA Act van 1970-component 5(a)(1) en van de gebruiker institutionele biologische veiligheidsprogramma. In het algemeen, moet institutionele bioveiligheid Comité en/of institutionele Review Board goedkeuring worden verkregen voorafgaand aan een onderzoek waarbij menselijke materialen (weefsels, lichaamsvloeistoffen). De opleiding is vereist voor alle personeelsleden die werken met menselijke materialen en omvat basic Labor veiligheidstraining, bijvoorbeeld, chemische hygiëne en laboratorium veiligheid, evenals specifieke opleiding inzake biologische veiligheid, gevaarlijke afvalstoffen, en mens door bloed overgedragen ziekteverwekkers. Al het personeel werken met menselijke materialen zijn sterk aanbevolen om Hepatitis B vaccinaties, voorafgaand aan het werken met menselijke materialen. Personeel zijn verplicht te dragen specifieke persoonlijke beschermingsmiddelen tijdens het werken met menselijk materiaal, bijv., een radialis laboratoriumjas en een gezicht schild, en draag handschoenen te allen tijde. Alle werk wordt uitgevoerd in een kabinet bioveiligheid (klasse 2). Alle apparatuur die in contact met menselijk materiaal en ieder afval uit menselijke materialen komt is behandeld om te voorkomen dat besmetting en/of besmetting van personeel. Alle apparatuur en oppervlakken worden schoongemaakt met 10% bleekwater en 75% ethanol na elke procedure waarbij menselijke materialen. Een lekkage met menselijke materialen moet onmiddellijk worden gereinigd. Glaswerk is een gesteriliseerde met autoclaaf na elk gebruik. Afval, met inbegrip van nietgefixeerde menselijk weefsel, is verzameld in een afval zak van gelabelde biohazard en gesteriliseerde met autoclaaf. Scherpe instrumenten worden verzameld in een container van de punctie - en lekvrije aangeduid als biohazardous. Alle afvalstoffen van menselijke materialen worden verwijderd volgens de biologische veiligheidsvoorschriften van de instelling.
Opmerking: Ons laboratorium verkrijgt verse frontale cortex monsters van overleden personen door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M). Inclusie criteria zijn: inschrijving in het UK-ADC autopsie longitudinale cohortstudie en een Post-Mortem-Interval (PMI) ≤4 h64. Lijkschouwingen volgen een standaard protocol en alle procedures voldoen aan NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Een korte PMI van minder dan 4 h is van hoogste belang om capillaire levensvatbaarheid na isolatie. Zowel vers als diepgevroren weefsel kan worden gebruikt. Als bevriezing nodig is, vers verkregen menselijk hersenweefsel moet schok-ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij-80 ° C. Verse of ontdooide weefsel moet worden opgeslagen in de buffer van de isolatie (zie hieronder) en snel verwerkt. Wij vinden dat 10 g verse menselijk weefsel opbrengsten ongeveer 100 mg van hersenen haarvaten (versgewicht).
1. setup
<ol><li>
Voorbereiding van de buffer Opmerking: De omvang van de buffer nodig afhankelijk van de hoeveelheid weefsel. Alle volumes van de buffer in de onderstaande voorschriften zijn gebaseerd op 10 g van menselijk hersenweefsel van de cortex.<ol>
<li>L geïsoleerd Buffer: 1,5 L Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM nb2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0.49 mM MgCl2) gebruiken en aan te vullen met 5 mM D-glucose (1,35 g ) en 1 mM natrium pyruvaat (0.165 g). Na toevoeging van glucose en pyruvaat, aangepast aan de pH 7.4 met natriumhydroxide. Afkoelen en bewaar de buffer 4 ° C vóór gebruik.</li>
		<li>Bovien serumalbumine (BSA): Voeg 10 g BSA poeder aan 1 L geïsoleerd buffer om een eindconcentratie van de BSA van 1%. Roer langzaam om luchtbellen te vermijden, aanpassen op een pH van 7,4 en bewaren bij 4 ° C's nachts. Onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik, voorzichtig roeren; Vermijd bubbels Voorkom albumine denaturatie vormen.</li>
		<li>kleurovergang medium dichtheid: Weeg 18 g van de kleurovergang medium dichtheid in een glazen fles en een magnetische roer-balk toe te voegen. Voeg 60 mL isolatie buffer en schud krachtig gedurende 5 min, tot alle poeder is geschorst. Winkel 's nachts bij 4 ° C om het medium dichtheid kleurovergang te ontbinden. Roer gedurende 10 min vlak voor gebruik.</li>
		<li>Opslaan van alle buffers bij 4 ° C; Houd alle tools en buffers op ijs tijdens de gehele isolatie-procedure. Roer alle buffers vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Experimentele opstelling
	<ol>
<li>Monteer de stamper van de Potter-Elvehjem weefsel molen op de elektronische Bovenroerder. Plaats de Potter-Elvehjem weefsel grinder en de Dounce homogenizer met stamper op ijs onder de motorkap. Bereiden van een 300 µm filter maaswijdte (5 x 5 cm2), vouw het tot een kegel, invoegen en koppelen aan een 50 mL Falcon buis met tape (figuur 1A).</li>
		<li>Plaats van de aansluitende ringen en cel van de stam filters (porie grootte: 30 µm) op 50 mL Falcon buizen. Biohazardous afval zakken voor te bereiden. Plaats alle benodigde apparatuur in het biosafety kabinet (Zie Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bereiding van de monsters van de hersenen
Opmerking: Figuur 1A ziet u op de grafiek van de werkstroom van de hieronder beschreven procedure voor de gehele isolatie. Menselijk hersenweefsel kan voortvloeien uit enig deel van de cortex en kan worden gebruikt, vers of bevroren. Bevroren hersenweefsel kan worden ontdooid bij kamertemperatuur (geen buffer; ~ 30 min. voor 10 g). Vergelijkbare om resultaten te bereiken, moet het hersenweefsel worden verkregen uit de dezelfde regio van de hersenen voor elk experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor vers (PMI < 4 h) menselijke hersenschors die heeft niet bevroren.
<ol><li>Voorbereiding van menselijk hersenweefsel: Document van het gewicht van het hersenweefsel. Alle getallen in het volgende protocol zijn geschikt voor 10 g verse menselijk hersenweefsel. Plaats het hersenweefsel in een petrischaal van 100 mm. Verwijder voorzichtig alle de hersenvliezen met een tang. Gebruik een scalpel afgesneden van de witte stof.</li>
	<li>Hakken van het menselijk hersenweefsel: zorgvuldig uitgesneden van het hersenweefsel en het gehakt met een scalpel. Gehakt voor ongeveer 5 minuten (2 – 3 mm stuks). Het hersenweefsel overbrengen in de Potter-Elvehjem weefsel molen. Voeg 30 mL isolatie buffer. Opmerking: De stukken gehakt weefsel zijn moeilijk te zien omdat het hersenweefsel in mush door het hakken proces verandert.</li>
</ol>3. homogenisering
<ol><li>Potter-Elvehjem weefsel slijper (goedkeuring: 150 – 230 µm): Meng van elk monster met 100 lijnen met een snelheid van de homogenizer van 50 rpm. Het document van de tijd elke 25 lijnen en de totale tijd die nodig is voor 100 slagen. Zie tabel 1 voor een voorgestelde homogenisering protocol; de totale tijd voor homogenisatie van 10 g van menselijke frontale cortex is ongeveer 22 min. Niet roer in de lucht om te voorkomen dat de bubbels.</li>
	<li>Dounce homogenizer (goedkeuring: 80-130 µm): het homogenaat overbrengen in een Dounce homogenizer op ijs. Meng de vering met 20 lijnen (~ 6 s/lijn, totaal van ~ 2 min). Vermijd bellen.</li>
</ol>4. centrifugeren
<ol><li>De hersenen homogenaat gelijkmatig moeten verdelen in vier 50 mL centrifugeren buizen en document het totale volume van het homogenaat. 50 mL dichtheid kleurovergang buffer verdelen over het centrifugeren buizen (12,5 mL per buis). Gebruik 10 mL voor isolatie buffer te spoelen van de stamper en de homogenizer, en verdelen over de vier centrifugeren buizen (~2.5 mL per buis).</li>
	<li>Strak sluit de centrifuge buizen met doppen. Meng de homogenaat kleurovergang medium dichtheid en de buffer door krachtig schudden van de buizen. Centrifugeer bij 5.800 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C (vaste hoek rotor); Selecteer de snelheid van een middelgrote vertraging te houden van de pellet gekoppeld aan de buis. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 2 mL zuiver 1% BSA.</li>
</ol>5. filtratie
Opmerking: Om te scheiden van de haarvaten van rode bloedcellen en andere cel puin, verschillende filtratie stappen nodig zijn.
<ol><li>300 µm mesh: filteren na opnieuw door de pellet te schorten, de opschorting door de Maas 300 µm. Haarvaten zijn gefilterd door de Maas, overwegende dat grotere schepen en grotere hersenen puin op de Maas blijven. De Maas met maximaal 50 mL 1% BSA grondig te wassen. Het negeren van de Maas. Opmerking: Deze stap filtratie wist de capillaire schorsing van grotere schepen of brokken van hersenen puin.</li>
	<li>
30 µM cel stam filter Opmerking: Deze stap filtratie scheidt haarvaten van rode bloedcellen en andere hersenen puin.<ol>
<li>Distribueer het capillaire filtraat uit stap 6.1 via de vijf 30 µm cel stam filters (ongeveer 10 mL capillaire filtraat per cel stam filter). Haarvaten zijn tegengehouden door dit filter, overwegende dat de rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en kleine hersenen puin het filter passeren en verzameld in het filtraat zijn.</li>
		<li>Elk filter met 25 mL van de 1% BSA wassen. Daarna giet alle filtraten het zesde filter te verhogen van het rendement. Wassen van elk filter met 50 mL van de 1% BSA; Houd de cel stam filters met die van de haarvaten en negeren het filtraat.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. capillaire collectie
<ol><li>De filters ondersteboven en wassen van de haarvaten met 50 mL van de 1% BSA voor elk filter in 50 mL buizen. Zachtjes toepassen van druk met het uiteinde van de pipet van een 5 mL-pipet en verplaats het over het filter voor het afwassen van de haarvaten van de hersenen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat alle haarvaten van de hersenen, vooral vanuit de rand van het filter afwassen. Vermijd bellen omdat dit het proces filtratie bemoeilijkt en de kans op capillaire verlies verhoogt.</li>
</ol>7. wassen
<ol><li>Na het verzamelen van de haarvaten, centrifugeren alle monsters bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C (swingende emmer rotor). Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in ongeveer 3 mL isolatie buffer. Combineer alle geresuspendeerde pellets uit één monster in een conische tube van 15 mL en vullen met isolatie buffer. Centrifugeer nogmaals bij 1.500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C en twee keer wassen.</li>
	<li>Het document van de capillaire zuiverheid met een microscoop (100 X vergroting) en de camera (figuur 1B). Opmerking: De hersenen capillaire opbrengst van 10 g van menselijk hersenweefsel is meestal ongeveer 100 mg. De haarvaten geïsoleerde hersenen kunnen nu worden gebruikt voor experimenten, verwerkt (bv., lysate, membraan isolatie), of flash-bevroren en opgeslagen bij-80 ° C in cryotubes voor een minimum van 6 – 12 maanden (Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft het isolement van intact en levensvatbare menselijk brein haarvaten van vers weefsel. In dit gedeelte bespreken we in detail de volgende: 1) wijzigingen in het protocol 2) oplossen van veel voorkomende fouten, 3) beperkingen van de techniek, 4) de betekenis van het model met betrekking tot bestaande en alternatieve bloed - hersenbarrière modellen, en 5). mogelijke toepassingen voor geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten.
Het protocol hier beschreven is geoptimaliseer...

De bloed - hersen-barrière is een strak gecontroleerde interface tussen het bloed en de hersenen die bepaalt wat er in en uit de hersenen komt. Anatomisch, endotheliale cellen componeren van de bloed - hersenbarrière en vormt een complexe, voortdurende capillaire netwerk. Fysiologisch, levert dit capillaire netwerk de hersenen met zuurstof en voedingsstoffen terwijl tegelijkertijd verwijdering van kooldioxide en afvalstoffen stofwisselingsproducten. Nog belangrijker is, ondersteunt bewijs dat de wijzigingen in de barrière aan vele ziekten bijdragen, waaronder de ziekte van Alzheimer, epilepsie en beroerte1,2,3,4,5 , 6 , 7. hersenen endotheliale cellen ook als een belemmering voor de behandeling dienen door het blokkeren van opname van de drug in de hersenen, bv., chemotherapie van glioblastoma multiforme na tumor resectie8,9, 10. In dit verband geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten vertegenwoordigen een unieke ex vivo bloed - hersenbarrière model dat sterk lijkt op barrière eigenschappen in vivo, die het mogelijk voor de studie van de barrièrefunctie en dysfunctie in gezondheid maakt en ziekte. In dit artikel geven wij een protocol om te isoleren van de haarvaten van de hersenen van menselijke hersenen op een constant hoog capillaire kwaliteit en opbrengst om te bestuderen van de bloed - hersenbarrière.
In 1969, Siakotos et al. 11 waren de eersten die het verslag van het isolement van de haarvaten van de hersenen van runderen en menselijk hersenweefsel met behulp van dichtheid kleurovergang centrifugeren en glazen kraal kolom scheiding. Later, Goldstein et al. Deze methode verbeterd 12 door het toevoegen van meerdere filtratie stappen om te verminderen van de hoeveelheid weefsel te bestuderen van de haarvaten van de hersenen van ratten, geïsoleerd met behoud van de metabole activiteit van glucose vervoer nodig. Sindsdien onderzoekers geoptimaliseerd de capillaire isolatie procedure talloze malen, verbetering van de methode en de hersenen capillaire model met elke iteratie13,14,15. Bijvoorbeeld, Pardridge et al. 16 boviene haarvaten met behulp van enzymatische spijsvertering in plaats van mechanische homogenisering geïsoleerd, en dan vervolgens doorgegeven een capillaire schorsing door een 210 µm mesh filter en een glazen kraal kolom. Deze wijzigingen de trypan blauwe uitsluiting vlek van geïsoleerde hersenen haarvaten verbeterd en dus verhoogd endothelial cel levensvatbaarheid. In de vroege jaren 1990, Dallaire et al. 17 geïsoleerd runderen en rat haarvaten, die waren duidelijk van neuronale besmetting en onderhouden metabole activiteit of alkalische fosfatase en Gamma-glutamyl transferase (γ-GTase). In 2000, Miller et al. 18, gebruikt geïsoleerde rat en varkens hersenen haarvaten in combinatie met confocale microscopie te tonen van de accumulatie van vervoer substraten in het lumen van de haarvaten. Vervolgens ons laboratorium doorgegaan met het optimaliseren van de hersenen capillaire isolatie procedure en wij hebben vastgesteld dat vervoer testen om te bepalen van P-glycoproteïne (P-gp)19,20,21, borstkanker weerstand eiwit (BCRP)22,23, en meerdere drugweerstand eiwit 2 (Mrp2)24 vervoersactiviteit. In 2004 publiceerden we twee verslagen waar we gewend geïsoleerde rat hersenen haarvaten verschillende signaalroutes onderzoeken. In Hartz et al. 21, vonden we dat de peptide endothelin-1 snel en omkeerbaar verminderd P-gp vervoer functie in de haarvaten van de hersenen door te handelen via de endothelin receptor B (ETB) receptor, stikstofoxide synthase (NOS) en proteïne kinase C, (PKC). In Bauer et al. 19, we toonden expressie van de nucleaire receptor pregnane X receptor (PXR) en toonde PXR-modulatie van P-gp expressie en vervoer functie in de haarvaten van de hersenen. In experimenten met transgene gehumaniseerd PXR muizen, we uitgebreid deze lijn van onderzoek en toonde in vivo aanscherping van het blok door upregulating P-gp via hPXR activering25. In 2010, Hartz et al. 26 gebruikt deze aanpak om te herstellen van P-gp eiwit expressie en vervoer van activiteit in transgene menselijke amyloïde precursor proteïne (hAPP) muizen die overexpress hAPP. Bovendien verminderd herstellen van P-gp in hAPP muizen aanzienlijk bèta amyloid (Aβ)40en Aβ42hersenen niveaus.
Naast het studeren signaalroutes, kunnen geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt voor het bepalen van de veranderingen in de capillaire permeabiliteit die wij capillaire lekkage noemen. In het bijzonder wordt de bepaling van de lekkage Texas Red gebruikt ter beoordeling van de lekkage van de fluorescente kleurstof Texas Red van de capillaire lumen in de tijd en deze gegevens worden vervolgens gebruikt voor het analyseren van lekkage tarieven. Verhoogde capillaire lekkage tarieven in vergelijking met die van controle haarvaten geven wijzigingen in de fysieke integriteit van de bloed - hersen barrière-2. Dit is waardevol, want er talrijke ziekte staten gekoppeld barrière ontwrichting, BV zijn., epilepsie, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer en traumatische hersenen letsel27,28,29, 30. Andere groepen hebben ook gebruikt voor geïsoleerde haarvaten te onderscheiden signaalroutes die eiwit expressie en vervoersactiviteit van proteïnen31,32,33,34regelen, 35,,36,,37. Tot slot, wij zijn blijven om het optimaliseren van deze methode voor de isolatie van menselijke hersenen haarvaten en onlangs, toonden wij verhoogde P-gp expressie op het menselijke bloed - hersenbarrière bij patiënten met epilepsie in vergelijking met inbeslagneming-gratis controle individuen38 . Samen genomen, tonen deze ontwikkelingen dat geïsoleerde hersenen haarvaten als een veelzijdig model om te studeren barrièrefunctie kunnen dienen.
Verschillende in vivo, ex vivoen in vitro de bloed - hersen barrière-modellen zijn gebruikt in basisonderzoek en industriële drug screening, hoofdzakelijk met het doel van de tests van de drug levering aan de hersenen39,40,41 ,42,43,44. Naast geïsoleerde ex vivo de haarvaten van de hersenen omvatten actuele modellen van de bloed - hersenbarrière in silico modellen, in vitro de cultuur van de cel van geïsoleerde capillaire endothelial hersencellen of vereeuwigd cellijnen uit verschillende soorten, in vitro cultuur van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) dat onderscheid in hersenen capillaire endotheliale cellen en microfluidic modellen op een chip.
In silico modellen zijn het meest gebruikt in Geneesmiddelenontwikkeling voor het selecteren van drugkandidaten op basis van het voorspelde absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding (ADME) eigenschappen. Methoden zoals kwantitatieve structuur-eigenschap relatie (QSPR) en kwantitatieve structuur-activiteit relatie (QSAR) modellen zijn populaire methoden in high-throughput screening van bibliotheken gebruikt om te voorspellen hersenen penetratie van drugkandidaten 45 , 46. deze modellen zijn nuttig voor scherm moleculen voor barrière penetratie eigenschappen.
Betz et al. 47 opgericht monolayers van gekweekte capillaire endothelial hersencellen als een in vitro -systeem van het bloed - hersen barrière-model. In vitro cel cultuur modellen met behulp van vers weefsel of vereeuwigd endothelial cellijnen zoals menselijke cerebrale microvessel endotheliale cellen (hCMECs) kunnen een ander high-throughput screening hulpmiddel voor hersenen penetratie of mechanistische studies. Echter, hersenen capillaire endothelial cel cultuur modellen ontbreken de fysiologische schuifspanning van de bloedstroom in de capillaire lumen, zijn beperkt in het algemeen biologische complexiteit en ondergaan veranderingen in expressie en lokalisatie van belangrijke barrière onderdelen zoals tight junction eiwitten kanalen oppervlakte receptoren, vervoerders, enzymen en ion48,49,50. Omgekeerd, endotheel monolayers afgeleid van hPSCs, hebben lage sacharose permeabiliteit in vergelijking met hCMEC/D3 culturen en gepolariseerde expressie van sommige vervoerders van de bloed - hersen barrière, celadhesie-moleculen en strakke kruispunten51, bevatten 52. echter deze cellen ook onderhevig is aan veranderende eigenschappen in de cultuur, en het systeem moet worden gevalideerd voor haar recapitulatie van in vivo barrière eigenschappen52.
Nieuwere tendensen in de bloed - hersenbarrière onderzoek omvatten met behulp van 3D weefselkweek systemen tot kunstmatige haarvaten, met behulp van de orgel-op-spaander technologie voor het genereren van microfluidic apparaten, of met behulp van de holle vezel technologie53, 54 , 55. kunstmatige haarvaten, hebben echter aanzienlijk grotere diameters (100 – 200 µm) dan hersenen haarvaten (3-7 µm). Vandaar, de shear krachten in vitro doen niet volledig lijken op de in vivo situatie. Dit wordt behandeld in "blood-brain-barrier-on-a-chip" microfluidic apparaten, waar kunstmatige membranen formulier "bloed" en "brein" compartimenten en vloeistoffen door deze apparaten genereren microfluidic shear krachten worden gepompt. Ook zijn mede culturen van endotheliale cellen in verschillende combinaties met astrocyten en vasculaire zachte spiercellen ook gebruikt met de holle vezel technologie te herscheppen Rheologische parameters aanwezig onder in vivo voorwaarden56 , 57 , 58. het is echter onduidelijk hoe goed dit model dat andere eigenschappen van de bloed - hersenbarrière zoals vervoer, metabolisme, signalering en anderen weerspiegelt. Deze kunstmatige capillair en chip modellen zijn geschikt voor high-throughput screening van drugs, maar de cellen die worden gebruikt voor het genereren van deze modellen kunnen ook worden gewijzigd tijdens de cultuur.
Bevroren en vaste hersenen segmenten of primaire hersenen capillaire endothelial celculturen zijn extra modellen die kunnen worden gebruikt voorhet bestuderen van de menselijke microvasculature5,59,60,,61. Bijvoorbeeld, immunohistochemistry van vaste hersenweefsel wordt gebruikt om te bepalen eiwit lokalisatie en expressie in gezonde vergeleken met zieke weefsel.
Naast weefsel segmenten en de in vitro -modellen kunnen zoals hierboven beschreven, vers geïsoleerde hersenen haarvaten worden gebruikt om het bestuderen van de bloed - hersenbarrière functie. Beperkingen van dit geïsoleerde capillaire model omvatten de moeilijkheid om op te halen van de verse menselijk hersenweefsel, afwezigheid van neuronen, astrocyten en een relatief tijdrovend isolatie-proces. Een voordeel van het geïsoleerde hersenen capillaire model is dat dit model veel overeenkomsten vertoont met de situatie in vivo en daarom kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de barrièrefunctie en dysfunctie. Nog belangrijker is, kan het ook worden gebruikt om te onderscheiden van signalering mechanismen met behulp van een veelheid aan tests en moleculaire technieken3,19,62,,63.
Ons laboratorium heeft toegang tot beide verse en diepgevroren menselijk hersenweefsel door het centrum van Sanders-Brown op veroudering (IRB #B15-2602-M)64. In dit verband lijkschouwingen volgen een standaardprotocol, hersenen worden verkregen < 4 h, en alle procedures in overeenstemming zijn met de NIH Biospecimen richtsnoeren voor beste praktijken65. Deze unieke toegang krijgen tot menselijk hersenweefsel, wij opgericht en een protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel die in een hoog rendement van intact, haalbare menselijke hersenen haarvaten resulteert geoptimaliseerd. Twee gemeenschappelijke eindpunten van belang zijn de eiwituitdrukking en activiteit te bepalen. In dit verband hebben wij en anderen verschillende tests die kunnen worden gebruikt met geïsoleerde hersenen haarvaten aan studie eiwit expressie en activiteitenniveaus vastgesteld. Deze testen omvatten westelijke bevlekken, eenvoudige Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), zymography, vervoer activiteit testen, en capillaire lekkage testen. Deze tests kunnen onderzoekers te bestuderen veranderingen in functie als barrière in menselijke pathologische voorwaarden, trajecten waaraan eiwit expressie en activiteit te bepalen, en identificeren van farmacologische doelstellingen voor de behandeling van de bloed - hersen barrière gekoppeld ziekten.
Genomen samen, vers geïsoleerde hersenen haarvaten kunnen dienen als een robuuste en reproduceerbare model van de bloed - hersenbarrière. Vooral, kan dit model worden gecombineerd met veel verschillende testen om te bepalen van een breed scala van eindpunten te bestuderen barrièrefunctie.

<table><tbody><tr><td>Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Handschoenen, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>32916-636</td><td>PBM</td></tr><tr><td>Wegwerp beschermende laboratoriumjassen</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>470146-214</td><td>PBM; vanwege de aard van het menselijk bronnenmateriaal wordt het aanbevolen om een wegwerp laboratoriumjas te dragen</td></tr><tr><td>Gezichtsbescherming, wegwerpbaar</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>19460102</td><td>PBM; vanwege de aard van het menselijk bronnenmateriaal wordt het aanbevolen om een wegwerp gezichtsbescherming te dragen</td></tr><tr><td>Veiligheidsmaterialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies Hoge Temperatuur Autoclaafzakken 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Papier 18" x 20"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>14-206-32</td><td>om werkgebieden te bedekken</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systemen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>75800-272</td><td>voor gebruikte scalpels</td></tr><tr><td>Bleekmiddel 8,2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, VS</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C Koelkast</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, VS</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscoop</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, VS</td><td></td><td>gebruikt om meninges te verwijderen</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenisator</td><td>Kinematica AG, Luzern, Zwitserland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Schaal P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, VS</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Vloeibare Stikstof Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, VS</td><td>11-670-4C</td><td>gebruikt om het weefsel te bevriezen?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytische Weegschaal</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, VS</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, VS</td><td></td><td>gebruikt om geïsoleerde capillairen te controleren</td></tr><tr><td>Gereedschap en Glaswerk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipet 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>21377823T1</td><td>was capillairen af op filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipet 100-1.000 &micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>21377821T1</td><td>resuspendeer pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, VS</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>S95938C</td><td>om hersenweefsel te snijden</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>52858-000</td><td>om beker en volumetrische fles af te dekken</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>21-377-304</td><td>om capillairen af te wassen op filter</td></tr><tr><td>60 mL spuit met Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, VS</td><td>BD309653</td><td>gebruikt met verbindingsring om capillairen te filteren</td></tr><tr><td>Scalpel Handgreep #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, VS</td><td>10060-13</td><td>gebruikt voor snijden</td></tr><tr><td>Dumont Pincetten #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, VS</td><td>11251-10</td><td>gebruikt om meninges te verwijderen</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Weefselmolen</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, VS</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, helderheid: 150-230 &mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td>VWR, Radnor PA VS</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, helderheid: 80-130 &mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Geweven Filters (300 &micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, VS</td><td>146424</td><td>Gebruikt om capillairen suspensie te filteren om eventuele meninges die mogelijk achterblijven te verwijderen</td></tr><tr><td>pluriStrainers (porengrootte: 30 &micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Duitsland</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Verbindingsring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Duitsland</td><td>41-50000-03</td><td>meerdere keren herbruikbaar</td></tr><tr><td>1 L Volumetrische Fles</td><td></td><td></td><td>voor bereiding van Isolatie Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beker</td><td></td><td></td><td>voor bereiding van 1% BSA</td></tr><tr><td>Reepjesroerder</td><td></td><td></td><td>voor bereiding van 1% BSA en Ficoll&reg;</td></tr><tr><td>Schott Fles (60 mL)</td><td></td><td></td><td>voor bereiding van Ficoll&reg;</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td></td><td></td><td>om alles koud te houden</td></tr><tr><td>100 mm Petri schotel</td><td></td><td></td><td>voor het snijden van hersenweefsel</td></tr><tr><td>Weefselkweek Cel Schraper</td><td>VWR, Radnor, PA, VS</td><td>89260-222</td><td>om supernatant te verwijderen na centrifugatie</td></tr><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fractie V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS</td><td>A9647-500g</td><td>bereid in DPBS met Ca2+ &amp; Mg2+ de dag ervoor. Vermijd bellen tijdens de bereiding. Bewaar in de koelkast.

isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Inzicht in functie van de bloed - hersenbarrière fysiologische en pathofysiologische omstandigheden is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën die de belofte houdt verbeteren hersenen drug, verbetering van de bescherming van de hersenen, en behandelen van hersenen stoornissen. Echter, het bestuderen van de menselijke bloed - hersen barrière-functie is uitdagend. Dus, is er een cruciale behoefte aan passende modellen. In dit verband vertegenwoordigen hersenen haarvaten geïsoleerd van menselijk hersenweefsel een uniek instrument om te studeren barrièrefunctie als dicht bij de mens in vivo situatie mogelijk. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de haarvaten van menselijk hersenweefsel op een hoog rendement en met constante kwaliteit en zuiverheid. Haarvaten zijn geïsoleerd uit verse menselijk hersenweefsel met mechanische homogenisering, dichtheid-verloop centrifugeren en filtratie. Na het isolement, kunnen de haarvaten van het menselijk brein worden gebruikt voor diverse toepassingen waaronder lekkage testen, levende cel imaging en immuun-gebaseerd testen aan studie eiwit expressie en functie, enzymactiviteit of intracellulaire signalering. Geïsoleerde menselijke hersenen haarvaten zijn een uniek model voor het ophelderen van de regulering van de functie van menselijk bloed - hersenbarrière. Dit model kan inzicht verwerven in het centrale zenuwstelsel (CNS) pathogenese, die bij de ontwikkeling van therapeutische strategieën helpen zal voor de behandeling van aandoeningen van de CNS.

De isolatie van menselijk hersenweefsel opbrengst een schorsing in menselijke hersenen haarvaten (figuur 1B) verrijkt met kleine hoeveelheden van grotere schepen, rode bloedcellen, andere afzonderlijke cellen en enkele cel puin. Sommige haarvaten zijn vertakt en, in sommige, rode bloedcellen zijn gevangen in de capillaire lumen. Het typische capillair heeft een diameter van 3 – 7 µm en is ongeveer 100-200 µm lang met open lumen; meeste capillaire eindigt zijn...

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van bloed-hersenbarrière-onderzoek, zoals disfunctie van de bloed-hersenbarrière, barrièrelekken en signaalroutes die specifiek zijn voor de menselijke bloed-hersenbarrière. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie mogelijk maakt van intacte, fysiologisch actieve menselijke hersencapillairen die zijn geïsoleerd uit vers menselijk hersenweefsel. Om deze procedure te beginnen, documenteer het gewicht van het menselijke hersenweefsel, dat ongeveer 10 gram zou moeten zijn.Onder de microscoop verwijdert u voorzichtig alle hersenvliezen met pincetten en gebruikt u een scalpel om de witte stof af te snijden. Snijd vervolgens het hersenweefsel voorzichtig door en hak het met een scalpel gedurende ongeveer vijf minuten. Breng het hersenweefsel over in de weefselmolen en voeg 30 milliliter isolatiebuffer toe.Homogeniseer vervolgens elk monster met 100 slagen bij 50 tpm. Roer niet in de lucht om luchtbellen te voorkomen. Documenteer de tijd elke 25 slagen en de totale tijd die nodig is voor 100 slagen.Breng daarna het homogenaat over in een Dounce-homogenisator op ijs. Homogeniseer de su

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video presents the isolation of microvessels from a rat brain using a combination of density gradient centrifugation and enzymatic digestion mehods. The isolated microvessels can be cultured in a culture flask pre-coated with collagen and fibronectin matrix to obtain endothelial cell colonies.

Endothelial Cell Culture from Rat Brain Microvessels: A Procedure to Isolate and Culture Endothelial Cells from Microvessels of Rat Brain

In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse's brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Dit manuscript beschrijft een eenvoudig en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van intracerebrale arteriolen (een groep bloedvaten die omvat parenchymale arteriolen, penetrerende arteriolen en precapillaire arteriolen) van muizen, te gebruiken in drukmyografafie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Isolatie en Canulatie van Cerebral Parenchymale Arteriolen

We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.

Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie

Hersencapillaire pericyten zijn essentiële spelers in de regulatie van bloed-hersenbarrière eigenschappen en bloedstroom. Dit protocol beschrijft hoe hersencapillaire pericyten kunnen worden geïsoleerd, gekweekt, gekenmerkt met betrekking tot celtype en toegepast voor onderzoeken van intracellulaire calcium signalering met fluorescerende sondes.

Cultuur van brain capillaire pericyten voor cytosolische calciummetingen en calciumbeeldvormingsstudies

Leer een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van cerebrale haarvaten uit vers menselijk hersenweefsel met dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode maakt onderzoek naar bloed-hersenbarrièrefunctie en signaleringsroutes mogelijk.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Meer video's verkennen