Een Microfluidic Platform voor het longitudinale beeldvorming in Caenorhabditis elegans

Het algemene doel van deze procedure is om dynamische processen in volwassen nematoden longitudinaal te beeldvormen onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden voor het volgen van gedragsreacties van wormen en de kinetiek van wormgenexpressie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over hoe dieren zich aanpassen aan veranderingen in hun omgeving, inclusief verschillen in kerngedrag, genexpressie, geheugen en leren. Deze techniek maakt de multiplex longitudinale observatie van individuele dieren mogelijk onder dynamisch gecontroleerde omgevingen, evenals het gelijktijdig bemonsteren van meerdere aspecten van aanpassing met hoge resolutie.

De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot een kwantitatief begrip van dierenaanpassing, aangezien het verkrijgen van hoge precisie kinetische gegevens wiskundige modellering en de formulering en testen van complexe hypothesen kan vergemakkelijken. Om het apparaat voor de procedure op te zetten, sluit je eerst de outlet spuittip aan op een 50 centimeter stuk spuitbuis. Om een adapternaald te maken, gebruik je een tang om de naaldas uit de naaldhub van een 20 gauge door halve inch naald te trekken en gebruik je een Bunsen-brander om de resterende plasticresten te verwijderen.

Houd beide uiteinden van de naald vast met een tang, buig de adapternaald volgens de geometrie van de experimentele opstelling en steek de naald voor de helft in het andere uiteinde van de outlet spuitbuis. Verbind vervolgens een bufferinlaat spuittip rechtstreeks met een driewegklep en verbind een bufferinlaat spuit met een meter stuk spuitbuis. Steek de adapternaald voor de helft in het open uiteinde van de buis, verbind de bufferuitwisselingsspuit met een 50 centimeter stuk spuitbuis via de spuittip.

Verbind de spuitbuis met de resterende poort van de driewegklep en sluit de klep. Gebruik een adapternaald om de worminlaatspuit te verbinden met een meterstuk spuitbuis zoals net gedemonstreerd. Spoel vervolgens alle materialen twee keer met S-medium en vul de gespoelde spuiten en buizen met vers S-medium, zorg ervoor dat je alle luchtbellen verwijdert.

Verbind nu de outlet spuitbuis met de apparaasuitlaat en steek de adapternaald aan het uiteinde van de outlet spuitbuis in de uitlaatpoort. Injecteer een kleine hoeveelheid S-medium door de outlet om het apparaat te vullen totdat S-medium uit zowel de buffer- als worminlaten komt. Verbind de bufferinlaatspuitbuis met de bufferinlaatpoort van het apparaat en sluit de worminlaat af met een roestvrijstalen stift met een diameter van een dertigst van een inch.

Monteer het microfluïdische apparaat op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde stage en plak een spuitpomp op een shaker naast de microscoop zodat de pomp niet trilt tijdens het schudden. Laad vervolgens de bufferinlaatspuit op de spuitpomp en stel de pomp in om een continue stroom van S-medium met een snelheid van drie microliters per minuut in het apparaat te leveren. Om de bacteriën in het microfluïdische apparaat te laden, laad je eerst een nieuwe spuit met een hoge dichtheidssuspensie van E.coli OP50.

Draai de spuit verticaal en tik meerdere keren op de vat om alle luchtbellen bovenaan de spuit te verzamelen. Zet de orbitale shaker uit en sluit de driewegklep van de bufferinlaatspuiten. Vervang de bufferinlaatspuit door de met bacteriën geladen spuit en duw alle lucht die zich bovenaan de spuit heeft verzameld naar buiten tot er een beetje van de bacteriesuspensie in het bufferuitwisselingssysteem komt en er geen bellen meer in de OP50-geladen spuit of de klep achterblijven.

Met de klep gesloten, verbind je de met bacteriën geladen spuit met de spuitpomp en zet je de orbitale shaker aan. Stel de schudsnelheid in op ongeveer 200 RPM en de stroomsnelheid op 100 microliters per minuut. Zodra de OP50-buffer zich door het apparaat heeft verspreid, stel je de stroomsnelheid terug in op drie microliters per minuut.

Om het apparaat met nematoden te laden, vul je eerst een 650 microliter lage bindings microcentrifugebuis met 100 microliter vers OP50-suspensie en gebruik je een worm pick om individueel 20 tot 30 leeftijdsgesynchroniseerde jonge volwassen wormen over te brengen van een nematode groeimedium agarplaat naar de buis. Vul de worminlaatspuit en spuitbuis met vers OP50-suspensie en injecteer ongeveer 500 microliter suspensie in de microcentrifugebuis. Trek vervolgens de worm suspensie in de worminlaatspuitbuis en verbind de worminlaatspuit met de worminlaat.

Injecteer alle wormen door de worminlaatspuitbuis in het microfluïdische apparaat en koppel de worminlaatspuit en spuitbuis los. Sluit de worminlaat af met een stift en koppel de bufferinlaatspuit los van de mechanische pomp. Gebruik de bufferinlaatspuit om de wormen handmatig in de kanalen te bewegen en de outlet spuit om de wormbeweging zo nodig om te keren.

Het laden van de dieren vereist enige coördinatie. Gebruik zachte duwbewegingen op de spuitkolven om te richten langs het kanaal en een wat sterkere duw om de worm helemaal naar binnen te duwen. Laat de wormen vervolgens twee tot drie uur wennen aan hun nieuwe omgeving voordat je een experiment begint.

De wormen zijn beperkt tot hun kanalen, maar ze zijn niet geïmmobiliseerd. De meeste wormen blijven gedurende het experiment in hun kanalen, maar sommige kunnen ontsnappen of verstrikt raken in de microfissuren. Hier kunnen heldere veldbeelden van een enkele, representatieve worm worden waargenomen over de loop van tien uur in het apparaat.

Met behulp van transgene wormen die GFP tot expressie brengen onder het immuunresponsgen een promotor, wordt bij P.Aeruginosa, PA14 infectie, GFP expressie waargenomen in het middenlichaam en de staart van de worm gedurende de eerste vijf uur van blootstelling aan de ziekteverwekker, toenemend tot een robuuste, volledige lichaamsuitdrukking gedurende de volgende vijf uur. Het plotten van de totale fluorescentie van elke worm als functie van de tijd na infectie illustreert de dynamica van immuunresponsgen een inductie evenals de worm tot worm variabiliteit in het tijdstip en de mate van inductie. Time-lapse be