Name: Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne-complexen gebruiken voor gerichte genoombewerking in diverse cellen en organismen. Deze methode biedt hogere efficiëntie en minder off-target effecten dan plasmide-DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de vele eerdere leden van onze labs en de Bay Area genoom bewerken Gemeenschap voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van deze methoden. Wij danken Ross Wilson voor het kritisch lezen van dit manuscript.
Alexander Marson van onderzoek wordt ondersteund door een gift van de Jake Aronov en een National Multiple Sclerosis Society verlenen (CA 1074-A-21). Alexander Marson houdt een Career Award voor medische wetenschappers uit het Burroughs-Wellcome-Fonds en is een Chan Zuckerberg Biohub onderzoeker. Jacob E. Corns onderzoek wordt ondersteund door de Li Ka Shing Foundation, het erfgoed Medical Research Medical Institute en het California Institute voor regeneratieve geneeskunde. Behnom Farboud en Barbara J. Meyer's onderzoek wordt gedeeltelijk gefinancierd door de toekenning van de NIGMS R01 GM030702 aan Barbara J. Meyer, die een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Erin Jarvis en Nipam H. Patel's onderzoek wordt gedeeltelijk gefinancierd door de NSF grant IOS-1257379 en Erin Jarvis erkent steun van een NSF-GRFP en een Philomathia Graduate Fellowship.

De auteurs Alexander Marson en Jacob E. Corn zijn mede-oprichters van Spotlight Therapeutics. Jacob E. Corn is een adviseur missie Therapeutics en zijn laboratorium gesponsorde onderzoekssteun heeft gekregen van AstraZeneca en Pfizer. Alexander Marson is een adviseur van Juno Therapeutics en PACT Therapeutics en zijn laboratorium gesponsorde onderzoekssteun heeft gekregen van Juno Therapeutics, Epinomics en Sanofi. Zijn laboratorium heeft ook toegepast voor octrooien gerelateerd aan Cas9 RNP technologie.

Tot oprichting van een robuuste genoom protocol bewerken in een cel lijn of organisme van belang vereist de optimalisatie en empirisch testen van verschillende essentiële parameters, besproken in deze sectie. Proberen een paar variaties van de algemene benaderingen die hier gepresenteerd wordt sterk aangemoedigd. De belangrijkste beperking van dit protocol is dat deze methoden toepassen op andere cellen of organismen kunnen leiden tot een verschillend resultaat afhankelijk van de soort studeerde en een experimenteel ontwerp dat tot een hoog rendement gene knock-out leidt niet DNA inbrengen kan bevorderen. Dus, is het raadzaam te beginnen met de methoden die hier gepresenteerd en het oplossen van problemen die hieronder worden beschreven.
Probleemoplossing genoom reagens kwaliteit bewerken: Genereren of aankoop van reagentia van hoge kwaliteit is een cruciale stap in een genoom bewerken protocol. Cas9 eiwit kan worden gezuiverd in het lab of commercieel ingekocht. Vele protocollen Opmerking een eindconcentratie voor Cas9 in RNP recepten, maar het optimale gen bewerken activiteit zal afhangen van de specifieke activiteit van een individuele Cas9 eiwit-preparaat, die afhankelijk van de bron varieert. Zodra het hier gepresenteerde protocol werkt, overwegen de hoeveelheid RNP gebruikt door het niveau van de Cas9 van de titrating om een optimale concentratie optimaliseren: een zeer specifiek doel DNA decolleté zonder geen onnodige af-target splijting veroorzaakt door buitensporige Cas940.
Ook kan gids RNA zuiverheid en homogeniteit determinanten van genoom succes22bewerken. Gekochte sgRNAs of afzonderlijke onderdelen van de crRNA en tracrRNA zijn over het algemeen hoogwaardige reagentia en een verscheidenheid aan chemische wijzigingen zijn beschikbaar om problemen met aantasting van het RNA te bestrijden of te doordringen van de extra functies tot de RNP91. Terwijl chemisch gemodificeerde gRNAs niet noodzakelijk voor standaard genoom bewerken experimenten zitten kan, sommige groepen geconstateerd veel hogere efficiëntie met dergelijke reagentia, bewerken zodat kunnen zij moeite waard te proberen na het beheersen van het proces en/of wanneer de aantasting van de gRNA lijkt een kwestie22,91. In vitro transcriptie en latere gel zuivering is een goedkoop alternatief, wat kan voldoende zijn voor routinematige genoom experimenten17,21,49,50bewerken. Verder verschillende benaderingen die vaak worden toegepast voor de productie van homogene gRNA populaties in vivo, met inbegrip van Ribozym en tRNA-gebaseerde excisie van individuele gidsen, kan worden uitgebreid tot in vitro RNA voorbereiding voor het genereren van schonere producten-92.
Gids RNA en DNA donor design tips: Gids RNA selectie is een kritieke factor in het bereiken van zeer efficiënte op-doelgroep bewerken terwijl het minimaliseren van de kans op uit-target decollete. Om te helpen bij de selectie van de handleiding, hebben verschillende studies high-throughput schermen in combinatie met de volgende-generatie sequencing gebruikt om te compileren reeks kenmerken van succesvolle gidsen47,79,93,94, 95,96. Deze functies zijn gebruikt om voorspellende algoritmen en online tools om te helpen in de gids selectie44,45,46,47,48te ontwikkelen. Dergelijke algoritmen zijn geaard op schermen met behulp van DNA-gebaseerde systemen voor gids RNA expressie. Gidsen worden uitgedrukt met behulp van een Pol III promotor, en hun uitdrukking is daarom onderhevig aan de beperkingen die zijn gekoppeld aan Pol III transcriptie, zoals voortijdige beëindiging wanneer het ontmoeten van sporen van uracil97,98, 99. Echter gebruik van RNPs gemaakt met in vitro-gesynthetiseerde gids RNAs omzeilt deze bezorgdheid en vereenvoudigt de beperkingen van het ontwerp van de gids. Een gemeenschappelijk kenmerk dat voortgekomen uit deze algoritmen en is bevestigd in tal van studies met zeer effectieve genoom bewerken, is de aanwezigheid van een purine, met name een guanine, 3 ' eind van de gids van doelgroepen gerichte sequentie. De functie van deze gids is zeer succesvol onder organismen variërend van zoogdieren C. elegans, fruitvliegjes en zebrafish65,100,101. Daarnaast, voor C. elegansis ontwerpen van gidsen met een GG-dinucleotide 3 ' eind van de gids targeting regio een effectieve strategie voor het voorspellen van zeer efficiënte gids RNAs65. In het ideale geval test meerdere hulplijnen in parallel om te bepalen welke is het meest succesvol voor een bepaalde toepassing.
Wanneer u probeert om een opeenvolging van DNA in het genoom, is het ontwerp van de donor of de sjabloon DNA ook cruciaal. Single-stranded oligonucleotide donoren (ssODNs) worden betrouwbaarder dan andere typische reparatie templates, lineaire double-stranded en plasmide DNA54,55,102ingevoegd. Bij sommige loci, kan HDR-efficiëntie worden verbeterd met ssODNs die dienen ter aanvulling van de doelsoort of ontheemd bundel van DNA en homologie wapens die asymmetrische in lengte27,55te bezitten. Omdat de reparatie-sjabloon wordt ingevoegd op de gesneden site en de gerichte reeks omvat, moet men om te voorkomen dat Cas9 het splijten van de donor DNA vóór of na de genomic inbrengen. Dit wordt bereikt door het aanbrengen stille mutaties een PAM sequentie of zaad regio, het vermijden van de erkenning door Cas9 met behoud van de functie van de ingevoegde gene21,103. Hoewel zelfs één nucleotide veranderingen aan de PAM dreigen af te schaffen bindende104, proberen ten minste vier nucleotiden om veilig te wijzigen.
Betekenis en toekomstige toepassingen: Genoom bewerken met CRISPR-Cas9 heeft ontpopt als een krachtige methode waarmee facile genetische manipulatie van elk organisme. Bewerken met de Cas9-RNP kost een beetje meer moeite aanvankelijk maar is eenvoudig te gebruiken zodra reagentia en protocollen gevestigd zijn in een lab. Bewerken van cellen met voorgemonteerd RNP in plaats van de plasmide DNA leidt tot hogere totale bewerken efficiëntieverbeteringen, met inbegrip van het inbrengen van de moeilijk te bereiken gene via HDR, met minder af-target effecten24,25,26 , 27 , 29. verder, experimenteurs vermijdt problemen met genexpressie, RNA afbraak, vouwing van eiwitten en de koppeling tussen gRNA en Cas9 moleculen gesynthetiseerd afzonderlijk binnen de cel22,23. Ook de bezorgdheid over de veiligheid over dat mutagenese RNP bewerken omzeilt en aanhoudende expressie die zich voordoen kan bij virale afleveringsmethoden zijn klinisch14gebruikt. Vanwege deze voordelen gunst vele wetenschappers voeren preklinische, proof-of-concept experimenten RNP bewerken voor menselijke therapeutische toepassingen. Zowel in vivo en ex vivo RNP gebaseerde genoom bewerken benaderingen zijn in ontwikkeling om te behandelen of zelfs genezen van een scala van omstandigheden, van genetische ziekten zoals Duchenne spierdystrofie105 en sikkelcelziekte27 tot HIV29 en kanker11. Cas9 RNP is interessant, steeds werkzaam als een leveringsmethode voor agrarische techniek omdat hierdoor 'DNA-vrij' bewerken van planten33,34,36.

fThe CRISPR-Cas9-systeem kan wetenschappers te wijzigen van de beoogde regio's van een genoom-1. Deze snelle en goedkope technologie heeft een revolutie teweeggebracht in fundamenteel onderzoek en belooft om een diepgaande invloed op de ontwikkeling van gepersonaliseerde ziekte therapieën, precisielandbouw, en daarna2. CRISPR bewerken is een democratiserend tool en uitvoering van het systeem in een nieuw laboratorium vereist geen bijzondere expertise in genoom engineering, alleen elementaire vaardigheden van de moleculaire biologie. Onderzoekers kunnen nu bestuderen eerder hardnekkige organismen met een paar alternatieve middelen voor genetische manipulatie3,4. In de afgelopen vijf jaar alleen al, is CRISPR genoom bewerken gebruikt om meer dan 200 verschillende gewervelde dieren, ongewervelden, plant en microbiële soorten ingenieur.
Aangepast van het traject van de prokaryote verdediging CRISPR, de kernelementen vereist voor site-specific genoom bewerking zijn de Cas9 eiwit, meestal uit S. pyogenes en codon-geoptimaliseerd met een toegevoegde nucleaire localisatie signaal (NLS), en haar gespecialiseerde RNA gids5,6. Hoewel hier niet besproken, kunnen ook andere Cas9 orthologues of het CRISPR enzym worden gebruikt. De natuurlijk voorkomende gRNA is samengesteld uit twee afzonderlijk getranscribeerde stukken, de CRISPR-RNA (crRNA) en het trans-activeren crRNA (tracrRNA)7. Deze RNAs kunnen in een enkele transcript, bekend als de single-gids RNA (sgRNA)8worden gesmolten. Meeste genoom editors kiezen de gestroomlijnde sgRNA9, hoewel de dual-gids ook wordt regelmatig gebruikt10,11. Onderzoekers een 20-nucleotide (nt) genomic DNA doelwit, kies ervoor te zorgen dat het ligt naast een korte licenties handtekening vereist voor Cas9 erkenning, genaamd een protospacer aangrenzende motief (PAM), en ontwerpen van een gRNA waarin de bijkomende opeenvolging12 .
Eenmaal in de cel, de complexe RNP haar genomic doelstelling zoekt, de gRNA baseparen met het complementaire DNA strand en vervolgens het enzym cleaves breken beide DNA-strengen voor het genereren van een dubbel-deel2. Cel reparatie machines corrigeert de DSB door tot ten minste twee wegen: via de vergissing-geneigd niet-homologe einde-toetreding (NHEJ) traject of de homologie geleide reparatie (HDR), naadloos waarin DNA met 'armen' van homologie aan weerszijden van de pauze. Het traject van de voormalige reparatie meestal leidt tot indel vorming en verstoring van de daaruit voortvloeiende gen, terwijl de laatstgenoemde kunt onderzoekers invoegen of wijzigen van DNA sequenties1.
De editing efficiëntie en nauwkeurigheid is afhankelijk van de middelen die door die Cas9 en gRNA in de cel invoert. Deze onderdelen kunnen worden geleverd aan gekweekte cellen, embryo's of organismen in de vorm van nucleïnezuren of als een voorgemonteerd RNP complexe13,14,15. Gemeenschappelijke nucleïnezuur gebaseerde leveringsmethoden omvatten de virale signaaltransductie, transfectie of electroporation plasmide DNA of mRNA. Cas9 eiwit en gids RNA worden vervolgens geproduceerd binnen de cel en ze vormen een complex te koppelen.
De directe levering van RNP vereist de afzonderlijke zuivering van de Cas9 eiwitten en RNA-gids. Dit kan binnenshuis gebeuren, of de eiwit- en sgRNA kunnen worden gekocht bij een van verscheidene commerciële leveranciers. Eenmaal hebt verkregen, zijn de Cas9 en de gRNA gemengd om het enzymatisch-bevoegde RNP complex vormen en cellen geïntroduceerd door directe injectie in embryo's bevruchte eieren, lipide gebaseerde transfectie16of electroporation. Het eerste verslag van RNP betrokken injectie in C. elegans gonaden17bewerken. Microinjection is nog steeds de voorkeur middelen van de invoering van RNP naar embryo's en hele organismen, maar effectieve electroporation is aangetoond in muis18,19 en rat20 embryo's. Wij beschrijven van protocollen voor het rechtstreeks injecteren RNP in C. elegans gonaden en P. hawaiensis embryo's en adviseren van een gespecialiseerde soort electroporation RNP kleuren eromheen als primaire menselijke cellen bewerken. Deze methode, nucleofection, omvat geoptimaliseerde electroporation programma's en cel type-specifieke oplossingen en laat de RNP het cytoplasma en de nucleus21in te voeren.
Genoom bewerken met RNP biedt een aantal verschillende voordelen. Omdat de eiwitten en RNA onderdelen vooraf gemonteerd zijn en kwaliteit kan worden gewaarborgd voorafgaand aan levering, vermijdt RNP bewerken vele valkuilen die is gekoppeld aan de levering op basis van nucleïnezuur. Namelijk, er is geen risico van Cas9-encoding DNA integratie in het genoom van de gastheer, mRNA wordt nooit blootgesteld voor afbraak en het omzeilt problemen met in vivo gRNA of eiwit expressie, vouwen en vereniging22,23. Verder, met behulp van RNP leidt tot lagere toxiciteit en veel minder uit-target gebeurtenissen dan de plasmide gebaseerde expressie, een gevolg van de kortere halfwaardetijd van de RNP binnen de cel24,25,26,27.
Ten slotte leidt RNP bewerken aantoonbaar tot hoge bewerken in een verscheidenheid van menselijke cellijnen, primaire cellen zoals fibroblasten, embryonale stamcellen (SER's), pluripotente stamcellen (iSPCs), HSPCs geïnduceerde, en T16,24cellen, 25,26,27,28,29; in ongewervelden zoals C. elegans, P. hawaiensisen fruitvliegjes3,17,30; in gewervelde dieren zoals zebrafish, muizen en ratten31,32; in plantensoorten met inbegrip van Arabidopsis, tabak, sla, rijst, grapevine, apple, maïs en tarwe33,34,35,,36; Chlamydomonas, Penicillium, en Candida soorten37,38,39. De frequentie van indel vorming hoger kan zijn bij het gebruik van RNP ten opzichte van de levering van de plasmide, en HDR-gemedieerde DNA invoeging kunnen gemakkelijker te bereiken van25,27,29.
De hier beschreven protocol maakt gebruik van de Cas9-RNP en is een doeltreffende, gemakkelijk aanpasbaar techniek die is eenvoudig toe te passen op een breed scala aan biologische systemen40,41, vooral in cellen die anders moeilijk zijn om te werken met en in organismen zonder gevestigde systemen voor nauwkeurige genetische manipulatie. We beginnen door te beschrijven hoe te ontwerpen, verkrijgen en monteren van de Cas9-RNP voordat over het gebruik ervan in heel ander model celtypes en organismen. Hematopoietische stamcellen/progenitor cells (HSPCs) en T-cellen worden bewerkt met behulp van dezelfde methode, nucleofection, zodat zij samen in stap 2 en 3 van dit protocol vallen. Het bewerken van procedures voor C. elegans zijn beschreven in stap 4 en 5, en P. hawaiensis bewerken vindt u in stap 6 en 7. Tot slot, aangezien het succes van een experiment bewerken van gen in een organisme kan worden beoordeeld door sequentiebepaling van het genotype, substeps met een beschrijving van mogelijke analysemethodes voor alle cellen en organismen die zijn beschreven in het protocol zijn beschreven in stap 8.

<table><tbody><tr><td>Reagents/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td>IDT zal aangepaste DNA-sequenties leveren, inclusief die in Tabel 1</td></tr><tr><td>Guide RNAs</td><td>Synthego</td><td>-</td><td>Synthego zal hoogwaardige sgRNA's leveren voor S. pyogenes Cas9, inclusief aangepaste sgRNA's met de targetingsequenties in Tabel 1</td></tr><tr><td>Gezonde Cas9-proteïne (EnGen&nbsp;Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>Indien mogelijk is het zuiveren van Cas9 in-house of het kopen van lokale kernfaciliteiten een goedkopere optie</td></tr><tr><td>Normale perifere bloed CD34+ stam-/voorlopercellen</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium, met natriumbicarbonaat, zonder L-glutamine, vloeibaar</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Human T Cell Isolation Kit</td><td>Stemcell</td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>celcultuurplaat, 96 putjes, rond</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500-pack IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Nematode Growth Media agar in petrischalen</td><td>-</td><td>-</td><td>Zie Stiernagle, T (ref. 59)</td></tr><tr><td>Standaard borosilicaat glas capillairen met filament:&nbsp; 4 inch (100 mm), 1/0.58 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Enkelvats standaard borosilicaat glas capillairen: 6 inch (152 mm), 2/1.12 OD/ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas; 24 &times; 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas; 22 &times; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE agarose</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Halocarbon olie 700</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>pCFJ90 plasmid</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>Gecomprimeerde stikstof</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mM kweekschalen</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaire buizen met filament: 4 inch (1,0 mm)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (100 &times; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamdraad (0,005 inch diameter)</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoralkyloalkane (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeewater</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9" pasteur pipetten</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenolftaleïne</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-vrij water</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&nbsp;Stereomicroscoop</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Uit productie. Huidig model is de M80 Stereomicroscoop</td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert35 omgekeerde fasecontrast fluorescerende microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Uit productie. Huidig model is de Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>Laser-gebaseerde micropipet puller (voor C. elegans protocol)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>Picoliter Microinjector (voor C. elegans protocol)</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>Drie-assige joystick olie hydraulische micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>Grof manipulator</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet puller (voor P. hawaiensis protocol)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector (voor P. hawaiensis protocol)</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Microloader pipetten tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde genoom bewerken met cas9 ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Sitespecifiek eukaryotische genoom bewerken met CRISPR (geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen)-Cas (CRISPR-geassocieerde) systemen is snel uitgegroeid tot een alledaags onder onderzoekers nastreven van een breed scala aan biologische vragen. Gebruikers gebruiken meestal de Cas9 eiwitten van Streptococcus pyogenes in een complex met een gemakkelijk geherprogrammeerde gids RNA (gRNA). Deze onderdelen worden ingevoerd in cellen, en door middel van een base in paren rangschikken met een aanvullende regio van het dubbelstrengig DNA (dsDNA) genoom, het enzym cleaves beide strengen voor het genereren van een double-strand break (DSB). Latere reparatie leidt tot willekeurige invoeging of schrapping gebeurtenissen (microdeleties) of de opneming van geleverde experimentator DNA op de site van de pauze.
Het gebruik van een gezuiverde single-gids RNA en Cas9 eiwit, voorgemonteerd vormen een RNP en rechtstreeks geleverd aan cellen, is een krachtige aanpak voor het bereiken van zeer efficiënte gene bewerken. RNP bewerken verbetert met name de snelheid van gene inbrengen, een resultaat dat is vaak een uitdaging om te bereiken. Ten opzichte van de levering via een plasmide, leidt de kortere persistentie van de Cas9-RNP binnen de cel tot minder af-target gebeurtenissen.
Ondanks zijn voordelen zijn veel casual gebruikers voor het bewerken van CRISPR-gen minder vertrouwd zijn met deze techniek. Lagere de toetredingsdrempel, duidelijk naar voren komt gedetailleerde protocollen voor de uitvoering van de strategie van RNP in allerlei contexten, aandacht voor zijn duidelijke voordelen en diverse toepassingen. We dekken bewerken in twee soorten primaire menselijke cellen, T-cellen en hematopoietische stamcellen/voorlopercellen (HSPCs). Ook laten we zien hoe Cas9 RNP bewerken maakt het mogelijk de facile genetische manipulatie van hele organismen, met inbegrip van het klassieke model rondworm Caenorhabditis elegans en meer onlangs geïntroduceerd model schaaldieren, Parhyale hawaiensis.

Deze experimenten Toon hoe voorgemonteerd Cas9 RNP kan worden gebruikt voor het manipuleren van het genoom van primaire cellen en hele organismen. Onderzoekers zuiveren of aankoop Cas9 eiwit en sgRNA, combineren van de twee componenten vooraf tot het complex en de RNP introduceren in hun cellen of organismen van belang. Na het toestaan van voldoende tijd voor bewerken en u zich voordoen en voor de nakomelingen van de volgende generatie om geboren te worden (indien van toepassing), kijk voor fenotypes en/of cellen voor genotypering verzamelen. Fenotypen kunnen worden waargenomen via functionele testen, testen van de expressie, visualisatie (door oog of met microscopie) of andere methoden, afhankelijk van het experiment.
Bijvoorbeeld, de HSPCs die zijn bewerkt om te corrigeren van de β-globine-mutatie die sikkelcelziekte veroorzaakt kunnen worden onderscheiden in erythrocyten en vehiculumcontrolegroep voor de productie van gezonde of sikkel hemoglobine27,87 (Figuur 1 A). T-cellen bewerkt om knock-out het hoge-affiniteit IL-2 receptor gen, CD25 (IL2RA), kunnen worden geanalyseerd door de oppervlakte kleuring en stroom cytometry88en functioneel geanalyseerd om te detecteren een signalering reactie op IL-2 stimulatie (Figuur 1B ). T-cellen kunnen ook worden geherprogrammeerd in veel klinisch belangrijke manieren waarvoor beoordeling van verschillende fenotypes, met inbegrip van de werkzaamheid van HIV infectie89 en de in vivo antitumorale werkzaamheid van auto-T cellen11.
Met behulp van een aanpak van de screening van de co-CRISPR/co-conversion, zijn C. elegans wormen bewerkt gelijktijdig twee loci62. HDR op het dpy-10 referentie gen met behulp van een ssODN herstellen sjabloon resultaten in een gemakkelijk scoorde dominante dpy-10 winst-of-function mutatie. Heterozygoot F1dpy-10(gof) dieren zijn roller (Rol) en homozygoot dpy-10(gof) dieren zijn dumpy (Dpy). De aanwezigheid van het fenotype geeft aan dat Cas9 bewerken voorgedaan in deze dieren en verbetert de kansen van de identificatie van een bewerken evenement op de tweede plaats in de Rol of Dpy F1 -dieren. Een succesvolle bewerken experiment moet leiden tot 33-50% van de geïnjecteerde P0 wormen opbrengst van 20 of meer F1 nakomelingen die Rol of Dpy90 zijn. Het is dan mogelijk om te kiezen van niet-Rol dieren naar dpy-10 terug naar wildtype en selecteer voor de homozygoot bewerken van belang. Als een vuistregel moet de concentratie van de crRNA gericht op het co-CRISPR referentie gen helft dat van de crRNA gericht op het gen van belang. Als een bewerking in het gen van belang is niet hersteld, kunnen verhogen de kans van het herstellen van de gewenste mutatie de verhoudingen van de twee CRISPR RNAs worden aangepast. Bijvoorbeeld, zal verhoging van het bedrag van crRNA voor het gen van belang ten opzichte van de referentie-gene crRNA verhoging van het percentage van wormen bewerkingen in het gen van belang in de bevolking van wormen die ook bewerkingen op de referentie gene locus bezitten bezitten. Co conversie frequenties variëren, maar de tarieven zijn meestal 20-60%, vaak opbrengst homozygoot bewerkingen in de F1 generatie (Figuur 1C).
P. hawaiensis hatchlings, die zijn bewerkt om knock-out het Abdominale-B gen (Abd-B) weer duidelijk morfologische afwijkingen3 (Figuur 1D). Dit gen is vereist voor correcte abdominale patronen, en de resultaten van de verstoring in de thoracale-type springen en lopen benen ter vervanging van het zwemmen en anker benen die gewoonlijk aanwezig zijn op de buik.
Bepalen van genoom bewerken van resultaten op het niveau van de genotypische is sequencing of een in vitro assay die reeks wijzigingen detecteert vereist. Hier, laten we representatieve sequencing gegevens uit onze model celtypes en organismen, markeren van verschillende benaderingen voor het bewerken van kwantificering. Merk op dat de figuur labels zijn gegeneraliseerd omdat alle methoden die hier worden weergegeven op een biologisch systeem kunnen worden toegepast.
Sequencing gebaseerde benaderingen variëren in complexiteit en diepgang van de resultaten. Voor klonen bewerkte populaties of gemakkelijk scheiden individuele organismen, kunnen bewerkte individuen worden sequenced na genomic DNA-extractie. Standaard Sanger rangschikkend resultaten zal onthullen de wijziging van de volgorde op de site van de Cas9-cut in een bepaald individu, met het hypothetische leesraamverschuiving die zijn functie(Figuur 2 verstoren zou). De online tool gebruikt voor het rangschikken is een ander Sanger sequencing gebaseerde benadering die kan worden toegepast op gemengde bevolking in plaats van individuele mutanten78. Sequenties worden geanalyseerd met een online tool die, bewerken totaalrendement evenals overheersende reeks resultaten benaderen kan. De representatieve gegevens worden weergegeven in Figuur 2B.
De meest grondige sequencing hier beschreven methode is diepe sequencing (soms aangeduid als high-throughput of next-generation sequencing). Deze methode biedt DNA-sequenties van individuele genomen in een gemengde bevolking. Dergelijke gegevens kan geïllustreerd worden in een verscheidenheid van manieren. Wij hebben hier, individuele sequencing leest ingedeeld van bewerkte cellen op basis van het bewerken resultaat (Figuur 2C). De meeste cellen worden bewerkt via de NHEJ-pathway, die meestal tot verstoring van de gen leidt. In anderen, heeft het doel-gen werd geruild voor een alternatieve versie via HDR27.
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg"> Tabel 1: positieve controles voor voorlopige genoom bewerken experimenten. Deze tabel toont de kerngegevens te bevatten die nodig zijn voor het uitvoeren van een genoom van de eerst bewerken experiment in elk van de cellen en organismen die worden beschreven in dit protocol. Na deze parameters is waarschijnlijk een succesvol resultaat dat kan worden gebruikt om te testen het protocol opleveren of als een basis voor vergelijking eens de experimentator is gericht op een gen van hun eigen belang. F: toekomen, R: omgekeerde, HDR: homologie geleide reparatie. <a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om te downloaden van deze tabel.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg"> Figuur 1 : Vertegenwoordiger fenotypische resultaten Cas9 RNP bewerken van primaire menselijke cellen en organismen. (A) dit is een spoor van de HPLC waaruit blijkt dat na succesvolle genoom bewerken, HSPCs, die zijn onderscheiden in laat-stadium erytroblasten meer functioneel hemoglobine produceren zal dan sikkelvormige hemoglobine. Mutant erytrocyten produceren sikkelcel-hemoglobine (HbS), terwijl cellen bewerking is voltooid zal het produceren van gezonde hemoglobine (HbA en HbA2) evenals fetal hemoglobine (HbF). De absorptie is opgenomen in een willekeurige eenheden (au) in een grafiek. Dit paneel werd voor het eerst gepubliceerd in DeWitt et al. 27. het is herdrukt met toestemming van de Amerikaanse Vereniging voor de Advancement of Science. (B) aan de linkerkant, voor elke voorwaarde, dit paneel toont stroom cytometry gegevens waaruit blijkt dat oppervlak gebeitste T cellen doen niet express CD25 na het CD25 -gen uit met RNP heeft geslagen. De overvloed van CD25 is met de grootte van de cel op de y-as uitgezet op de x-as. Aan de rechterkant, voor elke voorwaarde, toont dit paneel de kwantificering van de Phospho-Stat5 (pStat5) na een inductie met IL-2. De signalering is verminderd wanneer de IL-2 receptor afwezig (CD25 KO is). De overvloed van pStat5 is uitgezet op de x-as en de gegevens die voortvloeien uit drie verschillende niveaus van IL-2 input verticaal worden vergeleken. (C) dit paneel toont een Caenorhabditis elegans co-CRISPR/co-conversion scherm gericht op dpy-10 als co conversie markering. Twee RNAs doel twee loci, dpy-10 en uw favoriete gen (yfg), begeleiden in de dezelfde P0-ingespoten dier. HDR op dpy-10 resultaten een Rol of Dpy fenotype. De selectie van Rol - of Dpy-F1 dieren verhoogt de kans op identificatie van bewerkingen op de tweede plaats. (D) dit paneel blijkt dat wildtype Parhyale hawaiensis hatchlings normale buikjes met zwemmen en anker benen hebben. De Abd-B knock-out hatchlings (F0 personen) ontwikkelen een buik getransformeerd naar de thorax. Dus, het zwemmen en ankers benen zijn gegaan en vervangen door de benen van het springen en lopen een normale thorax is gekoppeld. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg"> Figuur 2 : Typische resultaten bewerken resultaat analysemethoden. (A) dit deelvenster ziet u voorbeelden van het Sanger rangschikkend resultaten van individuele F1 P. hawaiensis organismen, met inbegrip van de volgorde van wildtype en drie verschillende microdeleties die de genfunctie verstoren door een verschuiving van het open leesraam. (B) deze tij blijkt het aantal ingevoegde en schrapping gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden op de site van een Cas9-target in een pool van gesequenceerd T-cellen. De x-as geeft de lengte van een bepaalde invoeging of deletie in nucleotiden. (C) deze diepe rangschikkend resultaten tonen geen genoom bewerken zonder nucleofection of gRNA, en succesvolle bewerken met intact Cas9 RNP, gegroepeerd op DNA reparatie resultaat in HSPCs. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Het algemene doel van dit protocol is om gerichte genomische veranderingen aan te brengen in een verscheidenheid aan cellen en organismen met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïnecomplexen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van fundamentele biologische vragen door onderzoekers de mogelijkheid te geven om op maat gemaakte inserties, deleties en substituties te genereren in anders ongewijzigde genomen van model- en niet-modelorganismen. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ribonucleoproteïne of RNP-complexen in plaats van plasmide-DNA is dat de efficiëntie hoger is en dat off-target-gebeurtenissen worden verminderd.De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar ex vivo therapieën om zaken als kanker, HIV of genetische ziekten te bestrijden. Dit komt omdat genoombewerking kan worden gebruikt om schadelijke mutaties te corrigeren of zelfs de capaciteit van cellen om schadelijke ziekten te bestrijden te verbeteren. Dus deze methode kan inzichten bieden in primaire menselijke cellen, C.elegans en Parhyale hawaiensis.Het kan worden toegepast om genetische veranderingen aan te brengen in honderden andere systemen, inclusief eerder onaansprekelijke organismen. Begin deze procedure met het ontwerpen en voorbereiden van geleide RNA zoals beschreven in het tekstprotocol. Maak een RNP-complex door een een- tot tweevoudige molaire hoeveelheid geleide RNA te mengen met 200 picomol Cas9-eiwit in een totaal volume van 10 microliter.Voeg heel langzaam geconcentreerd Cas9 toe aan de geleide RNA gedurende ongeveer 30 seconden, waarbij u snelle cirkels maakt met de pipette. Breng de uiteindelijke Cas9-concentratie naar 20 micromolair. Voeg vervolgens 10 microliter RNP toe aan elke cuvet-put.Na het voorbereiden van HSPC's zoals beschreven in het tekstprotocol, tel de cellen met een hemocytometer en breng 150.000 tot 200.000 cellen per cuvet over naar een centrifugeerbuis om te electroporeren. Spuit de buis gedurende 10 minuten met 100 keer de zwaartekracht om de cellen te bezinken. Zuig het supernatant op met een pipette of vacuüm en verwijder eventuele luchtbellen.Meng de cellen voorzichtig met 20 microliter elektroporatiebuffer per cuvet-put. Voeg vervolgens 20 microliter van de cellen die 150.000 tot 200.000 HSPC's bevatten toe aan elke cuvet-put die al 10 microliter van de RNP bevat en meng goed door op en neer te pipetteren zonder luchtbellen te maken. Eindelijk, electroporeer de cuvetten nadat ze in een Nucleofector zijn geplaatst.Gebruik voor de HSPC's de pulscode ER-100. Begin met de voorbereiding van C.elegans in agarose pads zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats een agarose injectiepad en deksel op een dissectiescoop.Gebruik een wormpick om een kleine baan van Halocarbon olie langs een rand van het pad te leggen. Gebruik vervolgens de wormpick bedekt met olie om verschillende wormen van de NG agar plaat op te tillen en in de baan van olie te leggen. Met een fijn haar bevestigd aan een pipette, zoals een wimper of kattenharen, positioneer de wormen parallel en duw de wormen voorzichtig in de agarose pad.Tot u vertrouwd bent met de micro-injectieprocedure, injecteer slechts één worm per keer. Eenmaal in positie en bevestigd aan het pad, bedek de wormen met nog een paar druppels Halocarbon olie vanaf het uiteinde van de wormpick. Plaats het deksel met de gemonteerde wormen op de injectiescoop.Onder een lage vergroting, positioneer de wormen loodrecht op de injectienaald die is gevuld met de RNP-oplossing, zoals beschreven in het tekstprotocol. Schakel naar een hoge vergroting en positioneer de naald naast de gonadearm, overeenkomend met het gebied nabij de kernen in mid tot late pachyteen. Gebruik de micromanipulator om de naald tegen de worm te bewegen, waarbij de cuticula lichtjes wordt ingedrukt.Tik vervolgens met één hand op de zijkant van het microscoopstadium om de naald door de cuticula te laten schudden. Druk op de injectiepaddle of knop, vul langzaam de gonadearm met de injectiemix en verwijder de naald. Herhaal de stap met de andere gonadearm.Zodra de wormen zijn geïnjecteerd, verwijder het deksel en de agarose pad en plaats het onder een dissectiescoop. Gebruik een getrokken capillaire pipette om de olie van de wormen te verplaatsen door er een M9 buffer over te pipetten. Voer deze behandeling uit om de wormen van de agar los te maken.Na 10 minuten, wanneer de wormen rond zwemmen in de buffer, verplaats ze naar een NG agar plaat met OP50 bacteriën met behulp van de getrokken capillaire pipette. Plaats de plaat op 20 graden Celsius gedurende twee tot drie uur tot de wormen hersteld zijn en rond zwemmen. Eenmaal hersteld, zet u de wormen individueel over naar NG agar platen met OP50.Vervolgens, zet u de platen in een 25 graden Celsius incubator. Verzamel de enkele cel Parhyale embryo's bij nul tot vier uur na bevruchting door eerst gravide vrouwtjes te anesthetiseren met 0,02% kruidnagel olie en zeewater. Schraap voorzichtig de embryo's uit haar ventrale broedpouch met behulp van een vlam getrokken en afgeronde glas pipette en een dof paar nummer drie forceps.Gebruik gecomprimeerde stikstof om de Parhyale embryo's te injecteren onder een dissectiescoop met behulp van een micro-injector en een micromanipulator. Laad 1,5 microliter van de injectiemix in de achterkant van een getrokken capillaire buis met behulp van een microloader pipettetip. Nadat de naald op het injectieapparaat is ingesteld, breekt u het uiteinde van de naald met behulp van een paar forceps onder de dissectiescoop.Kalibreer het geleverde volume door in Halocarbon olie 700 te injecteren en de diameter van de bel te meten. Snijd een trog uit de uithardingsmiddel met behulp van een scheermes. Vul het voor de helft met filter-gesteriliseerde zeewater en lijn de Parhyale embryo's op in de trog voor injectie.Injecteer de embryo's met behulp van de micro-injectie set-up, waarbij elk embryo wordt gestabiliseerd met een paar forceps tijdens de injectie. Gebruik na de injectie een glazen overdrachtspipet om de embryo

enhanced-genome-editing-with-cas9-ribonucleoprotein-diverse-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Recente vooruitgang in het vermogen om somatische cellijnen genetisch te manipuleren, biedt een groot potentieel voor basis en toegepast onderzoek. Hier presenteren wij twee benaderingen voor CRISPR / Cas9 gegenereerde knockout productie en screening in zoogdiercellijnen, met en zonder het gebruik van selecteerbare markers.

Selectieafhankelijke en onafhankelijke generatie van CRISPR / Cas9-gemedieerde Gene Knockouts in zoogdiercellen

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas is een krachtige technologie om ingenieur van het complex genoom van planten en dieren. Hier, detail we een protocol bij het menselijk genoom met behulp van verschillende Cas enzym efficiënt te bewerken. We benadrukken belangrijke overwegingen en ontwerpparameters bewerken efficiëntie te optimaliseren.

Genoom bewerken in zoogdieren cellijnen met behulp van CRISPR-Cas

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.

Onderzoek naar de transcriptionele rol van een RUNX1 Intronic geluiddemper door crispr/Cas9 Ribonucleoprotein in acute myeloïde leukemie cellen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor naadloze genbewerking in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een piggyBac-gebaseerd donorplasmide en de Cas9-nickasemutant. Tweepuntsmutaties werden geïntroduceerd in exon 8 van de hepatocytaire alfafactor 4 alfa (HNF4α) locus in menselijke embryonale stamcellen (hESCs).

Introductie van puntmutaties in menselijke pluripotente stamcellen met behulp van naadloze genoombewerking

Het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem is een gebruiksvriendelijke genoomeditor die is gebruikt in model- en niet-modelsoorten. Hier presenteren we een eiwit-gebaseerde versie van dit systeem dat werd gebruikt om een voortijdige stop codon te introduceren in een paring gen van een niet-model filamenteuze ascomycete schimmel.

CRISPR-Cas9-Gemedieerd Genoombewerking in de filamenteuze Ascomycete Huntiella omanensis

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Leer CRISPR/Cas9 ribonucleoproteïne-complexen gebruiken voor gerichte genoombewerking in diverse cellen en organismen. Deze methode biedt hogere efficiëntie en minder off-target effecten dan plasmide-DNA.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Meer video's verkennen