Name: Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer hoe u lipiden kwantificeert en de verdeling ervan evalueert in Caenorhabditis elegans met Nile red en Oil Red O kleuring. Deze eenvoudige methode biedt inzicht in lipidenmetabolisme en homeostase.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de NIH-subsidie: R01GM109028 (S.P.C.)

1. Nijl rood (NR) kleuring van lipiden
<ol><li>Bereiding van de stockoplossing NR 5 mg/mL<ol>
<li>In een fles van 500 mL, voeg 100 mg poeder NR tot 200 mL 100% aceton.</li>
		<li>Dekking van de fles met aluminiumfolie om te voorkomen dat de eventuele blootstelling aan licht.</li>
		<li>Roer de oplossing gedurende 2 uur in het donker voor gebruik.</li>
		<li>Voor langdurig gebruik, bewaar de stockoplossing van NR in een strak verzegelde fles zonder eventuele blootstelling aan licht. Schaal NR stockoplossing volgens onderzoeksbehoeften. Zorg ervoor dat het dezelfde stockoplossing over NR-kleuring experimenten wordt gebruikt om consistente kleuring en imaging resultaten te verkrijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van NR werkoplossing<ol>
<li>Voor elke 1 mL van 40% isopropanol (v/v), voeg 6 µL van de stockoplossing NR.</li>
		<li>Bereiden 600 µL NR werkende oplossing voor elk monster. Opmerking: Zorg verse NR werken oplossing recht vóór de kleuring. Afhankelijk van de behoeften van de stockoplossing van NR, een 15 mL of conische tube van 50 mL studeerde aan gebruiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van wormen NR lipide kleuring<ol>
<li>Groeien wormen te vroeg stadium van de L4 bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) bezaaid met laat-log OP50 E. coli.</li>
		<li>Wassen van de wormen uit de plaat met 1 mL 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing + 0,01% Triton X-100 (PBST) oplossing en zet de opschorting van de worm in een 1,5 mL microfuge buis.</li>
		<li>Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en herhaal deze stap tot en met E. coli is uitgeschakeld van schorsing.</li>
		<li>Voeg 100 µL van 40% isopropanol naar de worm pellet en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en schenk de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verstoren van de worm-pellet. Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen de wormen uit de platen als met behulp van grotere platen of kleuring meer wormen per plaat. De wormen in PBST meer dan 15 min voordat de monster fixatie niet wassen. Voer extra wast als het supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Voeren de incubatietijd in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker. Altijd controleren de buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipide kleuring met NR<ol>
<li>Voeg in het donker, 600 µL NR werkoplossing aan elk monster. De buizen drie keer omkeren en volledig Meng de wormen in NR oplossing.</li>
		<li>Het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur roteren.</li>
		<li>Na de incubatie, centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en verwijder de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Voeg 600 µL van PBST en de monsters in het donker gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige NR vlek uit te broeden.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en alle ongeveer 50 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opmerking: NR-incubatie vereist geen agitatie. Beslechting van wormen is gebruikelijk tijdens deze stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van dia's voor Microscoop imaging<ol>
<li>Resuspendeer de pellet worm in de resterende supernatant.</li>
		<li>Plaats van 5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje en zet een dekglaasje aan op zorgvuldig om te voorkomen dat alle luchtbellen overvullen.</li>
		<li>Zegel van het dekglaasje aan met nagellak voor imaging wormen.</li>
		<li>Alleen een paar dia's tegelijk te bereiden. Dit zal ervoor zorgen NR imaging in verschillende steekproeven constant blijft. De kwaliteit van beelden NR gebeitste vermindert na 6 h. Discrete lipide druppels moeilijk zijn te observeren en achtergrond fluorescentie toeneemt, die interfereert met NR signaal detectie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldvorming van NR gebeitste wormen<ol>
<li>Het imago van de wormen bij 5 X vergroting te vangen verschillende dieren per gezichtsveld.</li>
		<li>Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere kwantificering van individuele wormen.</li>
		<li>Gebruikmaken van FITC/GFP channel beeld NR gebeitste wormen en proberen verschillende belichtingstijden te bepalen van de optimale omstandigheden voor kwantificering.</li>
		<li>Bestanden opslaan in de TIF-indeling om te voorkomen dat het verlies van gegevens als gevolg van compressie. Opmerking: Typische blootstelling tijden variëren van 100-1000 ms. met een optimale belichtingstijd, gebruiken voor alle monsters imaging consistentie wordt gehandhaafd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NR kleuring afbeelding kwantificering<ol>
<li>Upload microfoto aan ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.</li>
		<li>In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.</li>
		<li>Pas helderheid/Contrast van de afbeelding stack in het zelfde pull-down menu, en propageren van wijzigingen in alle afbeeldingen door te klikken op toepassen.</li>
		<li>Dienst van het gereedschap Veelhoek af te bakenen elk verbeelde worm en gebruik van de functie onder het analyse pull-down menu te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie die wordt uitgestoten door NR.</li>
		<li>Voor elke afbeelding, meten van de vijf locaties van de achtergrond en de intensiteit van de fluorescentie gemiddelde achtergrond te berekenen.</li>
		<li>Aftrekken van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond van elk verbeelde worm met de formule N = G - (A x B), waarbij N staat voor netto fluorescentie, G voor bruto fluorescentie, A voor totale worm gebied en B voor gemiddelde achtergrond fluorescentie.</li>
		<li>Verdelen om de intensiteit van de fluorescentie normaliseren door de grootte van de worm, van elk worm net fluorescentie door haar totale oppervlakte. De resultaten worden gerapporteerd als intensiteit van de fluorescentie, in willekeurige eenheden (a.u.), per pixel. Opmerking: Vermijd het exporteren van afbeeldingen in JPEG-indeling. Terwijl compressie bestanden gemakkelijker te beheren om op te slaan maakt, wordt gegevensintegriteit gecompromitteerd door deze verkoopvorm. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen worden bewerkt en geanalyseerd identiek. Vergeet niet om een bar schaal om de grootte in verschillende vergrotingen correct kan bepalen. Om de verschillen in de intensiteit van de fluorescentie met behulp van ImageJ beter te visualiseren, afbeelding schakelaartype van RGB naar 8-bits en selecteer brand in het Afbeeldingsmenu lookup tabellen (LUT). Hierdoor ontstaat een warmte-kaart beeld in welke verhoogde kleur helderheid met verhoogde fluorescentie intensiteit correleert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. olie kleuring rode O (ORO) van lipiden
<ol><li>Bereiding van de stockoplossing van ORO<ol>
<li>In een fles van 250 mL, voeg 500 mg van ORO poeder tot 100 mL voor 100% isopropanol en meng het goed.</li>
		<li>Zodra voorbereid, slaan de oplossing strak verzegeld met geen blootstelling aan licht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de ORO werkoplossing<ol>
<li>Verdun ORO stockoplossing in 60% isopropanol en water (3:2).</li>
		<li>Vóór gebruik, de werkoplossing ORO wordt gefiltreerd door een 0,2 µm celluloseacetaat steriele injectiespuit filter. Opmerking: Voor de beste oplossing kwaliteit ORO werkoplossing eergisteren voorbereiden, en laat het 's nachts mengen. Echter als oplossing nodig dezelfde dag, verdunnen en mengen van ORO oplossing op een rocker gedurende ten minste 2 uur vóór gebruik. Wikkel voordat schommelen, conische buis in paraffine tape om te voorkomen lekkage van ORO oplossing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van wormen ORO lipide kleuring<ol>
<li>Groeien de wormen bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) met laat-log OP50 E. coli naar gewenste leven fase agarvoedingsbodem.</li>
		<li>Voeg 1 mL PBST oplossing aan de plaat en swirl totdat alle wormen uit de plaat zijn. Kantelen van de plaat en wassen met 1 mL PBST. Breng de worm een 1,5 mL microfuge buis.</li>
		<li>Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en herhaal het wassen stap met 1 mL PBST driemaal. Verwijder alle supernatant maar 100 µL.</li>
		<li>600 µL van 40% isopropanol toevoegen aan de worm pellet en rock bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer de wormen op 560 x g voor 30 s en verwijder alle supernatant maar 100 µL zonder de worm pellet te verstoren. Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen wormen uit platen als doet high-throughput kleuring. Wormen in PBST meer dan 15 min vóór monster fixatie niet wassen. Doen extra wast als supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Incubation in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker verrichten. Altijd controleren buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lipide kleuring met ORO<ol>
<li>600 µL ORO werkoplossing aan elk monster toevoegen. De buis drie keer omkeren en meng de wormen goed in ORO.</li>
		<li>Draaien van de monsters bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle supernatant maar 100 µL.</li>
		<li>Resuspendeer de monsters in 600 µL van PBST en draai de buizen bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige ORO vlek.</li>
		<li>Centrifugeer steekproeven bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle maar 50 µL van de bovendrijvende substantie.</li>
		<li>Om een beter onderscheid de locatie van het dier germline en intestinale cellen, te beitsen kernen door toevoeging van 1 µL van (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indole-6-carboxamidine) (DAPI) voor elke 1 mL van de werkoplossing ORO. Verrichten ORO kleuring voor 2 h met het toevoegen van de DAPI vóór montage van dia's voor imaging. Intestinale kernen zijn groter in omvang en de gonaden onderscheidt zich door de ontwikkelingslanden geslachtscellen. Opmerking: Na ORO kleuring, wormen kunnen houden aan de zijkanten van de microfuge buis en niet een merkbaar pellet vormen. Als dit gebeurt, de wormen nogmaals centrifugeren of toestaan van wormen te regelen door de zwaartekracht voor minstens 10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de dia's van worm imaging<ol>
<li>Resuspendeer de wormen in het resterende supernatant en meng de oplossing goed.</li>
		<li>5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje zetten en plaats een dekglaasje aan zorgvuldig, ervoor te zorgen dat geen lucht belletjes vorm.</li>
		<li>Zegel van het dekglaasje aan met nagellak en afbeelding wormen. Opmerking: Na vaststelling en kleuring, wormen kunnen worden zeer rigide en moeilijk te Pipetteer. Om te omzeilen dat, wide-boring pipetten te maken door het afsnijden van hun tips.</li>
		<li>De dia's opslaan in een micro-centrifuge rek bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur als niet onmiddellijk na de kleuring imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldvorming van ORO gebeitste wormen<ol>
<li>Gebruik een kleur-compatibele camera naar afbeelding ORO gebeitste worms.</li>
		<li>5 X vergroting gebruiken om het imago van de verschillende wormen in één gezichtsveld.</li>
		<li>Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere behandeling van individuele wormen.</li>
		<li>Afbeeldingen in de TIF-indeling om te voorkomen dat gegevens verloren gaan als gevolg van compressie exporteren. Opmerking: Als de kleuring met ORO + DAPI, de kleur-compatibele camera kunnen overschakelen naar één die fluorescentie vangen kan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beeldanalyse van ORO gebeitste worms<ol>
<li>Upload micrograph(s) naar ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.</li>
		<li>In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.</li>
		<li>Aanpassen Helderheid/Contrast onder het zelfde pull-down menu om de zichtbaarheid van lipide druppels te verbeteren.</li>
		<li>De beelden volgens lipide accumulatie in hele lichaam van het dier of in specifieke weefsels te categoriseren.</li>
		<li>Voor betere evaluatie van lipide lokalisatie en voor de identificatie van niet-specifieke afbeelding artefacten met behulp van ImageJ, selecteert u de functie van de kleur onder het beeld pull-down menu en klik op Stack naar RGB te tonen van de signalen van elke component RGB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nile+red%3A+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).</li>
<li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets at a glance.</a> J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).</li>
<li>Horobin, R. W., Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorobin%2C+RW+%22Conn%27s+biological+stains%3A+a+handbook+of+dyes%2C+stains+and+fluorochromes+for+use+in+biology+and+medicine%22">Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine</a>. , BIOS Scientific Publishers. (2002).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).</li>
<li>Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+for+mafr-1+in+reproduction+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis.</a> Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).</li>
<li>Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+and-6+fatty+acids+allocate+somatic+and+germline+lipids+to+ensure+fitness+during+nutrient+and+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).</li>
<li>Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKN-1+and+Nrf2+couples+proline+catabolism+with+lipid+metabolism+during+nutrient+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Saltiel, A. R., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signalling+and+the+regulation+of+glucose+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism.</a> Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).</li>
<li>Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lipidome%3A+A+primer+for+lipid+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).</li>
<li>Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PloS One. 5 (9), e12810(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+and+functional+study+of+lipid+metabolic+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 14 (1), 164(2013).</li>
<li>Folick, A., Min, W., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+dynamics+using+Coherent+Anti-stokes+Raman+Scattering+%28CARS%29+and+Stimulated+Raman+Scattering+%28SRS%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy.</a> Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De toename van zwaarlijvigheid en stofwisselingsziekte tarieven maakt C. elegans een geschikt model te bestuderen van de mechanismen die vet accumulatie in cellen en weefsels regelen. Recent bewijs suggereert dat de veranderingen in lipide-niveaus zijn gecorreleerd met cellulaire processen variërend van insuline8, de activering van hormoon receptoren2, tot voortplantingsresultaat5signalering. In vergelijking tot label-vrije microscopie en ch...

Vetten zijn essentieel voor het leven. Ze vormen integrerende bestanddelen van membranen, fungeren als secundaire boodschappers signaal transductoren en cruciale functies hebben in de energie-opslag. Wanneer lipide metabolisme dysregulated is, leidt het tot ziekten als obesitas en diabetes type II, die zijn indrukken van de volksgezondheid betreft9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een uitstekend model-organisme in te studeren lipide metabolisme omdat het heeft een relatief korte levenscyclus, een transparante body, een bekende cel afkomst en een volledig gesequenceerd genoom. Voornamelijk een hermafrodiet, C. elegans kunnen onderzoekers te verhogen van grote aantallen isogene dieren in korte perioden naar eroptoetezien high-throughput voorwaartse genetische schermen te bestuderen van een breed scala aan metabole genen en trajecten4. Deze aanpak is gebleken dat een hoge mate van instandhouding in 273 C. elegans lipide metabolisme genen tussen mens, muizen, ratten en drosophila. Bovendien hebben meer dan 300 lipide genen in C. elegans menselijke orthologues die gekoppeld aan ziekten die niets met metabool syndroom11 zijn. Traditioneel heeft onderzoek van lipide-opslag in C. elegans meestal waarop de kleurstof-geëtiketteerden testen, die robuuste informatie om lipide accumulatie bieden. Minder voorkomende is een beschrijving van waar lipiden lokaliseren en gemeten verschillen in lipide overvloed over weefsels. Recent werk is echter gebleken dat lipide distributie zo belangrijk als lipide accumulatie6 zijn kan.
Lately, studies zijn begonnen met het integreren van methoden zoals hoge prestatie vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (HPLC-MS), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), en coherente anti-stokes Raman microscopie van de verstrooiing (auto's) wil de tekortkomingen van vlek gebaseerde benaderingen door direct het analyseren van de inhoud van lipide extracten, specifieke lipide breuken, en lipide deposito's, respectievelijk10,11. Auto's microscopie is bovendien gebleken dat Nile rood alleen als een proxy voor vet accumulatie dienen kan wanneer gebruikt als een kleefpoeders kleurstof, voor het gebruik ervan als een vitale vlek leidt tot uit-target kleuring van auto-belichting fluorescerende organellen10. Echter, de vereiste technische deskundigheid en kosten in verband met deze chromatografie en Microscopie methodes benutten hun onhoudbaar voor veel onderzoeksvragen. In dit artikel bespreken we een handige en betrouwbare methode om te fixeren en neutrale lipide deposito's in C. elegans met behulp van de Nijl rode vlekken en rode O om te onderscheiden van lipide overvloed bij hele dieren en bij specifieke weefsels olie.
Nile rood, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, is een benzophenoxazone kleurstof die gemakkelijk in verschillende organische oplosmiddelen oplost, maar meestal slecht in water oplosbaar is. Het is een uitstekende lysochrome kleurstof gebruikt om neutrale lipiden zoals triglyceriden vlek of cholesterol esters omdat het beschikt over een sterke kleur, Lost goed in lipiden, heeft verwaarloosbare interactie met de omringende weefsels en is minder oplosbaar in het oplosmiddel dan in lipiden. Het heeft een excitatie en emissie-maxima van 450-500 en 520 nm, respectievelijk1. Wanneer Nile rood gebeitste C. elegans voor groene fluorescentie wordt bekeken, kunnen discrete lipide organen worden waargenomen in de darm en andere weefsels of in clusters of gelijkmatig verspreid, afhankelijk van het genotype van het dier of de experimentele behandeling 7.
Olie rood O is een lysochrome, vet oplosbare kleurstof gebruikt om vlek triglyceriden en lipoproteïnen. Het is een azo-kleurstof genoemd, omdat de chemische structuur twee azo groepen gekoppeld aan drie aromatische ringen bevat. Het is moeilijk te ioniseren, waardoor het zeer goed oplosbaar in lipiden. De vlek kleur is rood en de lichte absorptiemaximum 518 nm 3. C. elegans gekleurd met olie rood O Toon rode lipide druppels die opvallen tegen transparant lichaam van het dier, dat vergemakkelijkt de kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over de verschillende weefsels en6.

<table><tbody><tr><td>Imager.M2m Microscope</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>ERC5s camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Kleur-capabel</td></tr><tr><td>MRm camera</td><td>Axiocam</td><td>n/a</td><td>Fluorescentie-capabel</td></tr><tr><td>Nile red</td><td>Thermo Fisher</td><td>N1142</td><td>Lipide kleurstof</td></tr><tr><td>Oil red O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12989</td><td>Lipide kleurstof</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>DNA kleurstof</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>BDH</td><td>BDH1133-1LP</td><td>Fixeeroplossing</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m seterile spuitfilter</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Cellulose acetaat filter</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5428000015</td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Shaker Rotisserie</td><td>Lab Quake</td><td>400110Q</td><td>Shaker</td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7758-11-4</td><td>NGM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>NGM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>7786-30-3</td><td>NGM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td>NGM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>NGM</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Teknova</td><td>L9110</td><td>NGM</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3147</td><td>Bacteriegroei</td></tr></tbody></table>

kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in caenorhabditis elegans door nile rood en olie red o kleuring

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is een uitzonderlijke modelorganisme waarin lipide metabolisme en energie homeostase te studeren. Veel van de lipide-genen zijn bewaard in mens en metabool syndroom of andere ziekten zijn gekoppeld. Lipide accumulatie in dit organisme kunnen worden onderzocht door kleefpoeders kleurstoffen of etiket-vrije methoden. Kleefpoeders vlekken zoals Nile rode en rode O olie zijn goedkope, betrouwbare manieren te kwantitatief meten van lipide niveaus en kwalitatief observeren lipide distributie in de weefsels, respectievelijk. Deze vlekken is bovendien voorzien van high-throughput screening van verschillende lipide metabolisme genen en trajecten. Bovendien hun hydrofobe natuur vergemakkelijkt lipide oplosbaarheid, interactie met de omringende weefsels vermindert en voorkomt dissociatie in het oplosmiddel. Al deze methoden effectief zijn in het onderzoeken van algemene vetgehalte, bieden ze geen gedetailleerde informatie over de chemische samenstelling en de diversiteit van lipide deposito's. Voor deze doeleinden, label-vrije methoden zoals microscopie van GC-MS en auto's zijn beter geschikt, hun kosten niettegenstaande.

SKN-1 is een bZip, cytoprotective transcriptiefactor dat homologie deelt met zoogdieren NRF2 en oxidatie van de vetzuren is gebleken. Afhankelijk van de concentratie van glucose in hun dieet Toon worms met een constitutively geactiveerd skn-1 allel verschillende lipidengehalte wanneer gekleurd met Nile rood7. Figuur 1A -C toont geactiveerd skn-1 dieren onderhevig zijn aan invloeden die leiden tot een ...

Nile rode kleuring van vaste Caenorhabditis elegans is een methode voor kwantitatieve meting van neutrale lipide deposito's, terwijl kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over weefsels olie rood O kleuring vergemakkelijkt.

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Het algemene doel van deze kleurmethoden is om de intracellulaire lipidenaanwezigheid te kwantificeren en de lipidenverdeling tussen verschillende weefsels te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het lipidenmetabolisme, zoals hoe lipiden genetisch en biochemisch worden gereguleerd en welke ziektetoestanden de lipidenhomeostase reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig en goedkoop is om uit te voeren.Om Nile Red lipidenkleuring uit te voeren, plaats wormen op Nematode Growth Medium of NGM gezaaid met late log OP50 E.coli en laat de wormen groeien bij 20 graden Celsius tot de vroege L4-fase. Was de wormen met een millimeter PBST-oplossing en breng de wormensuspensie over naar een 1,5 milliliter microfugebuis. Centrifugeer de wormen bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut.Verwijder vervolgens het supernatant en herhaal de PBST-wash totdat de E.coli uit de suspensie is verdwenen. Voeg vervolgens aan de wormenpellet 100 microliter 40% isopropanol of 60% voor ORO-kleuring toe en incubeer het monster gedurende drie minuten op kamertemperatuur. De toevoeging van isopropanol is cruciaal voor de juiste permeabilisatie van de wormen vóór het kleuren.Centrifugeer de wormen bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut en verwijder het supernatant zonder de wormenpellet te verstoren. Het is belangrijk om lichtblootstelling tijdens de centrifugeringsstappen tot een minimum te beperken. Voeg nu, terwijl in het donker, 600 microliter van de eerder bereide NR-werkoplossing toe aan elk monster.Keer de buisjes drie keer om en meng de wormen en de oplossing volledig. Bewaar vervolgens het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Na incubatie, centrifugeer de wormen en verwijder het supernatant.Voeg vervolgens 600 microliter PBST toe en bewaar de monsters in het donker gedurende 30 minuten om de overtollige NR-kleurstof te verwijderen. Na het opnieuw draaien van de monsters zoals eerder, verwijder al het overtollige behalve ongeveer 50 microliter supernatant en suspendeer de wormenpellet in de resterende oplossing. Om dia's voor beeldvorming voor te bereiden, pipet 5 microliter wormensuspensie op een microscoopglaasje en breng voorzichtig een dekglas aan om luchtbellen te voorkomen.Gebruik de FITC GFP-kanaal om NR-gekleurde wormen te beeld en probeer verschillende belichtingstijden, beeld de wormen af bij vijfvoudige vergroting om verschillende dieren per gezichtsveld te vangen. Schakel vervolgens over naar tienvoudige vergroting voor een betere kwantificering van individuele wormen. Om de afbeeldingen te kwantificeren, upload de micrografieën naar ImageJ.In het afbeeldingsmenu, pas de helderheid en het contrast van het afbeeldingsdek aan en breng wijzigingen door op alle afbeeldingen door op toepassen te klikken. Gebruik het polygoonselectiegereedschap om elke afgebeelde worm af te bakenen en gebruik onder het analysemenu de meetfunctie om de fluorescentie-intensiteit die door NR wordt uitgezonden te kwalificeren. Meet voor elke afbeelding vijf achtergrondlocaties en bereken de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit. Voeg 600 microliter Oil Red O of ORO-werkoplossing toe aan elk monster en draai de buis drie keer om om de wormen goed en de ORO te mengen.Roteer de monsters bij 30 RPM en RT gedurende twee uur. Centrifugeer de monsters bij 560 maal de zwaartekracht gedurende één minuut en zuig al het supernatant op, behalve 100 microliter. Gebruik vervolgens 600 microliter PBST om de monsters te resuspenderen en draai de buisjes gedurende 30 minuten bij 30 RPM om overtollige ORO-kleuring te verwijderen.Om de locatie van de geslachtslijn van de dieren in de darmcellen beter te onderscheiden, kleurt u de kernen door een microliter DAPI toe te voegen voor elke milliliter ORO-werkoplossing. Om dia's voor beeldvorming voor te bereiden, resuspendeer de wormen en het resterende supernatant en meng de oplossing goed. Breng vijf microliter wormensuspensie op een microscoopglaasje en breng voorzichtig een dekglas aan om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ontstaan.Gebruik voor het beeld van de ORO-gekleurde wormen een kleurcapaciteit camera bij vijfvoudige vergroting om verschillende wormen in één gezichtsveld af te beelden. Schakel vervolgens over naar tienvoudige vergroting voor een betere onderzoek van individuele wormen. Categoriseer ten slotte de afbeeldingen volgens de lipideaccumulatie in het hele lichaam van het dier of in specifieke weefsels na het uploaden van de afbeeldingen naar ImageJ en het maken van een afbeeldingsdek volgens het tekstprotocol.SKN-1 vertoont homologie met zoogdier Nrf2 en is aangetoond dat het vetzuuroxidatie mediëren. Deze figuur toont geactiveerde SKN-1-dieren die worden blootgesteld aan omstandigheden die leiden tot toenemende lipideniveaus. Zoals te zien in deze afbeeldingen, is de NR-fluorescentie die met behulp van het FITC GFP-kanaal wordt vastgelegd, prominent langs de darm, maar is het dimmer in het hoofd, de staart en het darmlumen.Hoewel het gemakkelijk is om de wormen te categoriseren op basis van de aanwezigheid of afwezigheid van leeftijdsafhankelijke somatische afbraak van vet of ASDF, kan het moeilijk zijn om dieren met een gemiddelde vetverlies te identificeren. In vergelijking met niet-ASDF-dieren, die helderrode kleuring over het hele lichaam vertonen met weinig doorschijnende gebieden, vertonen ASDF-wormen merkbare vetafbraak in darmcellen. Dieren in het proces van het ontwikkelen van ASDF vertonen vaak doorschijnende vlekken waar de meeste vetverliezen uiteindelijk optreden.Bovendien kunnen ASDF-wormen nog steeds helderrode kleuring in de hoofd- en staartregio's vertonen omdat het fenotype niet wordt gedefinieerd door volledige somatische vetverlies, maar door uitgebreide vetafbraak ten opzichte van niet-geïrriteerde dieren. E

quantification-lipid-abundance-evaluation-lipid-distribution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video beschrijft een protocol om lipiden in hele, vaste wormen te bevlekken met behulp van Nile Red-kleurstof.  Om specifiek de neutrale lipiden in de kern van lipidedruppels te bekijken, beeldt u de groene emissiespectra van de bevlekte C. elegans in.

Nijlrode kleuring van C. elegans: een methode om lipidedruppels bij vaste dieren te visualiseren

This video demonstrates a protocol for detecting and quantifying neutral lipids in algal cells by staining them with Nile red dye.

Nile Red Staining: A Technique to Detect and Quantify Intracellular Neutral Lipids in Algae

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Gepresenteerd hier zijn gedetailleerde methoden voor de dissectie en lipide druppel kleuring van oenocyten in Drosophila larven met behulp van bodipy 493/503, een lipide druppel-specifieke fluorescerende kleurstof.

Dissectie en lipide druppel kleuring van Oenocyten in Drosophila larven

Gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie maakt selectieve, labelvrije beeldvorming van specifieke chemische moieties mogelijk en het is effectief gebruikt om lipidemoleculen in vivo in beeld te brengen. Hier geven we een korte inleiding tot het principe van SRS-microscopie en beschrijven we methoden voor het gebruik ervan bij de opslag van beeldvormende lipiden in Caenorhabditis elegans.

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Het huidige protocol beschrijft lipidensuppletiemethoden in vloeibare en on-plate culturen voor Caenorhabditis elegans, in combinatie met longitudinale studies en gentranscriptionele analyse van bulk of een paar wormen en wormweefsels.

Lipidensuppletie voor een lange levensduur en gentranscriptionele analyse bij Caenorhabditis elegans

Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.

Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

Degeneratieve oogziekten die de retinale pigmentepitheellaag van het oog aantasten, hebben een monogene en polygene oorsprong. Verschillende ziektemodellen en een softwaretoepassing, LipidUNet, zijn ontwikkeld om ziektemechanismen te bestuderen, evenals mogelijke therapeutische interventies.

LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel

Lipofagie is een selectieve vorm van autofagie waarbij lipidedruppeltjes worden afgebroken. Disfuncties in dit proces worden in verband gebracht met de ontwikkeling van kanker. De precieze mechanismen zijn echter nog niet volledig begrepen. Dit protocol beschrijft kwantitatieve beeldvormingsbenaderingen om de wisselwerking tussen autofagie, lipidenmetabolisme en kankerprogressie beter te begrijpen.

Onderzoek naar de regulatie van katabolisme van lipidendruppels door middel van lipofagie

Hier geven we instructies voor het effectief gebruik van SegElegans, een deep learning-systeem dat we hebben ontwikkeld voor de geautomatiseerde segmentatie van individuele wormen in breedveldmicroscopiebeelden, voor later gebruik in beeldanalysesoftware zoals ImageJ. We bieden manieren om het systeem zowel online als offline te gebruiken.

Geautomatiseerde analyse van C. elegans fluorescentiebeelden met behulp van SegElegans

Leer hoe u lipiden kwantificeert en de verdeling ervan evalueert in Caenorhabditis elegans met Nile red en Oil Red O kleuring. Deze eenvoudige methode biedt inzicht in lipidenmetabolisme en homeostase.

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring (Video) | JoVE Journal

Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Meer video's verkennen