Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen
21 maart 2018
Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.
Het algemene doel van deze methodologie is om het navigatiegedrag van Drosophila-larven te analyseren als reactie op gelijktijdige optogenetische stimulatie van zijn reukneuronen. Deze methode maakt de uitgebreide dissectie van de functie van het reukcircuit mogelijk en complementeert studies over hoe de functie van het reukcircuit zich vertaalt in gedragsreacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de specificiteit en temporele controle door het gebruik van licht in plaats van traditionele geurgradienten om individuele reukneuronen te activeren.
Om het experiment te beginnen, bouw een gedragsarena zonder licht. Bouw een doos van 89 bij 61 bij 66 centimeter, gemaakt van zwart plexiglas van drie millimeter dik. Plaats de doos op een tafelblad in de gedragskamer.
Monteer vervolgens een monochrome USB 3.0 CCD-camera voorzien van een IR Longpass 830 nanometer filter en een acht millimeter F1.4 C-mount lens op het midden van het plafond van de zwarte doos. Plaats twee infrarood LED-strips op het tafelblad om de larven in de donkere arena te verlichten. Haal vervolgens een 22 centimeter bij 22 centimeter vierkante aluminium plaat om het LED-platform te bouwen.
Gebruik in het midden van de plaat een metaalsnijder om een gat te snijden dat groot genoeg is om rond de CCD-camera te passen. Bedek de metalen plaat met rode LED-strips. Soldeer de LED-lichtstripdraden in serie en leid de stripdraden door een optocoupler-relais bestuurd door een Raspberry Pi 2B microprocessor.
Monteer vervolgens het LED-platform rond de CCD-camera. Installeer en configureer vervolgens een Ubuntu MATE Raspbian Jessie Linux-gebaseerd besturingssysteem op de Raspberry Pi-processor voordat u het optocoupler-relais aansluit op de LED-strips. Sluit een voeding aan om de LED-strips en de optocoupler van stroom te voorzien.
Zorg voor een homogene stralingsintensiteit op verschillende punten rond de CCD-camera in de gedragsarena. Zorg voor de absolute stralingsintensiteit op het oppervlak van de arena met behulp van een spectrometer en bepaal deze tot ongeveer 1,3 watt per vierkante meter over het hele oppervlak van de arena. Houd de vliegen op standaard vliegvoer bij 25 graden Celsius, 50 tot 60% relatieve luchtvochtigheid in een 12-uur, 12-uur licht/donker cyclus.
Om CsChrimson in een enkele set ORN's tot expressie te brengen, kruist u de maagdelijke vrouwtjes van een UAS-IVS-CsChrimson lijn met mannetjes van een ORX-GAL4 lijn. Nadat mannelijke en vrouwelijke vliegen in een kruising 48 uur hebben gemat, eieren hebben gelegd en gedurende 48 uur zijn gelegd, verplaatst u de volwassenen naar een nieuwe fles. Voeg op het oppervlak van de voedselfles met eieren 400 microliter van een mengsel toe dat 400 micromolar all-trans-retinaal, of ATR, opgelost in dimethylsulfoxide, of DMSO, bevat in 89 millimolair sucrose opgelost in gedistilleerd water.
Zodra ATR is toegevoegd aan de voedselflessen met eieren, incubeer de flessen in het donker gedurende nog eens 72 uur. Na incubatie, extraheert u de derde instar larven van het oppervlak van het vliegvoer door ze te laten drijven met een hoog-dichtheids 15% sucrose oplossing. Gebruik een P1000 micropipet om de larven die op het oppervlak van de sucroseoplossing drijven te scheiden in een 1.000 milliliter glazen beker.
Was de larven vier keer door 800 milliliter vers gedistilleerd water in de glazen beker te vervangen elke keer. Laat de larven na de laatste wasbeurt 10 minuten rusten voordat u ze onderwerpt aan de gedragstest. Houd voor de gedragstest een consistente temperatuur en luchtvochtigheid in de gedragskamer.
Bereid het kruipmedium voor larven door 150 milliliter gesmolten 1,5% agarose in een 22 centimeter bij 22 centimeter vierkante petrischaal te gieten. Laat de agarose een tot twee uur in de petrischalen stollen en afkoelen voordat u ze gebruikt in de gedragstest. Nadat de agarose is gestold, brengt u niet meer dan 20 van de voorbereide derde instar larven over naar het midden van de petrischaal en bedekt u de petrischaal met het deksel.
Plaats de petrischaal in de gedragsarena onder de CCD-camera. Schakel de 850 nanometer infrarood LED-lichtbron in om larven in de video te visualiseren. Start de CCD-camera om larvebeweging op te nemen.
Ga ten slotte door naar gegevensverwerking en analyse. Wanneer ORN 7a dat CsChrimson tot expressie brengt, werd gestimuleerd door licht, was er een significante afname in looplengte in vergelijking met controledieren. Omgekeerd, wanneer ORN 42a dat CsChrimson tot expressie brengt, werd gestimuleerd door licht, was er een significante toename in looplengte in vergelijking met controledieren.
We ontdekten dat voor ORN 42a, verschillende tijdelijke patronen van lichtstimulatie verschillende gedragsreacties opwekten. Hoewel we deze methode hebben aangetoond voor de eerste orde olfactorische receptorneuronen, staat onze methode ook een verscheidenheid aan toekomstige toepassingen toe, zoals het meten van de impact van downstream neuronen zoals projectieneuronen en lokale neuronen op het gedrag van larven. We verwachten dat deze techniek de weg zal effenen voor een uitgebreide dissectie van de functie van het olfactorische circuit van larven.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol analyseert het navigatiegedrag van Drosophila-larven als reactie op gelijktijdige optogenetische stimulatie van de olfactorische neuronen. Er wordt gebruikgemaakt van licht met een golflengte van 630 nm om specifieke olfactorische neuronen die een red-shifted channel rhodopsine tot expressie brengen te activeren, wat gedetailleerde studies naar de functie van olfactorische circuits en gedragsresponsen mogelijk maakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Gedragsneurowetenschap
- Optogenetica
- Drosophila-genetica
Achtergrond
- Deze methodologie maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe de functie van het olfactorische circuit correleert met gedragsresponsen.
- Het biedt temporele controle over de activatie door gebruik te maken van licht in plaats van traditionele geurgradiënten.
- De aanpak vergemakkelijkt het onderzoek naar specifieke neuronen in het olfactorische systeem van Drosophila.
Doel van de studie
- Om de functie van olfactorische circuits met precisie te ontleden.
- Om larvale gedragsreacties op gerichte neuronale stimulatie te observeren.
- Om inzicht te verschaffen in hoe individuele olfactorische neuronen navigatiekeuzes beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van een op maat ontworpen gedragsarena voor de analyse van larvale beweging.
- Drosophila-larven die CsChrimson tot expressie brengen in olfactorische receptorneuronen (ORN's) werden gestimuleerd met licht.
- De gedragstest omvat de bereiding van een agarose-kruipmedium en video-opnamen van larvale bewegingen.
- Belangrijke stappen omvatten het construeren van de arena, het monteren van de apparatuur en het voorbereiden van larven onder specifieke condities.
Belangrijkste resultaten
- Lichtstimulatie van specifieke reukreceptorneuronen leidde tot significante variaties in de loopafstand van de larven, wat wijst op verschillende gedragsreacties.
- Verschillende temporele stimulatiepatronen riepen uiteenlopende effecten op het navigatiegedrag op.
- Deze methode is bij uitstek geschikt om toekomstig onderzoek naar de neuronale effecten stroomafwaarts op het larvengedrag te faciliteren.
Conclusies
- De studie illustreert een nieuwe aanpak om reukcircuits en hun gedragsmatige implicaties te analyseren.
- Het stelt onderzoekers in staat om de specifieke rollen van gerichte neuronen te onderzoeken in de context van een levend organisme.
- Deze bevindingen verbeteren ons begrip van neuronale mechanismen bij sensorische verwerking en gedrag.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze methode maakt een nauwkeurige dissectie van de functie van het olfactorische circuit mogelijk door geurstimuli te vervangen door optogenetische controle, waarmee een cruciale uitdaging bij targetvalidatie wordt aangepakt waarbij gedragsmatige read-outs gekoppeld moeten worden aan specifieke neuronale activiteit. Het ondersteunt mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase door de bijdrage van individuele olfactorische receptorneuronen aan het navigatiegedrag te isoleren, wat het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets verbetert. Deze aanpak versterkt de translationele continuïteit van het moleculaire target naar het fenotype op circuitniveau, wat relevant is voor het verminderen van risico's bij targets in discovery-programma's gericht op neurowetenschappen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door specifieke activatie van reukneuronen te koppelen aan gedefinieerde gedragsmatige uitkomsten.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele validatie van neuronale targets met behulp van lichtgebaseerde stimulatie.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door geïsoleerde manipulatie van individuele ORN's om hun rol in het navigatiegedrag van larven te verduidelijken.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve gedragsmatige uitlezingen (bijv. veranderingen in loopafstand) die een gestandaardiseerde beoordeling van de effecten van neuronale modulatie mogelijk maken.
- Operationele waarde: Vestigt een schaalbaar assayplatform voor het screenen van genetische of farmacologische modulatoren van de functie van het olfactorische circuit.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de standaardisatie van de assay door de vluchtigheid van geurstoffen en variabiliteit in de toediening te elimineren via optogenetische stimulatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante systeemmodellering door de dissectie van de vertaling van sensoriek naar gedrag mogelijk te maken in een genetisch hanteerbaar organisme.
- Operationele waarde: Biedt een preklinisch compatibele workflow voor het evalueren van de effecten van neuronale targets op het gedrag voorafgaand aan validatie in zoogdieren.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door te verduidelijken hoe upstream neuronale activiteit vertaald wordt naar downstream gedragsfenotypen.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces, waarbij targetvalidatie wordt ondersteund via gedragsfenotypering en lead-identificatie wordt gefaciliteerd door neuronale targets te verduidelijken die meetbare outputs aansturen.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk van de functie van individuele reukneuronen bij het aansturen van het navigatiegedrag van larven.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare gedragsmetrieken (loopafstand) die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen of genetische modulatoren.
- Analytics: Biedt traceerbare gedragsuitkomsten en statistische vergelijkingen tussen gestimuleerde en controlecondities.
- Translational Research: Verbindt neuronale circuitactiviteit aan gedragsreacties, wat extrapolatie naar modellen van hogere orde ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor systematische ondervraging van neuronale targets in reuk- en andere sensorische circuits.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door ambiguïteit bij het koppelen van neuronale activatie aan gedragsuitkomsten te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie doordat optogenetische controle variabele geurstimuli vervangt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door duidelijkere mechanistische verbanden te bieden tussen targets en gedragstypes.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde gedragsimpact in een discovery-relevant systeem.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, optogenetica en het ontwerp van gedragsassays.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een gedragsarena, IR-verlichting, een CCD-camera en een Raspberry Pi-gebaseerde stimulatiecontrole.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de preparatie van larven, de bereiding van het agarose-medium en videotracking-protocollen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij uitbreiding naar verschillende neurontypen (bijv. projectieneuronen, lokale neuronen) of ontwikkelingsstadia.
- Beperkt door de noodzaak van genetische toegankelijkheid en retinale voeding in het modelsysteem, wat de schaalbaarheid naar niet-Drosophila-systemen kan beperken.
