Bouw van de Thioether/Vinyl Sulfide-aangebonden Helical peptiden Via foto-geïnduceerde Thiol-Ono/yne Hydrothiolation

Deze methoden vereenvoudigen de generatie van thioether-getetherde cyclische peptiden door het gebruik van de thio-een of thio-yne klikchemie die superieure functionele groepentolerantie en goede opbrengst bezit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een thioether-verbinding een traceloze modificatieplaats biedt, wat de chemische ruimte van stabiele peptiden na peptidesynthesemodificatie aanzienlijk uitbreidt. Om de procedure te beginnen, bevestigt u een kolom gevuld met 50 milligram Rink Amide MBHA-hars aan zowel een tafelvacuümmanifold als een stikstof- of argongasleiding via een driewegstopkraan.

Voeg een tot twee milliliter dichloromethaan toe aan het beddenras van de hars en zwel de hars op door de mixtuur gedurende 10 minuten zachtjes te agiteren met een stroom van inerte gasbellen. Giet de hars af met een rubberen pijpettenkolf als u klaar bent. Voeg vervolgens een tot twee milliliter N-terminaal Fmoc deprotectieoplossing toe aan de hars.

Agiteer de mixtuur voorzichtig door 10 minuten met inerte gas te bebellen en giet de hars vervolgens af met een rubberen pijpettenkolf. Was de kolom op dezelfde manier met een tot twee milliliter DMF, gevolgd door een tot twee milliliter DCM. Herhaal de deprotectiesequentie eenmaal.

Combineer vervolgens 0,125 millimolen van een Fmoc-beschermde aminozuur en 50,5 milligram HCTU met 0,5 milliliter DMF in een polypropyleen container. Schud de mixtuur gedurende een minuut om de vaste stoffen op te lossen. Voeg vervolgens 43,5 microliter DIPEA toe en schud de container nog een minuut om een 0,25-molare geactiveerde aminozuuroplossing te verkrijgen.

Voeg deze oplossing toe aan de gewassen hars en laat inerte gas gedurende één tot twee uur door de mixtuur bebellen. Deprotect vervolgens en was de gebonden aminozuurresidu. Ga op deze manier door met het koppelen van aminozuren aan de peptideketen om het lineaire peptide te vormen.

Gebruik vaste fase peptidesynthese om hars te bereiden die een lineair peptide ondersteunt dat een trityl-beschermde cysteïneresidu bevat, gescheiden door drie eenheden van een mono-S-vijf-residu. Voeg een tot twee milliliter trityldeprotectieoplossing toe aan 50 milligram van de peptidedragende hars. Laat stikstofgas gedurende 10 minuten door de mixtuur bebellen.

Giet de deprotectieoplossing af en was de hars drie keer met porties van één tot twee milliliter DCM. Herhaal de deprotectieprocedure zes keer of tot de oplossing niet langer geel lijkt om de cysteïne volledig te deprotecteren. Volledige deprotectie van de Trt-groep van cysteïne is erg belangrijk voor de volgende fotoreactiestap.

Was de hars met porties van één tot twee milliliter DMF en DCM in volgorde. Week de hars vervolgens in één tot twee milliliter methanol gedurende twee minuten om de hars te krimpen. Giet de methanol af en droog de hars gedurende vijf minuten met stikstofgas.

Breng de droge hars over naar een 10-milliliter ronde bodemkolf via weegpapier. Suspendeer de hars in twee milliliter DMF die met stikstof is doorweekt. Voeg vervolgens 5,6 milligram MMP en 38 milligram MAP toe als foto-initiators.

Plaats een roerbare in de kolf en sluit de kolf af met een rubberen septum. Spuit de atmosfeer van de kolf drie keer met stikstofgas, voor een totale spuittijd van ongeveer vijf minuten. Bevestig de reactiekolf in een fotoreactor uitgerust met UVA-lampen, een inerte stikstofgasinlaat en een roerplaat.

Begin met het roeren van de mixtuur en sluit de fotoreactor. Spuit de fotoreactor gedurende 10 minuten met argon. Zet vervolgens de argonstroomsnelheid op één liter per minuut en bestraal de mixtuur gedurende één uur bij kamertemperatuur met UVA-licht.

Monitor de reactie met HPLC. Was, scheid en zuiver het cyclische peptide als u klaar bent. Bereid 50 milligram hars voor die een lineair peptide draagt dat een gamma-gesubstitueerde mono-S-vijf-residu bevat.

Was de hars achtereenvolgens met DMF en DCM. Krimp de hars met methanol en droog deze met stikstofgas. Suspendeer vervolgens de hars in een 10-milliliter ronde bodemkolf in twee milliliter DMF dat met stikstof is doorweekt.

Voeg aan de mixtuur 5,6 milligram MMP, 3,8 milligram MAP en 25,7 milligram Fmoc-beschermd cysteïne toe. Voeg een roerbare toe aan de kolf, sluit deze af met een rubberen septum en spoel de atmosfeer van de kolf af met stikstofgas. Bestraal vervolgens de mixtuur met UVA-licht in een met inerte stikstofgas gevulde fotoreactor terwijl u roert bij kamertemperatuur gedurende één tot twee uur.

Monitor de reactie met LC-MS. Als de fotoreactie voltooid is, was het gebonden peptide en voer de macrolactamisatiereactie uit. Koppel vervolgens aminozuren aan het cyclische peptide om de gewenste structuur te vormen.

Scheid en zuiver het peptide als u klaar bent. Bereid 50 milligram hars voor die een lineair peptide draagt dat een residu bevat met een terminaal alkyn gescheiden door drie eenheden van een residu met een terminaal thiol. Scheid het peptide van de hars en precipiteer het met één milliliter koude di-ethylether.

Centrifugeer de peptidemixtuur gedurende twee minuten bij 12.000 keer g. Giet voorzichtig het supernatant af en voeg nog een milliliter koude di-ethylether toe. Herhaal het wassen nog twee keer en droog vervolgens het peptideresidu onder vacuüm.

Los het residu op in 50 milliliter DMF dat met stikstof is doorweekt in een ronde bodemkolf. Voeg 3,2 milligram DMPA toe aan de peptideoplossing en bebel het reactiemengsel gedurende 10 minuten met stikstof. Een inerte atmosfeer is strikt vereist voor een effectieve thio-yne fotoreactie in een oplossingsfase.

Anderswaarts hebben we oxidatie van zwavel waargenomen tijdens UV-bestraling. Bestraal vervolgens de mixtuur met UVA-licht zonder roeren in een met inerte stikstofgas ge