Name: Micromanipulation van chromosomen in Insect spermatocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer micromanipulatie van chromosomen in levende insectenspermatocyten met behulp van een piezo-elektrische micromanipulator. Deze niet-dodelijke techniek maakt het mogelijk om spanning toe te passen op chromosomen en hun gedrag tijdens meiose te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jessica Hall voor haar waardevolle discussie.

1. bereiding van de cultuur van de cel van de primaire Insect Spermatocyte Micromanipulation
<ol><li>Prepareren van objectglaasjes<ol>
<li>Het verkrijgen van een glasplaatje 75 x 25 mm met een 20 mm diameter ronde gat in het midden van de dia uitgesneden. Opmerking: Deze werden gesneden uit een vel van vensterglas tot de grootte van een glasplaatje met een gat in het midden.</li>
		<li>Een 25 mm x 25 mm #1.5 dekglaasje aan doorlopen een vlam Bunsenbrander voor 2 s.</li>
		<li>Vacuüm vet rond de rand van het gat in het glasplaatje toepassen</li>
		<li>Plaats het dekglaasje aan op het gat zoals in Figuur 1. Druk op het en zorg ervoor om te vormen van een goede afdichting.</li>
		<li>Spiegelen het glasplaatje en vul de dissectie goed met halonen olie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spermatocyte cultuur voorbereiding voor weergave op Microscoop Opmerking: Hier, beschrijven we de cultuur-voorbereiding methode cuvetten van de sprinkhaan of cricket. Teelballen inhoud van andere geleedpotigen kunnen worden gekweekt met behulp van een soortgelijke methode.<ol>
<li>Verkrijgen subadult mannelijke krekels (of sprinkhanen). Plaats een levende insecten in een koelkast voor ongeveer 2 min aan het koude-anesthetize. Met behulp van ontleden schaar, snel snijden door het dorsale oppervlak evenwijdig aan de lengteas van de buik direct achter de knoppen van de vleugel. Handmatig knijp de buik zachtjes te duwen de teelballen door middel van de cut in het exoskelet (Figuur 2).</li>
		<li>Plaats de geïsoleerde teelballen met pincet in een putje met halonen olie dissectie.</li>
		<li>Indien nodig, de testikels onder een ontleden Microscoop bekijken. Ze opsplitsen in kleinere stukken met behulp van fine-puntige pincet, die betrekking hebben op de teelballen, vet verwijderen en gebruik schone-puntige pincet te breken van de teelballen (figuur 3A en 3B). Verspreid de teelballen inhoud onder de olie, op het oppervlak van het dekglaasje aan (Figuur 3 c).</li>
		<li>Verspreid de teelballen inhoud totdat het gedeelte van de verspreiding van de testis nauwelijks merkbaar aan de ogen (Figuur 3 c is). Gebruik extra olie-geladen dissociatie wells indien nodig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. micromanipulation
<ol><li>Productie van de microneedle<ol>
<li>Plaats een uiteinde van een (0,85 mm buitendiameter, 0,65 mm binnendiameter) glazen buis in de vlam van een brander van Bunsen. Trek het einde van de glazen buis op zodanige wijze dat een hoek van 150° is gevormd, en een uitgebreide gebied van smalle glazen buis is gemaakt. De buis breken de dunne regio, zodat de dunne regio die zich uitstrekt van de hoek ongeveer 10 mm lang (figuur 4A is).</li>
		<li>Met behulp van een microforge (op maat volgens Powell27 of commercieel beschikbaar-Zie Tabel of Materials), raak het uiteinde van de naald van de glazen met de hete platina-draad te smelten het glas op het puntje. Vorm een hoek van ongeveer 45° tussen de naald en de platina-draad van de microforge (figuur 4B). Trek het glas uit de buurt van de hete draad, terwijl de gaskraan van de hitte op de draad, vorming van een dunne tip van ≤1.5 mm aan het einde van de naald van glas. Opmerking: De tip diameter is moeilijk te meten, maar een tip van deze lengte is waarschijnlijk tot een sterke maar flexibele naald, die geschikt is voor micromanipulation. Als alternatief, een micropipet trekker kan worden gebruikt om het maken van glazen buizen met een diameter van de juiste tip (de experimentator zal hebben om te testen verschillende trekken recepten voor de productie van een adequaat sterke maar flexibele microneedle voor het werk). De naald kan worden geplaatst in een houder die op dezelfde manier is vormgegeven om de naald van de manipulatie gemaakt volgens de hierboven beschreven methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Positionering van de micromanipulator<ol>
<li>Plaats de voorbereide dia in het werkgebied van een omgekeerde, fase contrast Microscoop. De scheidingslijn cellen zoeken en hen te centreren in het gezichtsveld. Focus op de cellen met de laagste vergroting mogelijk. Opmerking: We gebruikt een 16 X fase contrast doelstelling.</li>
		<li>Plaats de microneedle in de houder van de naald op de micromanipulator.</li>
		<li>Handmatig de microneedle in het licht pad van de Microscoop plaats, zodat het uiteinde van de naald wordt verlicht door het licht (figuur 5B).</li>
		<li>Het concentreren van de Microscoop verscheidene focal vliegtuigen boven het vlak waarin de cellen liggen.</li>
		<li>Verplaats de microneedle met behulp van de joystick controller op een lage gevoeligheid meerdere malen te vinden van de schaduw van de naald in de X- en Y-axes. Blijven passen de positie totdat de positie van de tip zichtbaar is. Pas de positie van de naald langs de z-as totdat de punt van de naald in focus is.</li>
		<li>Richten op de cellen, dan richten de Microscoop boven het steunvlak van de cel, zodat de cellen zijn enkel onscherp en onzichtbaar. De positie van de naald passen zodat haar tip in focus in deze brandvlak is.</li>
		<li>De vergroting van de Microscoop naar wens aanpassen. Opmerking: We gebruikt een 100 X 1.4 numerieke diafragma (nvt) fase contrast doelstelling voor de micromanipulation.</li>
		<li>Na zich te concentreren op de cellen die het streven naar hogere-vergroting, weer concentreren de Microscoop boven de cel vlak zodat de cellen enkel onscherp en onzichtbaar zijn. Met behulp van een hogere gevoeligheidsinstelling, passen de positie van de naald, zodat het uiteinde in beeld is en gecentreerd in het brandvlak boven het vlak waarin de cellen liggen.</li>
		<li>Richten op de cellen, het aanpassen van hun positie, zodat ze in het midden van het gezichtsveld blijven. De naald is nu klaar voor de micromanipulation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micromanipulation van chromosomen<ol>
<li>Met behulp van dezelfde gevoeligheidsinstelling voor de fijne positionering bij een hoge vergroting, gebruik de joystick om te controleren de microneedle en de chromosomen duwen rond in de cel. Houd het uiteinde van de naald boven het steunvlak van de cellen.</li>
		<li>Voor het trekken op of verplaatsen van een chromosoom, concentreren op een chromosoom in de buurt van de bovenkant van de cel. Opmerking: Deze chromosomen zijn makkelijker te manipuleren-manipuleren chromosomen dicht bij dat het dekglaasje aan maakt het waarschijnlijk dat de naald in het dekglaasje aan, het uiteenspatten van de cel en beëindiging van het experiment zullen vermalen.</li>
		<li>Aanpassen van de z-as op de joystick om de naald tip in focus, en vervolgens zet de naald tip met de joystick in X en Y. plaats het uiteinde van de naald direct op het chromosoom te worden gemanipuleerd en duwen het in de gewenste richting om de manipulator naar repositi op het chromosoom.</li>
		<li>Afhankelijk van hoe ver het chromosoom is geduwd, spanning van toepassing op het chromosoom of voldoende spanning als u wilt loskoppelen van een chromosoom van het klosje van toepassing. Zodra een chromosoom is verwijderd van een spindel, plaatst u het overal binnen de cel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Chambers, R. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jez.1400230302">Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon.</a> Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).</li>
<li>Carlson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+studies+of+the+dividing+neuroblast+of+the+grasshopper%2C+Chortophaga+viridifasciata%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata.</a> Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).</li>
<li>Nicklas, R. B., Staehly, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+I.+The+mechanics+of+chromosome+attachment+to+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle.</a> Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+II.+Induced+reorientation+and+the+experimental+control+of+segregation+in+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis.</a> Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+3.+Spindle+fiber+tension+and+the+reorientation+of+mal-oriented+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).</li>
<li>Nicklas, R. B., Ward, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elements+of+error+correction+in+mitosis%3A+microtubule+capture%2C+release%2C+and+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension.</a> Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).</li>
<li>Li, X., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+forces+control+a+cell-cycle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint.</a> Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+force+produced+by+the+mitotic+spindle+in+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase.</a> Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+that+move+chromosomes+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The forces that move chromosomes in mitosis.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).</li>
<li>Nicklas, R. B., Koch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+micromanipulation.+IV.+Polarized+motions+within+the+spindle+and+models+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis.</a> Chromosoma. 39 (1), 1026(1972).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromosomes+and+centrosomes+on+spindle+assembly+as+observed+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells.</a> Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+cut+mitotic+spindles%3A+clean+cuts+and+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules.</a> Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes+initiate+spindle+assembly+upon+experimental+dissolution+of+the+nuclear+envelope+in+grasshopper+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).</li>
<li>Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+distribution%3A+experiments+on+cell+hybrids+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B%22%5BJournal%5D)">Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).</li>
<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reduction+of+chromosome+number+in+meiosis+is+determined+by+properties+built+into+the+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes.</a> Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).</li>
<li>Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2114567/">Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm.</a> Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).</li>
<li>Forer, A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+autosome+movements+and+of+sex-chromosome+movements+on+sex-chromosome+segregation+in+crane+fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes.</a> Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).</li>
<li>Camenzind, R., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+non-random+chromosome+segregation+in+spermatocytes+of+Gryllotalpa+hexadactyla.+A+micromanipulation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis.</a> Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).</li>
<li>Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-segregation+of+sex+chromosomes+in+the+male+black+widow+spider+Latrodectus+mactans+%28Araneae%2C+Theridiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae).</a> Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).</li>
<li>Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+the+amphitelically+attached+univalent+X+chromosome+in+the+spittlebug+Philaenus+spumarius%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius.</a> Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).</li>
<li>Golding, A. E., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotype%2C+sex+determination%2C+and+meiotic+chromosome+behavior+in+two+pholcid+%28Araneomorphae%2C+Pholcidae%29+spiders%3A+implications+for+karyotype+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution.</a> PLoS One. 6, e24748(2011).</li>
<li>Doan, R. N., Paliulis, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+reveals+an+XO-XX+sex+determining+system+in+the+orb-weaving+spider+Neoscona+arabesca+%28Walckenaer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hereditas%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer).</a> Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).</li>
<li>Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+chromosomes+reveals+that+cohesion+release+during+cell+division+is+gradual+and+does+not+require+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension.</a> Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biology+Micromanipulator.+DIY+High+Precision+Micromanipulator%22">Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu">http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu</a> (2018).</li>
<li>Ellis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Piezoelectric+micromanipulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Piezoelectric micromanipulators.</a> Science. 138 (3537), 84-91 (1962).</li>
<li>Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEllis%2C+GW+%22Mitosis%2FCytokinesis%22">Mitosis/Cytokinesis</a>. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).</li>
<li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microforge+attachment+for+the+biological+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal.+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">A microforge attachment for the biological microscope.</a> Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).</li>
<li>Alsop, G. B., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+continuously+dictate+distribution+of+actin+filaments+and+positioning+of+cell+cleavage+in+grasshopper+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes.</a> Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).</li>
<li>Zhang, D., Nicklas, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase%27+and+cytokinesis+in+the+absence+of+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes.</a> Nature. 382, 466-468 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met praktijk kan chromosomen bewegen in de cel tweede natuur geworden. Naalden die zowel voldoende stijf en voldoende dun-tipped zijn moeilijk om "de handigheid van" fabriceren, maar dit vermogen komt ook met de praktijk. Naalden die zo fijn dat ze vervormen wanneer verplaatst in de halonen-olie zijn bruikbaar niet voor het duwen van de chromosomen in de cel. Naalden die zo bot dat hun tips zichtbaar zijn en zo groot als 1/3 van de breedte van een chromosoom (of groter) zeer waarschijnlijk zijn te doden van de cel. De op...

Micromanipulation is gebleken dat delen van het mechanisme voor een chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen. De vroegste publicatie met een beschrijving van de resultaten van de experimenten van de micromanipulation werd door Robert Chambers1. Chambers gebruikt een mechanische micromanipulator met een bijgevoegde glas naald sonde het cytoplasma van een aantal verschillende soorten cellen. Helaas, contrast methoden waardoor de visualisatie van chromosomen en vele andere cellulaire componenten in levende cellen niet beschikbaar waren op het moment, dus Chambers experimenten niet laten van de gevolgen zien kon van dergelijke cellulaire componenten herpositionering. Vroege micromanipulations die de positie van het chromosoom veranderd gebruikt het apparaat Chambers te vegen van de midzone van de spindel in anafase cellen, waaruit blijkt dat dergelijke manipulaties als u de positie van chromosoom wapens in anafase sprinkhaan neuroblasten2 veranderen kunnen . Nicklas en zijn medewerkers waren de eersten die het uitvoeren van fijne micromanipulations van chromosomen, rekken van de chromosomen3, hen loskoppelen van de spindel en inducerende een heroriëntatie3,4, stabiliseren van een malorientation door de spanning op de chromosomen5,6,7toe te passen en het meten van de krachten die geproduceerd door spindels in anafase8,9. Ander werk door de Nicklas lab toonde dat cytoplasmatische korrels gemanipuleerde10 ook zou kunnen zijn en dat centrosomes kan worden verplaatst door micromanipulation11. Micromanipulation is niet alleen nuttig voor het verplaatsen van de chromosomen en de andere cellulaire componenten. Een naald micromanipulation netjes kan snijden door middel van een mitotische spindel in demembranated cellen12 of kan worden gebruikt voor het ontbinden van de nucleaire envelop13. Daarnaast kunnen aangrenzende cellen worden gesmolten door micromanipulation14,15.
Met dergelijke een breed scala aan interessante experimenten die kunnen worden gedaan met behulp van micromanipulation, het is op het eerste gezicht verrassend dat micromanipulation experimenten zijn gedaan door zeer weinig chromosoom biologen. Een van de redenen voor deze tekortkoming is dat de mitotically-delende gekweekte cellen die zijn afgeleid van gewervelde weefsels en worden vaak gebruikt voor het bestuderen van chromosoom bewegingen uiterst moeilijk te micromanipulate. Deze weefselkweek cellen hebben over het algemeen een corticale cytoskelet dat "krijgt in de manier" van de micromanipulation naald, en chromosomen of kunnen niet worden bereikt door de naald of de naald via de cel maalt, wat leidt tot een breuk van de cel en de dood. Wij, en andere onderzoekers die gebruik maken van micromanipulation, hebben gevonden geleedpotigen cellen worden vatbaar voor micromanipulation. Geleedpotigen spermatocyten worden gemakkelijk verspreid onder een laag van halonen olie en lijken te hebben een veel minder robuuste corticale cytoskelet ten grondslag liggen aan de celmembraan tijdens een celdeling. Dus, geleedpotigen teelballen bieden een goede bron van meiotically-delende cellen (spermatocyten) en mitotically-delende cellen (testis) met gemakkelijk toegankelijke chromosomen voor micromanipulation. Een seriële segmenteren van een sprinkhaan-spermatocyte vaste tijdens een manipulatie geopenbaard dat de naald nooit de celmembraan doordringt; de celmembraan vervormt rond de naald (Nicklas R.B., persoonlijke mededeling). Spermatocyten uit een aantal insecten en spinnen taxa geweest micromanipulated met succes, met inbegrip van sprinkhanen, biddende mantids fruitvliegjes, crane vliegen, krekels, spittlebugs, motten, zwarte weduwe spinnen, kelder spinnen en orb-weven spinnen 3,7,17,18,19,20,21,22. Gekweekte, mitotically-delende cellen van insecten kunnen micromanipulated. Bijvoorbeeld, hebben de chromosomen in de sprinkhaan neuroblasten in een primaire cultuur chromosomen die gemakkelijk micromanipulated2,23 kunnen. We vermoeden dat de beschikbare lijnen afgeleid van Drosophila gekweekte en andere insecten ook micromanipulatable zullen, maar we niet de techniek met deze cellen getest hebben. Zullen we laten zien hoe delen van cellen van sprinkhanen en krekels kan worden voorbereid voor een micromanipulation. Krekels zijn eenvoudig te verkrijgen van de meeste dierenwinkels op elk moment van het jaar. Sprinkhanen zijn alleen gemakkelijk verkrijgbaar is in de zomer, tenzij de onderzoeker toegang tot een laboratorium kolonie heeft, maar de soorten gebruikt (Melanoplus sanguinipes) gemakkelijk cellen en lang, gemakkelijk-aan-manipuleren chromosomen afgevlakt is.
Een andere reden waarom micromanipulation experimenten zijn gedaan door een klein handvol biologen is dat micromanipulators die goed bewegen van chromosomen zelden beschikbaar in de markt zijn. We hebben ontdekt dat een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator de beweging van de naald met geen trillingen, drift, of lag tussen de joystick en de beweging van de naald bestuurt, maar andere soorten manipulatoren ook met succes chromosomen duwen kunnen rond in de cel. De micromanipulators ontworpen door Ellis en Begg25,26 zijn ideaal voor de micromanipulation van de chromosomen, hoewel ze gebruik van oudere technologie. Piëzo-elektrische micromanipulators zijn momenteel beschikbaar en gebruikte in de elektrofysiologie; Deze micromanipulators zijn echter niet typisch joystick-gecontroleerde. Joystick-controle is de sleutel tot de vloeiende bewegingen die nodig zijn voor een succesvolle micromanipulation, en zo een aangepaste joystick te maken van de momenteel beschikbare piëzo-elektrische micromanipulators werken voor een chromosoom micromanipulation moet worden gebouwd. De joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulators die het beste werken hebben directe positie controle, waarin de beweging van de joystick rechtstreeks naar een beweging van de naald vertaalt.
Een nieuw ontworpen piëzo-elektrische micromanipulator figuur kan worden geconstrueerd van verkrijgbare onderdelen die gemakkelijk kunnen worden vervangen en van sommige kleine 3D-gedrukte onderdelen, en het werkt goed voor chromosoom micromanipulation24. De micromanipulator heeft instelbare gevoeligheid, handmatige grof positionering, en geen trillingen, drift, of lag in de beweging van de naald, en de controle van de directe positie van de naald. Wetenschappers kunnen construeren de micromanipulator met behulp van instructies beschikbaar online24. Hieronder vindt u de methoden voor het voorbereiden van de cultuur van de cel van een primaire spermatocyte en micromanipulating de chromosomen in de cellen in die cultuur.

<table><tbody><tr><td>VWR micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366 249</td><td>25 mm x 25 mm, no 1.5</td></tr><tr><td>Dow Corning High Vacuum Grease</td><td>VWR</td><td>AA44224-KT</td><td></td></tr><tr><td>KEL-F Oil #10</td><td>Ohio Valley Specialty Chemical</td><td>10189</td><td></td></tr><tr><td>Microdissecting Scissors, Stainless Steel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3271-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>0.85 mm buitendiameter, 0.65 mm binnendiameter Pyrex glazen buis&nbsp;</td><td>Drummond Scientific</td><td>Op maat gemaakte bestelling--bel om te bestellen</td><td></td></tr><tr><td>Inverted, Phase contrast microscoop met 10X of 16X lage vergroting objectief en 60X of 100X hoge vergroting objectief</td><td>Elk merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>ofwel op maat gebouwd of Narashige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator</td><td>ofwel op maat gebouwd of Burleigh PCS-6000 met op maat gemaakte piezo-besturende joystick</td><td>PCS-6300</td><td></td></tr></tbody></table>

micromanipulation van chromosomen in insect spermatocyten

Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes

De micromanipulation van de chromosomen is een essentiële methode voor de verlichting van het mechanisme voor chromosoom congression, de spindel checkpoint en anafase chromosoom bewegingen, en is de sleutel tot het begrijpen wat regelt chromosoom bewegingen tijdens een celdeling. Een geschoolde bioloog kunt een micromanipulator loskoppelen van de chromosomen van de spindel, chromosomen verplaatsen binnen de cel, en krachten om op te passen met behulp van een kleine glazen naald met een zeer fijne tip chromosomen. Terwijl verstoringen kunnen worden gemaakt aan chromosomen met behulp van andere methoden zoals optische overlapping en ander gebruik van een laser, tot op heden geen andere methode maakt het mogelijk de herpositionering van cellulaire componenten op de schaal van tientallen tot honderden micron met weinig tot geen schade aan de cel .
De selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor de micromanipulation van de chromosomen, specifiek met een beschrijving van de voorbereiding van de sprinkhaan en cricket spermatocyte primaire culturen voor het gebruik in live-cel beeldvorming en micromanipulation, zijn hier beschreven. Bovendien tonen we de bouw van een naald worden gebruikt voor het verplaatsen van de chromosomen in de cel, en het gebruik van een joystick-gecontroleerde piëzo-elektrische micromanipulator met een glas naald eraan verbonden zijn om te verplaatsen van chromosomen binnen scheidslijn cellen. Een steekproef-resultaat toont het gebruik van een micromanipulator om een chromosoom van een spindel in een primaire spermatocyte los te maken en dat chromosoom verplaatsen binnen de cel.

Figuur 6 toont een micromanipulation monster van 2 aangrenzende sprinkhaan primaire spermatocyten in diverse voorbeelden van de mogelijke toepassingen van de micromanipulation. Dit experiment werd gedaan met behulp van een omgekeerde, fase contrast Microscoop. De 0:00 (tijden weergegeven zijn in min:s) afbeelding toont beide cellen vóór de manipulatie. Één chromosoom in de onderste cel wordt weergegeven onder spanning toegepast door de micromanipulation-naald...

In dit protocol beschrijven we de selectie en de voorbereiding van geschikte cellen voor micromanipulation en het gebruik van een piëzo-elektrische micromanipulator chromosomen verplaatsen binnen die cellen.

Micromanipulation van chromosomen in Insect spermatocyten

The micromanipulation of chromosomes has been an essential method for illuminating the mechanism for chromosome congression, the spindle checkpoint, and ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de celbiologie, zoals, hoe belangrijk is spanning bij het voldoen aan de as checkpoint, en wat is de rol op spindel gehechtheid in chromosoom gedrag in miose? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een niet-dodelijke techniek is die de onderzoeker in staat stelt om spanning toe te passen op, of te herpositioneren chromosomen in een levende cel. Om te beginnen, bereid een 75 bij 25 millimeter dia met een 20 millimeter diameter cirkelvormige gat uitgesneden uit het centrum.Dan, voer een 25 bij 25 millimeter nummer 1,5 cover spleet door een bunsen brander vlam voor twee seconden. Breng vacuümvet aan rond de rand van het gat in de glazen schuif. Plaats vervolgens de cover slip over het gat en druk erop om een strakke afdichting te vormen.Draai de schuif om en vul de nieuw gecreëerde dissectie goed met halocarbon olie. Na het verkrijgen van een aantal volwassen mannelijke krekels, gebruik ontleden schaar te snijden door de rug oppervlak parallel aan de lange as van de buik, direct achter de vleugel knoppen. Knijp vervolgens voorzichtig in de buik om de teelballen door de snede in het exoskelet te duw

micromanipulation-of-chromosomes-in-insect-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Chromosoomschilderen is een handige methode voor het bestuderen van de organisatie van de celkern en de evolutie van het karyotype. Hier demonstreren we een aanpak om specifieke interessegebieden te isoleren en te versterken van enkele polytene chromosomen die vervolgens worden gebruikt voor twee- en driedimensionale fluorescerende in situ hybridisatie (FISH).

2D en 3D Chromosoom schilderen in Malaria Muggen

Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.

Voorbereiding van Meiotische chromosoom verspreidt van muis spermatocyten

Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Hierin staan protocollen voor het verzamelen en micro-injecteren van precellulaire maïsplanthopperembryo's met als doel hun genoom te wijzigen via CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerking of voor de toevoeging van gemarkeerde transponeerbare elementen door kiembaantransformatie.

Micro-injectie van Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryo's voor CRISPR/Cas9 Genome Editing

Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.

Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

Gezien hun eenvoudige anatomie bieden Anopheles-testikels een goed cytologisch model voor het bestuderen van spermatogenese. Dit protocol beschrijft whole-mount fluorescentie in situ hybridisatie, een techniek die wordt gebruikt om dit biologische proces te onderzoeken, evenals het fenotype van transgene stammen die mutaties herbergen in de genen die betrokken zijn bij de productie van sperma.

Whole-Mount Fluorescentie In Situ Hybridisatie om Spermatogenese in de Anopheles-mug te bestuderen

Leer micromanipulatie van chromosomen in levende insectenspermatocyten met behulp van een piezo-elektrische micromanipulator. Deze niet-dodelijke techniek maakt het mogelijk om spanning toe te passen op chromosomen en hun gedrag tijdens meiose te bestuderen.

Micromanipulation van chromosomen in Insect spermatocyten

Meer video's verkennen