Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Het algemene doel van deze methodologie is om de effecten van de stijfheid van de extracellulaire matrix op bacteriële infectie van adherante cellen op een zeer kwantitatief niveau te karakteriseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het opkomende veld van host-pathogeen biomechanica, zoals wat de rol is van mechanische krachten bij het moduleren van de vatbaarheid voor bacteriële infectie van hostcellen. Deze techniek helpt bij het creëren van tijdsverloop videosequenties met hoge resolutie terwijl tegelijkertijd meerdere omstandigheden worden gescreend en bepaalde procedures worden geautomatiseerd.

Voer glasactivatie uit van 24-well platen door 500 microliter tumalo natriumhydroxide per 13 millimeter diameter put toe te voegen en de platen gedurende één uur op kamertemperatuur te incuberen. Gooi het natriumhydroxide weg en spoel de putten één keer met ultrapuur water. Voeg vervolgens 500 microliter twee procent triethoxysilaan in 95%ethanol toe aan elke put en incubeer ze gedurende vijf minuten.

Spuil de putten één keer met water. Voeg vervolgens 500 microliter 0,5%glutaraldehyde toe aan elke put en incubeer de platen gedurende 30 minuten. Na het eenmaal spoelen met water, droog de platen bij 60 graden Celsius met het deksel eraf.

Om hydrogels met instelbare stijfheid te vervaardigen, bereid waterige oplossingen voor die drie tot tien procent van een 40% stock acrylamideoplossing en 0,6 tot 6 procent van een twee procent bis-acrylamideoplossing bevatten, afhankelijk van de gewenste stijfheid van het hydrogel. Voeg daarna het water toe. Voor elke stijfheid is Oplossing Een parel-vrij, terwijl Oplossing Twee 0,3% 0,1-micrometer fluorescente microbeads bevat.

Degasseer Oplossingen Een en Twee gedurende 15 minuten onder vacuüm om zuurstof te elimineren die polymerisatie zal remmen. Voeg vervolgens, terwijl u snel handelt, 0,43% TEMED en 0,6% van de 10 gram per milliliter stock APS oplossing toe aan Oplossing Een. Voeg 3,6 microliter van de oplossing toe aan het centrum van elke put van de 24-well plaat.

Gebruik onmiddellijk 12 millimeter ronde deksels om de putten te bedekken en laat de oplossing 20 minuten staan zodat deze volledig polymeriseert. Tik zachtjes met een spuitnaald op een hard oppervlak om een kleine haak aan de punt te maken om het verwijderen van de deksels te vergemakkelijken, gebruik vervolgens de naald om de deksels op te tillen. Voeg vervolgens 0,43% TEMED en 0,6% van de 10 gram per milliliter stock APS oplossing toe aan Oplossing Twee.

Deponeer vervolgens 2,4 microliter van het mengsel bovenop de 12 millimeter ronde deksels. Plaats de ronde deksels met een druppel Oplossing Twee bovenop de eerste polyacrylamidelaag en gebruik pincetten om voorzichtig naar beneden te drukken om ervoor te zorgen dat de dikte van de tweede laag minimaal is. Laat vervolgens Oplossing Twee gedurende 20 minuten polymeriseren.

Voeg 500 microliter 50 millimolair HEPES pH 7,5 toe aan elk van de putten en gebruik de spuitnaald en pincetten om de glazen deksels te verwijderen. Om de hydrogels te steriliseren, plaats ze in een weefselkweekhood en stel ze een uur bloot aan UV. Bereid nu een mengsel van 0,5%gewicht-per-volume van Sulfo-SANPAH en een procent DMSO en 50 millimolair HEPES pH 7,5.

Voeg 200 microliter van de oplossing toe aan het bovenoppervlak van de hydrogels. Stel ze vervolgens snel bloot aan 302 nanometer UV gedurende 10 minuten om ze te activeren. Gebruik een milliliter 50 millimolair HEPES pH 7,5 om de hydrogels twee keer te wassen, herhaal indien nodig om eventuele overtollige cross-linker te verwijderen.

Protein-coat de hydrogels met 200 microliter 0,25 milligram-per-milliliter rattenstaart collageen I en 50 millimolair HEPES. Incubeer de hydrogels met het collageen bij kamertemperatuur overnacht. Voordat u de cellen van belang op de hydrogels plaatst, voegt u een milliliter medium toe en brengt u ze in evenwicht bij 37 graden Celsius gedurende een uur.

Om humane microvasculaire endotheelcellen te zaaien, verwijder na het kweken en het voorbereiden van een celsuspensie volgens het tekstprotocol, het medium van de hydrogels en voeg vervolgens een milliliter celsuspensie toe aan elke put. Na het voorbereiden van een overnachtelijke cultuur van L.monocytogenes volgens het tekstprotocol, breng een milliliter van de cultuur over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer deze gedurende vier minuten bij 2.000 keer g bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een milliliter PBS om het pellet twee keer te wassen en gebruik een milliliter PBS om het pellet op te schorten.

Bereid de infectiemix voor door 10 of 50 microliter van de bacteriesuspensie te combineren met een milliliter MCDB 131 volledig medium voor een multipliciteit van infectie, of MOI, van ongeveer 50 bacteriën per gastheercel of 10 bacteriën per gastheercel. Verwijder het medium van de putten van de 24-well platen, zorg ervoor dat de hydrogels of de cellen niet worden verstoord. Gebruik een milliliter MCDB 131 volledig medium om de cellen één keer te wassen en voeg vervolgens een milliliter van de bacteriën toe aan elke put.

Plaats het deksel op de platen en wikkel ze in met polyethyleen voedselfolie om lekkage te voorkomen. Centrifugeer de platen gedurende 10 minuten bij 2.000 keer g om de invasie te synchroniseren en incubeer vervolgens de culturen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Was de monsters vier keer met MCDB 131 volledig medium en breng ze terug naar de weefselkweekincubator.

Na een extra 30 minuten, vervang het medium met MCDB 131 volledig medium aangevuld met 20 microgram per milliliter gentamicine. Om flowcytometrie uit te voeren, verwijder acht uur na infectie het medium van de putten van de 24-well plaat en was de putten één keer met weefselkweek PBS. Na het verwijderen van de PBS, voeg 200 microliter trypsi