Name: Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer hoe je grote aantallen myeloïde voorlopercellen en dendritische celprecursoren isoleert uit muizenbeenmerg met behulp van high speed cell sorting op basis van Ly6C- en CD115-expressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor de technische bijstand van Alison kerk Bird op de Auburn University School van diergeneeskunde Stroom Cytometry faciliteit, voor financiering uit de NIH EHS R15 R15 AI107773 en naar de cellulaire en moleculaire biologie programma aan de Universiteit van Auburn voor de zomer onderzoekssteun aan PBR.

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de Auburn University institutionele Animal Care en gebruik Comité overeenkomstig de aanbevelingen die worden beschreven in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health.
1. voorbereiding voor het beenmerg collectie
<ol><li>Bereiden van 250 mL volledig media door toevoeging van een oplossing van Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 50 µM 2-mercaptoethanol naar de top van een 0,22 µm vacuüm filter kolf eenheid en vacuüm van toepassing. Opmerking: Complete medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.</li>
	<li>Bereid 70% ethanol-oplossing door het mengen van 350 mL ethanol 100% met 150 mL steriele H2O in een maatkolf van 500 mL.</li>
	<li>Set centrifuge tot 4 ° C.</li>
	<li>Steriliseren pincet, scalpel en schaar in 70% ethanol.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg 5 mL van de volledige media aan drie petrischalen van 60 mm.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, Voeg 30 mL volledige media aan een conische buis van 50 mL.</li>
</ol>2. verzameling van lymfkliertest beenmergcellen
<ol><li>Een C57BL/6 muis euthanaseren door CO2 versuffing overeenkomstig de voorschriften die zijn vastgesteld door de 2013 Amerikaanse veterinaire medische vereniging (AVMA) richtsnoeren inzake euthanasie.</li>
	<li>
Verwijder en strippen van de achterpoten.
	<ol>
<li>De achterpoten en de torso te verzadigen met 75% ethanol en ondiepe snoeien via de huid rond het heupgewricht met een gebogen weefsel schaar. Met behulp van Tang, stevig Trek de huid van de heup naar beneden richting de enkel, onthullen de spier. Gebruik schaar te verwijderen van de klep van de huid.</li>
		<li>Verwijder de hele achterpoot door doorsnijden van het bot net boven het dijbeen/heupgewricht. Opmerking: Naast het steriliseren van het gebied, de ethanol zal steun bij het verstrekken van schone bezuinigingen en haar verhinderen besmetting van de monsters.</li>
		<li>Als de benen zal worden overgebracht naar een nieuwe locatie voor het oogsten van beenmerg, dompelen de poten in volledige media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Werken in een steriele bioveiligheid kabinet, de benen naar één van de eerder bereid petrischalen overbrengen.</li>
	<li>Gebruik schaar te knippen het net onder de enkel, en zorgvuldig Verwijder zo veel van het spierweefsel en elastisch bindweefsel mogelijk. Het schoongemaakte bot overbrengen in de tweede bereid petrischaal. Opmerking: Hoewel het niet nodig om alle de spier, teveel resterende weefsel kan het moeilijk maken om te spoelen van het beenmerg.</li>
	<li>
Het scheiden van het bovenbeen, knie en onderbeen.
	<ol>
<li>Met behulp van Tang, houden van het been bij de knie en zoek het merg. Opmerking: het beenmerg moet zichtbaar als een vage rode lijn in de holte van het bot aan de bovenkant van het dijbeen en tegen het einde van het scheenbeen.<ol>
<li>Met behulp van schaar, maken drie bezuinigingen als volgt.<ol>
<li>Snijd het scheenbeen net boven waar het merg lijkt te eindigen.</li>
				<li>Gesneden net onder het kniegewricht.</li>
				<li>Gesneden net boven het kniegewricht.</li>
				<li>Als het heupgewricht nog steeds met het dijbeen verbonden is, gesneden net onder het heupgewricht.</li>
			</ol>
</li>
			<li>De drie fragmenten terug te keren naar de petrischaal en herhaal dit proces op andere been.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Spoel het beenmerg van het bovenbeen en onderbeen.
	<ol>
<li>Vul een 10 mL spuit met volledige media uit de conische tube van 50 mL en cap met 23 G naald.</li>
		<li>Houd het bot met een tang boven de derde bereid petrischaal en schuif de naald in het bot-kanaal en duw media via, spoelen uit de cellen (die kunnen ontstaan als een intact "plug" of als meerdere clusters). Herhaal totdat er geen meer kleur kan worden gezien door het been. De spuit met media zo nodig bijvullen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plet de epifyses.
	<ol>
<li>Terwijl nog in de tweede petrischaal, houdt de knieschijf vast met een tang, en prak de knieën met het topje van de spuit. Totdat de epifyses zijn niet langer rood.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van de spuit, overbrengen in de cellen van de tweede en derde petrischaal de tube van 50 mL. Uiteenvallen van klontjes door pipetteren zachtjes op en neer. Probeer niet te genereren van de bubbels. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>
Lyse van rode bloedcellen
	<ol>
<li>Verwijderen van supernatant met serologische Pipet, pellet verjagen door flicking en lyse van rode bloedcellen door in 1 mL lysisbuffermengsel ACK (Ammonium-Chloride-kalium) voor 1 minuut bij kamertemperatuur incuberen.</li>
		<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg 40 mL HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, filtreer de cellen al een 70 µm cel zeef in een nieuwe conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, bezinken en wassen cellen met 40 mL van volledige media verwijderen. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Opmerking: In dit stadium, lineage positieve lymfocyten kunnen worden verwijderd door FACS of magnetische kolom zuivering. Lymfocyten worden echter niet onderhouden op lange termijn in cultuur. Hoewel een groot aantal lineage positieve cellen aanwezig in de Ly6C-CD115-bevolking in het beenmerg ex vivo zijn, bijna allemaal afwezig zijn door dag 5 (Figuur 2).</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, verwijder het supernatant en cultuur van de beenmergcellen in volledige media met 10 ng/mL van recombinante muis GM-CSF bij een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL. Opmerking: Doorgaans, 4 x 107 totaal aantal cellen geoogst kunnen worden na een lysis van de rode bloedcellen. Echter, verwachten zo weinig zoals 2 x 107 voor beginners en maximaal 5 x 107 cellen voor ervaren rooiers.</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, de cellen overbrengen naar weefselkweek platen, en Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2. Als met behulp van een 24-well plaat, elk zaad goed met 2 mL celsuspensie.</li>
	<li>Elke 48 h, kunt een serologische pipet verwijderen helft van de media en vervangt door vers volledige media en GM-CSF. Opmerking: Culturen kunnen worden gehouden tot 9 dagen. Maar de samenstelling verandert na verloop van tijd. Zie hoofdstuk 3 voor meer informatie.</li>
</ol>3. keuze dag soort
<ol><li>Als cel bevolking composities na verloop van tijd veranderen, een dag dat de opbrengst van het hoogste aantal gewenste cellen selecteren.</li>
	<li>Zie tabel 1 voor de verwachte cel opbrengst post sorteren voor elk van de bevolking na 3, 5 en 7 dagen van de cultuur in GM-CSF per 1 x 107 cellen.</li>
</ol>4. vlekken van strategie
<ol><li>Gebruik kleine porties van cellen te bereiden controlemonsters. Een onbevlekt besturingselement, compensatie controlemonsters gekleurd met slechts één fluorescent antibody elke, opnemen en fluorescentie-min-één regelt in welke alle antilichamen worden toegevoegd met uitzondering van één, om te bepalen voor niet-specifieke fluorescentie in dat kanaal. Als primaire alleen, secundaire alleen, met behulp van indirecte etikettering, omvatten en zowel primaire en secundaire. Opmerking: Phycoerythrin (PE) en allophycocyanin (APC) gelabeld antilichamen bieden duidelijke scheiding met minimale afloop wanneer samen gebruikt. Echter als fluorescerende opties beperkt zijn, CD115 uitgedrukt op een relatief laag niveau, terwijl Ly6C wordt uitgedrukt op een zeer hoog niveau. Daarom, helderder fluorochromes zijn wenselijk voor anti-CD115 en anti-Ly6C fluorochromes zijn gekozen om te voorkomen dat afloop.</li>
	<li>100 mL van FACS Wash Buffer (FWB) bereid door het mengen van 97 mL gekoeld Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 3 mL foetaal kalfsserum in een conische tube van 50 mL en plaats in een ijsbad.</li>
	<li>Gebruik een pipet te voorzichtig, maar grondig, Pipetteer cellen op en neer om te verjagen losjes Adherente cellen.</li>
	<li>
Met behulp van een serologische precisiepipet, overbrengen in cellen een conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
	<ol>
<li>Als cel volume 50 mL overschrijdt, cellen overbrengen in het benodigde aantal buizen en combineren bij de kleuring stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zachtjes giet af het supernatant en wassen van de Ingehuld cellen door toevoeging van 30 mL FWB met een serologische pipet. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min, en herhaal het wassen. Opmerking: Als hoge celdood wordt verwacht, kunnen de cellen worden gewassen met FWB met zo laag als 0,5% foetaal kalfsserum (FCS). Hierdoor zal het samendoen van de cel.</li>
	<li>
Schorten en vlek cellen per de instructies van de fabrikant van de antilichaam.
	<ol>
<li>5 x 107 cellen in 1 mL FWB schorten en voeg 2 µg van anti-Ly6C en anti-CD115 met het label met de fluorophores (van de onderzoeker van de keuze). Toevoegen om te verder onderscheiden CMP van moDC (allebei zijn Ly6C- en CD115-), 2 µg van anti-CD11c antilichamen (CMP zijn CD11c-; moDC zijn CD11c+). Incubeer gedurende 30 min op ijs. Opmerking: Figuur 3 werd gegenereerd met behulp van Ly6C-Pet en CD115-APC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg toe 10 mL FWB en centrifuge bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Zachtjes giet af het supernatant en wassen van de Ingehuld cellen door toevoeging van 30 mL FWB met een serologische pipet. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min, en herhaal het wassen.</li>
	<li>Voordat de cellen wordt verbroken, flick buis grondig te verjagen van de pellet. Gebruik een serologische pipet te schorten cellen op 1 x 107 cellen/mL FWB, en filtreer door 35-µm cel filter. Gebruik een serologische pipet om gefilterde cellen Pipetteer in polypropyleen buis en plaats op ijs totdat u wilt sorteren. Opmerking: Als polypropyleen niet beschikbaar is, eiwit coating (nonfat droge melk of FCS) polystyreen buizen kunnen worden gebruikt om bindende.</li>
</ol>5. Stel Gates op basis van controlemonsters
Opmerking: Om te voorkomen dat cel verstoring als gevolg van de druk van de snelle stroom stream, gebruik een 100-130 µm mondstuk voor het sorteren van de cel.
<ol><li>
Het Onbevlekt besturingselement uit te voeren (zie stap 4.1) via de cel sorter, en toepassing van een poort als u wilt uitsluiten van kleine puin (laag voorwaartse verstrooien; FSC) en uiterst granulaire (hoge kant verstrooien; WS) deeltjes.
	<ol>
<li>Als u wilt analyseren toepassing alleen de latere stadia (monocyten, moMac/MoDP en MoDC), gating alleen met grotere cellen (hoge FSC).</li>
		<li>Als levensvatbaarheid vlekken worden gebruikt, kunt u deze gebruiken om uit te sluiten van gebeitst, niet-levensvatbare evenementen (een voorbeeld wordt geïllustreerd in Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De één fluorescerende controlemonsters doorlopen de cel sorter en compensatie naar wens aanpassen.</li>
	<li>Een monster van het multi-geëtiketteerden monster worden uitgevoerd. Observeren van vier verschillende populaties: Ly6C + CD115-(GGP's), Ly6C + CD115 + (monocyten), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), en Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Een hek om te isoleren van elk van de vier grote populaties van toepassing. Opmerking: CMPs moDC samen met het Ly6C-CD115-fenotype. Echter, zij kunnen worden gedifferentieerd op basis van CD11c expressie: CMP ontbreken CD11c, terwijl MoDCs express CD11c.</li>
</ol>6. verzameling van geïsoleerde populaties
<ol><li>Bereiden collectie buizen door toevoeging van genoeg FCS om ten minste 20% eindconcentratie wanneer volledige. Bijvoorbeeld, als u buizen van 5 mL, voeg 1 mL FCS voordat u sorteert, en verwijderen van de buis, wanneer het totale volume van de 5 mL wordt bereikt.</li>
	<li>
Om te voorkomen dat membraan omzet en antilichaam opname, houden alle monsters (gemengd en gesorteerd) bij 4 ° C gedurende het sorteren.
	<ol>
<li>Als dit niet mogelijk is, houden de buis met de cellen om te worden gesorteerd op zoveel mogelijk ijs en aliquots aan de sorter overdragen zoals nodig.</li>
		<li>Bovendien overdracht gesorteerd op monsters aan ijs elke 20-30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat het gewenste aantal cellen zijn verzameld, gebruiken een serologische pipet om de cellen naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.<ol>
<li>Bevestigen zuiverheid met post sorteren analyse van kleine porties van elke verzamelde bevolking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder het supernatant, schorten in 10 mL FWB en centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min. herhalen voor een totaal van twee wasbeurten. Opmerking: Het kan moeilijk zijn om alle de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het loskomen van de pellet. Een pipet tip aansluiten in een vacuüm lijn kan helpen met de verwijdering. Als dit niet beschikbaar is, wordt voorgesteld dat het supernatant worden verzameld in een verse buis bij pellet dissociatie.</li>
	<li>Verwijder het supernatant na de tweede wash.</li>
	<li>Als de gebruiker proefopzet de cellen opnieuw worden gekweekt dicteert, stappen 2.12-2.14. Anders, als cellen wordt gebruikt voor onmiddellijke analyse, bereiden cellen volgens het gewenste protocol. Opmerking: Een voorbeeld van de typische functionaalanalyse is opgenomen in afbeelding 4.</li>
</ol>

<ol><li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF%3A+more+than+a+hematopoietic+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+cytokine%2C+GM-CSF%2C+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li>
<li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+development+by+GM-CSF%3A+molecular+control+and+implications+for+immune+homeostasis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy.</a> Blood. 119, 3383-3393 (2012).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10449155">Myeloid dendritic cells.</a> J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li>
<li>Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell development and maturation.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).</li>
<li>Pierre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+MHC+class+II+transport+in+mouse+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells.</a> Nature. 388, 787-792 (1997).</li>
<li>Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+antigen+presentation%2C+accessory+function+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance.</a> Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).</li>
<li>Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Grown+Bone+Marrow+Derived+Cells+Are+Composed+of+Phenotypically+Different+Dendritic+Cells+and+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages.</a> Mol Cells. 39, 734-741 (2016).</li>
<li>Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+developmental+stages%2C+kinetics%2C+and+phenotypes+exhibited+by+myeloid+cells+driven+by+GM-CSF+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro.</a> PLoS One. 12, e0181985(2017).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42, 1197-1211 (2015).</li>
<li>Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+maturation+and+cross-presentation%3A+timing+matters%21%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters!</a> Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).</li>
<li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).</li>
<li>Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Dendritic+Cell+Maturation+in+the+Induction+of+Insulin-Dependent+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus.</a> Frontiers in immunology. 8, 327(2017).</li>
<li>Shortman, K., Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+and+inflammatory+dendritic-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Steady-state and inflammatory dendritic-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).</li>
<li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li>
<li>Naik, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+pro-DCs+and+pre-DCs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro.</a> Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).</li>
<li>Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+myeloid+dendritic+cells+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow.</a> Int Immunol. 15, 515-524 (2003).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311, 83-87 (2006).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+CD8%7Balpha%7D-Positive+Dendritic+Cells+from+a+Common+Myeloid+Progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor.</a> Science. 290, 2152-2154 (2000).</li>
</ol>

De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.

Dit protocol vergemakkelijkt isolatie van GM-CSF-driven voorlopercellen en voorloper celtypes in getallen voldoende voor verschillende soorten analyses met inbegrip van biochemische testen, testen van cellulaire functie in vitroof instillation in vivo. Deze methode vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van monocyt-afgeleide dendritische cel ontwikkeling, waardoor de betrouwbare isolatie en identificatie van cellen in het begin van dit traject van ontwikkeling, alsook deze gediff...

Kweken van lymfkliertest beenmergcellen met de cytokine wordt granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) veel gebruikt als een methode voor het genereren van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC; ook bekend als inflammatoire DC) in grote aantallen 1, 2,3,4,5. Deze cellen zijn uiterst nuttig in een aantal studies van dendritische cellen (DC) functie 6,7,8. Meestal deze lymfkliertest beenmergcellen zijn gekweekte voor 6-8 dagen en worden vervolgens gebruikt voor de studie van dendritische cel functie 5. Deze culturen had lang beschouwd als meestal homogene, bestaande uit een meerderheid van gedifferentieerde moDC. Meer recentelijk is gebleken dat aan het einde van deze periode van 6-8 dagen cultuur, er inderdaad vele moDC, evenals een grote subset van gedifferentieerde monocyt-afgeleide macrofagen (moMacs) 9,10,11 zijn. Onze eigen studies hebben deze bevindingen aan te tonen dat andere deelverzamelingen van minder ontwikkelde cellen, zoals moDC precursoren (moDP) en monocyten, zelfs na 7 dagen 10in de culturen met lage frequentie blijven verder uitgebreid. Aldus, kon studies van dendritische cellen (DC) functie met behulp van cellen die zijn gegenereerd door dit systeem de reacties van een bredere cohort van celtypes weerspiegelen dan eerder gewaardeerd.
We hebben veel geleerd uit de studie van GM-CSF-gegenereerd moDC met betrekking tot de functie van deze cellen in de laatste stadia van differentiatie 12,13,14. Wij begrijpen echter aanzienlijk minder over de ontwikkelings traject van deze cellen 2,15,16 en van hoe en wanneer zij specifieke vertonen functies zoals: Pathogen verbonden moleculaire klantgerichtheid Patronen (PAMPs), fagocytose, antigeen processing en presentatie 13en anti-bacteriële activiteit. Een protocol voor het isoleren van grote aantallen van conventionele Flt3L-gedreven DC progenitoren en precursoren geweest gerapporteerde 17. Isolatie van deze verschillende populaties tot stand gekomen met behulp van carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-gekleurd beenmergcellen (voor het bijhouden van scheidslijn cellen) en cultuur in Flt3L voor 3 dagen. Cellen werden dan uitgeput van linage positieve cellen en gesorteerd in voorlopercellen en voorloper populaties op basis van CD11c expressie 17. Een andere benadering van Leenen de Fractie op het identificeren van vroege progenitorcellen van DC in GM-CSF-gedreven cultuur moest sorteren van cellen op basis van CD31 en Ly6C 18. Het oorspronkelijke doel was om een soortgelijke methode voor het verkrijgen van de progenitoren en precursoren van GM-CSF-gedreven moDC. Als gevolg van de specifieke celtypes gegenereerd door GM-CSF, aangepast we de aanpak en sorteren van de strategie die gebaseerd is op de expressie van de moleculen die werden uitgedrukt in vroege en latere stadia van ontwikkeling. We uiteindelijk vastgesteld dat Ly6C, CD115 (CSF-1-receptor), en CD11c waren de beste markers voor 10onderscheiden deze cel typen.
Hier presenteren we een methode voor het isoleren van cellen in meerdere verschillende stadia van ontwikkeling langs het traject van differentiatie gedreven door GM-CSF: gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP), granulocyt-Macrophage voorlopercellen (GMP), monocyt, monocyt-afgeleide Macrophage (MoMac) en monocyt-afgeleide DC (MoDC). De moMac bevolking kan worden verder gescheiden gebaseerd op niveau van MHC klasse II expressie, onthullend een moDC voorloper bevolking (moDP) 10. Wij gebruiken een high-speed fluorescentie-activated cell sorting (FACS) strategie om te isoleren van deze 5 bevolkingsgroepen op basis van expressie van Ly6C, CD115 en CD11c. Wij tonen dan de behandeling van deze cellen in functionele assays onthullen hun reacties op PAMP stimulatie.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>HyClone</td><td>SV30014.04</td><td>om compleet medium en FWB aan te vullen</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>om compleet medium aan te vullen</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td><td>MP Biomedical</td><td>190242</td><td>om compleet medium aan te vullen</td></tr><tr><td>75 mM Vacuum Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>156-4045</td><td>om compleet medium te steriliseren</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>om rode bloedcellen te lysen</td></tr><tr><td>HBSS buffer</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>om leukocyten te redden na rode bloedcel lysis</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>moet endotoxine-vrij zijn; gekoeld bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>35 &micro;m Cell filter</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>om klonters te breken voordat ze door de cytometer gaan.</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Biosource</td><td>PMC2011</td><td>bruikbare concentratie van 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Tissue cultured treated plate</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td>voor beenmergcellen na het oogsten</td></tr><tr><td>Anti-Ly6C, Clone HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115, Clone AFS98</td><td>Tonbo Bioscience</td><td>20-1152-U100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c, Clone HL3</td><td>BD Biosciences</td><td>557400</td><td>om CMP en MoDCs te differentiëren</td></tr><tr><td>MoFlo XPD Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td>660517</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200CSPP</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri Dish</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Vrouwelijk; 10-20 weken oud</td></tr><tr><td>Biosafety Hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>8354-30-0011</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>23 G naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810&nbsp;R</td><td>eppendorf</td><td>22625501</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software v10</td><td>BD Biosciences</td><td>Versie 10</td><td>flowjo.com</td></tr></tbody></table>

generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Culturen van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC) gegenereerd uit beenmerg van de muis met behulp van granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) zijn onlangs bekroond meer een heterogeen beeld vertonen dan eerder gewaardeerd. Deze culturen worden routinematig moDC evenals monocyt-afgeleide macrofagen (moMac) en zelfs sommige minder ontwikkelde cellen zoals monocyten bevatten. Het doel van dit protocol is bedoeld als een consistente methode voor de identificatie en de scheiding van de vele celtypes aanwezig in deze culturen zoals zij ontwikkelen, zodat hun specifieke taken kunnen verder worden onderzocht. De sorteer-strategie gepresenteerde scheidt cellen eerst in vier bevolkingsgroepen op basis van uitdrukking van Ly6C en CD115, die beide worden uitgedruct in Transient door cellen ontwikkelen ze in GM-CSF-gedreven cultuur. Deze vier populaties omvatten gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen of CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt/macrofaag progenitoren of GMP (Ly6C +, CD115-), monocyten (Ly6C +, CD115 +), en macrofagen monocyt-afgeleide of moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c wordt ook toegevoegd aan het sorteren strategie om te onderscheiden van de twee bevolkingsgroepen binnen de Ly6C-, CD115-bevolking: CMP (CD11c-) en moDC (CD11c +). Tot slot kunnen twee populaties verder worden onderscheiden binnen de Ly6C-, CD115 + bevolking op basis van het niveau van de MHC klasse II expressie. MoMacs express lagere niveaus van MHC klasse II, terwijl een monocyt-afgeleide DC voorloper (moDP) hogere MHC klasse II spreekt. Deze methode zorgt voor de betrouwbare isolatie van verschillende ontwikkelingsachterstand verschillende populaties in getallen voldoende voor een scala aan functionele en developmental analyses. We benadrukken dat een dergelijke functionele uitlezing, de differentiële reacties van dit type cel op stimulatie met Pathogen-Associated moleculaire patronen (PAMPs).

In een poging om te houden zo veel kanalen beschikbaar voor analyse als mogelijk, levensvatbare cellen werden routinematig geselecteerd op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter, met uitzondering van zeer kleine en zeer gedetailleerde gebeurtenissen (een typische gate wordt toegepast op alle de stip in figuur 1A percelen). Om te bepalen of deze gating strategie betrouwbaar dode cellen uitgesloten, gekleurd we met 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (<stron...

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Deze methode kan onderzoekers in staat stellen om voldoende aantallen celtypen te verkrijgen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsimmunologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zich baseert op een paar selecte markers om grote aantallen cellen te isoleren die traditioneel in lage aantallen ex vivo worden aangetroffen. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapeutische beenmergtransplantatie, omdat het de isolatie van grote aantallen voorlopercellen mogelijk maakt.Om het protocol te beginnen, verzadig de achterpoten en romp van een eerder voorbereide muis met 75%ethanol, en maak ondiepe sneden door de huid rond de heupkom met gebogen weefselschaar. Vervolgens verwijder en verwijder de achterpoten. Gebruik pincetten om de huid stevig van de heup naar de enkel te trekken, waardoor de spier wordt blootgelegd, en gebruik schaar om de huidflap te verwijderen.Snijd net boven het dijbeen en de heupkom, en verwijder de hele achterpoot door door het bot te snijden. Werkend in een steriele bioveiligheidskast, breng de poten over naar een van de eerder voorbereide petrischalen. Gebruik schaar om net onder de enkel te snij

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Hier presenteren we een protocol dat grote hoeveelheden muis-monocyten genereert uit heterogeen beenmerg voor translationele toepassingen. In vergelijking met andere methoden helpt deze nieuwe methode het aantal geofferde dieren te verminderen en de kosten te drukken door dure methoden zoals hooggradige magnetische celscheiding (MACS) te vermijden.

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Leer hoe je grote aantallen myeloïde voorlopercellen en dendritische celprecursoren isoleert uit muizenbeenmerg met behulp van high speed cell sorting op basis van Ly6C- en CD115-expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie (Video) | JoVE Journal

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Meer video's verkennen