Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie
10 augustus 2018
Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.
Deze methode kan onderzoekers in staat stellen om voldoende aantallen celtypen te verkrijgen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van ontwikkelingsimmunologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zich baseert op een paar selecte markers om grote aantallen cellen te isoleren die traditioneel in lage aantallen ex vivo worden aangetroffen. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapeutische beenmergtransplantatie, omdat het de isolatie van grote aantallen voorlopercellen mogelijk maakt.
Om het protocol te beginnen, verzadig de achterpoten en romp van een eerder voorbereide muis met 75%ethanol, en maak ondiepe sneden door de huid rond de heupkom met gebogen weefselschaar. Vervolgens verwijder en verwijder de achterpoten. Gebruik pincetten om de huid stevig van de heup naar de enkel te trekken, waardoor de spier wordt blootgelegd, en gebruik schaar om de huidflap te verwijderen.
Snijd net boven het dijbeen en de heupkom, en verwijder de hele achterpoot door door het bot te snijden. Werkend in een steriele bioveiligheidskast, breng de poten over naar een van de eerder voorbereide petrischalen. Gebruik schaar om net onder de enkel te snijden, en verwijder zorgvuldig zoveel mogelijk spier en elastisch bindweefsel.
Breng het gereinigde bot over naar de tweede voorbereide petrischaal. Scheid vervolgens het dijbeen, de knie en het scheenbeen. Gebruik pincetten om het been bij de knie vast te houden en de beenmerg, een zwakke rode lijn binnen de beenholte aan de bovenkant van het dijbeen en richting het uiteinde van het scheenbeen, te lokaliseren.
Snijd met schaar het scheenbeen net boven waar het beenmerg lijkt te eindigen. Snijd net onder de knieschijf, snijd net boven de knieschijf. Vervolgens spoel het beenmerg uit het dijbeen en scheenbeen.
Vul een 10 milliliter spuit met compleet medium uit de 50 milliliter kegelbuis en sluit de spuit af met een 23 gauge naald. Houd het bot met pincetten boven de derde voorbereide petrischaal, steek de naald in het beenkanaal en duw het medium door, waardoor de cellen worden weggespoeld. Herhaal deze stap totdat er geen kleur meer door het bot te zien is.
Ga verder met het procedure door de epifyse te pletten. Terwijl je nog steeds in de tweede petrischaal bent, houd de knieschijf stevig vast met pincetten en plek de knieën met de punt van de spuit. Ga door totdat de epifyse niet meer rood zijn.
Gebruik de spuit om de cellen van de tweede en derde petrischalen over te brengen naar de 50 milliliter buis. Breek klonten op door voorzichtig op en neer te pipetten en probeer bellen te vermijden. Centrifugeer de cellen.
Verwijder vervolgens het supernatant met de serologische pipet, ontdoe het pellet door te schudden en lyseer rode bloedcellen door ze gedurende één minuut bij kamertemperatuur in één milliliter ammoniumchloridekalium of ACK-lysebuffer te incuberen. Gebruik een serologische pipet om 40 milliliter HBSS-buffer toe te voegen. Gebruik een serologische pipet om de cellen door een 70 micrometer celzeef te filteren in een nieuwe 50 milliliter kegelbuis en centrifugeer de cellen.
Gebruik een serologische pipet om het supernatant te verwijderen en cultiveer de beenmergcellen in compleet medium met 10 nanogram per milliliter Recombinant Mouse GM-CSF bij een dichtheid van een keer 10 tot de 6e cellen per milliliter. Gebruik een serologische pipet om de cellen over te brengen naar weefselkweekplaten en incubeer ze bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide, totdat ze klaar zijn voor verdere verwerking. Pipet de cellen voorzichtig, maar grondig, op en neer om losjes hechtende cellen los te maken.
Gebruik een serologische pipet om cellen over te brengen naar een 50 milliliter kegelbuis en centrifugeer de cellen. Giet voorzichtig het supernatant af en was de gepelletiseerde cellen door 30 milliliter FACS-wasbuffer of SFWB toe te voegen met de serologische pipet. Centrifugeer vervolgens de cellen en herhaal de wassing.
Hang vervolgens de cellen op en kleed ze volgens de instructies van de antilichaamfabrikant. Resuspendeer vijf keer 10 tot de 7e cellen in één milliliter FWB en voeg twee microgram anti Ly-6C en anti CD115 toe, gelabeld met fluoroforen. Om CMP verder van MODC te onderscheiden, voeg twee microgram anti CD11C-antilichamen toe.
Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Na incubatie, gebruik een serologische pipet om 10 milliliter FWB toe te voegen en centrifugeer de cellen. Giet voorzichtig het supernatant af en was de gepelletiseerde cellen door 30 milliliter FWB toe te voegen met een serologische pipet.
Centrifugeer de cellen en herhaal de wassing. Voordat je de cellen ophangt, schuif de buis grondig om het pellet los te maken. Gebruik een serologische pipet om de cellen te resuspenderen bij een keer 10 tot de 7e cellen per milliliter FWB en filter ze door een 35 micrometer celfilter.
Gebruik een serologische pipet om de gefilterde cellen over te brengen naar een polypropyleen buis en plaats de buis op ijs totdat ze klaar zijn om te worden gesorteerd. Laat de ongekleurde controle door de celsorteerder lopen en pas een poort toe om kleine puinhopen en zeer korrelige deeltjes uit te sluiten. Laat de enkele fluorescente controlemonsters door de celsorteerder lopen en pas de compensatie aan zoals nodig.
Laat een monster van het meervoudig gekleurde monster lopen en observeer vier verschillende populaties. Pas een poort toe om elk van de vier belangrijkste populaties te isoleren. Bereid verzamelbuizen voor door voldoende foetaal runder serum of FCS toe te voegen om ten minste 20% eindconcentratie te bereiken wanneer ze vol zijn.
Bijvoorbeeld, als je vijf milliliter buizen gebruikt, voeg dan één milliliter FCS toe voor het sorteren en verwijder de buis wanneer deze een totaal volume van vijf milliliter bereikt. Om membraanvernieuwing en antilichaamopname te voorkomen, houd alle monsters gedurende het hele sorteerproces op vier graden Celsius. Nadat het gewenste aantal cellen is verzameld, gebruik een serologische pipet om de cellen over te brengen naar een nieuwe kegelbuis en centrifugeer de cellen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van grote populaties GM-CSF-gestuurde myeloïde cellen via high-speed cell sorting. De techniek maakt de identificatie van vijf verschillende celpopulaties mogelijk op basis van specifieke markers.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- GM-CSF is essentieel voor de ontwikkeling van myeloïde cellen.
- Traditionele methoden leveren slechts een gering aantal specifieke celtypen op.
- Hogesnelheidscelsortering verbetert de efficiëntie van celisolatie.
- Het begrijpen van myeloïde celpopulaties is van vitaal belang voor immunologisch onderzoek.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het isoleren van myeloïde cellen.
- Om onderzoek in de ontwikkelingsimmunologie te faciliteren.
- Om therapeutische toepassingen bij beenmergtransplantaties te ondersteunen.
Gebruikte methoden
- Snelheidscellsortering op basis van Ly6C- en CD115-expressie.
- Voorbereiding van muismodellen voor celisolatie.
- Gebruik van specifieke markers om onderscheid te maken tussen celpopulaties.
- Het protocol bevat gedetailleerde stappen voor de weefselpreparatie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van vijf verschillende myeloïde celpopulaties.
- Aantoonde efficiëntie bij het isoleren van cellen met een lage abundantie.
- Potentiële toepassingen in therapeutische settings.
- Verbeterd begrip van de rollen van myeloïde cellen bij immuniteit.
Conclusies
- De methode verbetert de mogelijkheden voor celisolatie aanzienlijk.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in de immunologie.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek inzetten voor diverse toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Dit protocol maakt de betrouwbare isolatie mogelijk van ontwikkelingsbiologisch verschillende myeloïde progenitor- en dendritische celprecursorpopulaties uit muizenbeenmergkweken, ter ondersteuning van mechanistische studies naar immuunceldifferentiatie. Door voldoende hoeveelheden van zeldzame celpopulaties te leveren, faciliteert het functionele assays en padanalyse die relevant zijn voor de validatie van immunologische targets. Deze aanpak pakt een belangrijk knelpunt in preklinisch immunologisch onderzoek aan, waarbij lage opbrengsten downstream-toepassingen beperken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de commitment van de myeloïde lijn en de functie van progenitorcellen mogelijk door de isolatie van CMP-, GMP-, monocyt-, moMac- en moDC-subsets.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van transiënte oppervlaktemarkers (Ly6C, CD115, CD11c, MHC-II) om discrete ontwikkelingsstadia te definiëren voor hypothesetoetsing.
- Predictieve waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het oppervlaktfenotype te koppelen aan functionele responsen op pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs).
Screening & assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Genereert gezuiverde celpopulaties in voldoende aantallen voor downstream functionele en ontwikkelingsanalyses.
- Reproduceerbaarheid: Vertrouwt op een gestandaardiseerde immunofenotyperings- en sorteerstrategie om een consistente isolatie over verschillende experimenten te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Maakt de productie van grote aantallen cellen mogelijk uit traditionele ex vivo bronnen met een lage opbrengst, wat de standaardisatie van de assay ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Biedt een muismodel-systeem om differentiatieroutes van monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen te bestuderen.
- Translationele continuïteit: Geïsoleerde precursoren maken functionele vergelijkingen mogelijk ter ondersteuning van preklinische modellen van aangeboren immuniteit.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Differentiële PAMP-responsen tussen subsets maken mechanistisch inzicht in drempelwaarden voor immuunactivatie mogelijk.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen de biologische ontdekkingsfase en maakt de isolatie van myeloïde progenitoren mogelijk voorafgaand aan functionele screening of mechanistische vervolgstudies in immunologie-georiënteerde programma's.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van myeloïde differentiatiepaden door het leveren van gezuiverde progenitor- en precursorpopulaties.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde cel-inputs voor assay-ontwikkeling gericht op aangeboren immuunresponsen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking mogelijk van subset-specifieke responsen op stimuli zoals PAMPs.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt ex vivo isolatie met functionele validatie in ziektespecifieke immuuncontexten.
- Enterprise Reuse: Vestigt een reproduceerbare workflow voor immunofenotypering en sortering die toepasbaar is in diverse murine myeloïde studies.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de myeloïde ontwikkeling door de isolatie van transiënte progenitorstadia mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert de isolatie van cellen met een lage abundantie met behulp van gedefinieerde panels van oppervlaktemarkers.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in targetvalidatie door fenotype te koppelen aan functie in immuuncelsubsets.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van immunomodulerende targets via mechanistische risicoreductie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het oogsten van muizenbeenmerg en cel sorteren op basis van flowcytometrie.
- Afhankelijk van toegang tot een high-speed cellsorter en fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen Ly6C, CD115, CD11c en MHC-II.
- Maakt standaardisatie van de GM-CSF cultureduur vereist om de gewenste progenitor- of precursorpopulaties te verrijken.
- Omvat optimalisatie van de viability gating om dode cellen uit te sluiten en de functionele integriteit van de gesorteerde subsets te waarborgen.
- Beperkt tot muizensystemen; adaptatie naar menselijke modellen zou validatie van equivalente oppervlaktemarkers vereisen.
