Name: Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Leer hoe u stamcellen zaait op een geleidend polymeersteiger voor in vitro elektrische stimulatie en minimaal invasieve in vivo-implantatie. Deze methode optimaliseert stamcelgedrag voor beroerteonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. Kati Andreasson (afdeling Neurologie en neurologische wetenschap, Stanford University) voor gebruik van de machine qRT-PCR. Het werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid-subsidies K08NS098876 (naar P.M.G.) en Stanford School of Medicine Dean's Postdoctoral Fellowship (aan Bo).

Alle stamcel en dierlijke procedures goedgekeurd door Stanfords stamcellen onderzoek Toezichtscomité en van de Universiteit van Stanford administratieve Panel op Laboratory Animal Care (SCRO-616 en APLAC-31909).
1. de etsen van ITO glas
<ol><li>Voorbereiden van het indium tin oxide (ITO)-overdekte glasplaatje door het plaatsen van een agent maskeren de geleidende zijde van het glas. Opmerking: De meeste commerciële transparante tapes kunnen worden gebruikt als een agent maskeren.<ol>
<li>Verwijderen van de overtollige masker met behulp van een mes, zodat alleen de gewenste vorm van het definitieve ontwerp van de ITO bedekt op het glas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het combineren van 5% (v/v) van salpeterzuur en 45% (v/v) van HCl in een bekerglas van glas in een zuurkast te bereiden de etsen-oplossing.<ol>
<li>Een thermometer en een hete plaat gebruiken om ervoor te zorgen dat de temperatuur van de etsen van de oplossing wordt gehandhaafd bij 70 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de etsen-oplossing 70 ° C bereikt, plaats de gemaskeerd-ITO glasplaatje in de oplossing gedurende 2 minuten om te verwijderen van de overtollige ITO laag. Opmerking: Tape maskeren beschermt de ITO laag tegen de blootstelling aan zure oplossing.</li>
	<li>Verwijder de dia uit de oplossing en spoel het af met gedeïoniseerd water (DI) H2O.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de weerstand van het masker en maatregel met behulp van een multimeter om ervoor te zorgen dat de resterende ITO intact is. Uitlezingen van het gewenste geëtste gebied moet ongeveer 0 Ω.</li>
</ol>2. bereiding van pyrrool-oplossing
<ol><li>In een glazen fles van 1000 mL, los 70 g gekristalliseerd Natrium dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) in 600 mL DI H2O.</li>
	<li>Zodra de NaDBS wordt ontbonden, 14 mL 0,2 M pyrrool en 386 mL DI H2O aan de oplossing toevoegen.</li>
	<li>Dekking van de oplossing met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C.</li>
</ol>3. galvaniseren van Polypyrrole op ITO glas
<ol><li>Warm de pyrrool-oplossing tot kamertemperatuur tot NaDBS is volledig redissolved. Let op: Dit duurt ongeveer 15 tot 20 minuten.</li>
	<li>Giet 25 mL van de pyrrool-oplossing in een bekerglas.</li>
	<li>De geëtste glas ITO verbinden met een multimeter en de dia onderdompelen in de pyrrool-oplossing.<ol>
<li>Zorg ervoor dat de kant met 0 Ω weerstand naar de platina mesh referentie-elektrode is gericht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het toepassen van een elektrische stroom om te starten met het galvaniseren van PPy op het oppervlak van de ITO met behulp van een multimeter (huidig gecontroleerd op 3 mA/cm2 voor 4 uur).</li>
	<li>Verwijder het ITO-glas uit de multimeter en wassen galvanische-PPy in DI H2O residuele oppervlakteactieve stof verwijderen.</li>
	<li>Voorzichtig losmaken de galvanische-PPy plaat boven het glas van de ITO met behulp van een scheermesje.<ol>
<li>De plaat van de PPy bij kamertemperatuur worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. voorbereiding van Polydimethylsiloxaan (PDMS)
<ol><li>Met behulp van een spatel en een weeg-schotel, 18 g voor basis agent meng met 2 g uithardende agent en giet het mengsel in twee 10 x 8 cm glas mallen.</li>
	<li>Verwijder de belletjes uit de mallen met behulp van een vacuuemcel gedurende 15-20 minuten.</li>
	<li>Plaats de mallen in een oven van 70 ° C gedurende 3 uur.</li>
	<li>Eenmaal afgekoeld, gebruik een platte spatel om de PDMS van de mallen.</li>
</ol>5. de fabricage van de In Vitro elektrische stimulatie kamer
<ol><li>Autoclaaf de metalen platen (WxL, 2,5 x 12,5 cm) en de stroom kleppen bij 120 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Met behulp van een kamer dia als een sjabloon, Knip twee stukken van PDMS. Opmerking: Ééndelig van PDMS fungeert als de omtrek van de cel kamer met knipsels van twee aangrenzende vierkanten van binnen de cel kamer. De andere PDMS stuk is een schets van de omtrek van de kamer.<ol>
<li>Knip uit de binnenkant cel kamer zodat er vierkante vorm en overeenkomt met de vorm van de kamer van de cel. Ervoor zorgen dat de algehele vorm van beide stukken van PDMS rechthoekig is en overeenkomt met die van de dia van de kamer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laag van de materialen als volgt van bodem tot bovenkant: (1) metalen plaat, (2) PDMS (zonder knipsels), (3) PPy plaat (loodrecht op PDMS), (4) PDMS (met knipsels) en (5) cel kamer.</li>
	<li>Klem het apparaat samen zodra het volledig wordt uitgelijnd.</li>
	<li>Knip twee 60 cm stukken van een metaaldraad en zilveren plakken gebruiken om één draad aan elk uiteinde van de PPy plaat die aan de buitenkant van de kamer uitsteekt. Zorg ervoor dat de draden lang genoeg uit te breiden van het apparaat aan de buitenkant van een incubator.</li>
	<li>Zodra de zilveren plak is genezen, versterken en verzegel de draadaansluiting met epoxy.<ol>
<li>Record de weerstand met behulp van een multimeter om ervoor te zorgen dat het veld Vereffend hetzelfde in elke kamer is.</li>
		<li>Voor implantatie, verwijder de draden; unclamp van de cel kamers en PDMS waarna ze scheiden van de geleidende steiger. De dimensie van de geïmplanteerde steigers is ongeveer 1 x 3 x 0,25 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. plating menselijke neurale voorlopercellen (hNPCs) op PPy
<ol><li>Het steriliseren van de geassembleerde kamers onder UV-licht gedurende 2 uur.<ol>
<li>Na 1 uur, draaien de geassembleerde chambers van 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na sterilisatie, coat het oppervlak van PPy bij de bodem van de kamer met 800 µL van een coating substraat en laat het substraat te stollen op de plaat van de PPy in een incubator bij 37 ° C bij 5% CO2 voor 1 h.</li>
	<li>Na 1 uur, verwijder de bovendrijvende substantie uit kamers en voorzichtig spoelen met DPBS + Ca + Mg 1 mL per putje. Opmerking: Vermijd wassen van het oppervlak van PPy krachtig, zoals dit leiden het detachement van de coating-coating tot zal.</li>
	<li>Gebruik verse cel media, mechanisch distantiëren gekweekte cellen voor gebruik met de kamers van een weefselkweek plaat met zachte pipetteren. Opmerking: De cellen moeten 90-100% heuvels op dissociatie.</li>
	<li>Verzamelen hNPC pellets met behulp van centrifugeren op 8000 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer, tellen en resuspendeer de cellen bij een volume van 100.000 cellen/cm2.</li>
	<li>Plaat 100.000 cellen in elke kamer goed (100.000 cellen/cm2 in 1 mL van de media).</li>
	<li>Chambers terug naar incubator bij 37 ° C bij 5% CO2.
</li>
</ol>7. elektrische stimulatie van hNPCs
<ol><li>Een dag na het zaaien van de cellen op de kamers, gebruik een golfvorm generator elektrische stimulatie toepassen op de cellen.</li>
	<li>Voorafgaand aan stimulatie, verwijderen van oude media vanuit elke kamer goed en vullen met 800 µL van nieuwe media.</li>
	<li>Nadat de media is gewijzigd, de kamers plaats terug in de incubator, de uitbreiding van de draden uit de incubator, en deze koppelen aan een golfvorm generator</li>
	<li>De stimulatie toepassen op de cellen met een signaal van de blokgolf op ±400 mV met 100 Hz gedurende 1 uur.</li>
	<li>Na de stimulatie, verwijder de draden en Incubeer de kamers voor een andere dag in een incubator ingesteld bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Latere biologische analyses, met inbegrip van de levensvatbaarheid van de cellen en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR) volgens de fabrikant protocol uit te voeren.</li>
</ol>8. in Vivo PPy implantatie
<ol><li>Distale middelste cerebrale slagader (dMCA) occlusie beroerte modellen uitvoeren op T-cel-deficiënte volwassen mannelijke naakt ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) als eerder beschreven2. Uitvoeren van implantatie één week post-dMCA occlusie.</li>
	<li>Een dag voorafgaand aan de operatie, geven de ratten in hun kooi water ampicilline (1 mg/mL).</li>
	<li>Anesthetize van de rat in een inductie kamer met behulp van 0,5 - 3% mg/kg Isofluraan via inhalatie toegediend.</li>
	<li>Bevestig afstomping van de rat door een gebrek aan teen snuifje reflex respons.<ol>
<li>Terwijl het dier onder narcose, en blijven volgen de membraan kleur, patroon van de ademhaling, rectale temperatuur elke 15 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra afstomping is bevestigd, gelden kunsttranen op ogen van rat om te voorkomen dat droogte.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat aseptische techniek wordt gehandhaafd tijdens deze procedure met behulp van steriele handschoenen en een steriele chirurgische draperen13. Steriele chirurgische instrumenten binnen een steriel veld blijven.</li>
	<li>Hoewel de rat onder verdoving is, boren een craniectomy boven de linker cortex. Open de dura.<ol>
<li>Verwijder de dura mater uit de hersenen met behulp van een chirurgische micro-dunne naald.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Implantaat de geleidende steigers van in vitro -systeem op de rat cortex. Opmerking: Voor onze experimenten geïmplanteerd we steigers van in vitro overmorgen 3 hNPC beplating.<ol>
<li>Plaats het implantaat voornamelijk op de penumbral cortex mediale aan de beroerte laesie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat de steiger is geplaatst, plaatst u de surgicel op het implantaat om beweging met huid sluiting te voorkomen.</li>
	<li>Sutuur (geologie) de wond dicht en subcutaan injecteren de ratten met buprenorfine SR bij een dosering van 1 mg/kg om de pijn die gekoppeld stereotaxic chirurgie en dMCA occlusie te beheren.</li>
	<li>Plaats de rat in de kooi van een herstel, zoals het bewustzijn herwint.<ol>
<li>Laat het dier nooit onbeheerd achter terwijl het onbewuste.</li>
		<li>Plaats het dier met anderen niet tot het volledig bewustzijn heeft opgedaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dieren dagelijks op tekenen van pijn met inbegrip van lichaam gewichtsverlies, verminderde voedsel/water inname, verminderde verzorgen/onverzorgde vacht, daalde/verhoogde spontane activiteit, abnormale houding, uitdroging/huid tenting, ingevallen ogen, verbergen, zelfverminking, controleren snelle ademhaling, open mond ademen, spiertrekkingen, trillen, tremor en vocalisatie.<ol>
<li>De dieren dagelijks volgen totdat blijkt dat ze zijn eten, drinken, verzorging en verkrijgen van het gewicht; en dan wekelijks na gewichtstoename.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vroege euthanization via inhalatie van CO2 en een secundaire bevestiging van euthanization (om te zorgen voor het dier zal niet doen herleven als gevolg van normale zuurstof levering bericht CO2 inademing) zal optreden om alle dieren die lijkt te worden niet eten, drinken en verkrijgen van het gewicht na de eerste chirurgische ingreep; verschijnt in pijn; of lijkt niet in staat om te voltooien de gedrags tests als gevolg van een groter dan verwachte motorische cortex tekort.</li>
</ol>

<ol><li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Science+of+Stroke%3A+Mechanisms+in+Search+of+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li>
<li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke%3A+A+Phase+1%2F2a+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li>
<li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Stroke+Therapeutics%3A+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li>
<li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li>
<li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li>
<li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal%2FStem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li>
<li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li>
<li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li>
<li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+Biomaterials%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Clin+Cases%22%5BJournal%5D)">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li>
<li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation%3A+New+Perspectives+in+CNS+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li>
<li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li>
<li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li>
<li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li>
<li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li>
<li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075(2017).</li>
<li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren met dit werk.

Steeds meer aanwijzingen heeft aangetoond dat de belofte van stamcellen als een nieuwe lijn-therapie. Deze belofte heeft geresulteerd in een grote inspanning om de therapeutiek van de stamcel naar het bed met ten minste 40 lopende of afgeronde klinische proeven. Beroerte pathologie biedt een unieke neurologische aandoening die zich voor stamcel therapie, leent omdat na de acute belediging, is er geen neurodegeneratieve-proces voorkomen van herstel. Het exacte mechanisme van stamcel-enhanced beroerte herstel blijft onduid...

Beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en de vijfde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Ondanks deze hoge sterftecijfers nog behandelingen voor herstel van de beroerte momenteel een uitdaging met geen haalbare medische opties die momenteel beschikbaar1. Er zijn momenteel ongeveer 300 klinische proeven omgaan met ischemische beroerte, waarvan slechts 40 stamcellen gebruiken. Eerdere studies hebben aangetoond dat stamcellen therapieën een gunstig effect hebben op beroerte reparatie2,3. Paracrine factoren zoals hersenen-afgeleide neurotrophic factor (BDNF) en Thrombospondine-1 (THBS-1) uitgebracht van getransplanteerde menselijke neurale voorlopercellen (hNPCs) hebben betere functionele herstel aangetoond door middel van de mechanismen die zijn gekoppeld aan een toename van Synapse formatie, angiogenese, dendritische vertakken en nieuwe axonale prognoses, evenals het moduleren van het immuunsysteem4,5,6. Toch blijven de optimale leveringsmethoden van de stamcellen ongrijpbaar.
De cel van de stam van de succesvolle levering naar de hersenen blijft een uitdaging. Op dit moment zijn injecteerbare hydrogel en polymere steigers systemen ingevoerd om te leveren van stamcellen. Deze methoden voor het afleveren stamcellen tijdens transplantatie beschermen evenals bieden bescherming tegen de barre omgeving van na beroerte met inbegrip van de ontstekingsreactie van de host en hypoxische voorwaarden7,8,9 , 10. echter, de meest gebruikte materialen zijn inert, waardoor het gebruik van continue modulatie (d.w.z., elektrische stimulatie) van de cellen11beperkt. Elektrische stimulatie is een richtsnoer dat invloeden van differentiatie, ion kanaal dichtheid, en neurite uitvloeisel van stamcellen12. Ten opzichte van inerte polymeren, kunnen geleidende polymeren dragen een huidige waardoor elektrische stimulatie en manipulatie van stamcellen2. Het precieze mechanisme waarmee elektrische stimulatie neurotrophic factor release (dat wil zeggen, BDNF en THBS-1 moduleert) wordt echter nog niet volledig onderzocht.
In dit protocol beschrijven we de stappen voor het bouwen van een celcultuur, bestaande uit een geleidend polymeer-steiger, polypyrrole (PPy), dat voorziet in in vitro elektrische stimulatie. Vanwege de wijze waarop de celcultuur wordt vervaardigd, is latere innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger op de peri-infarct cortex mogelijk. Voor dit systeem voorwaarde we elektrisch stamcellen op de steiger voor een korte periode vóór. Na elektrische stimulatie, de uitvoering van de cellen geleidend polymeer-steiger is met succes geïmplanteerd intracranially met behulp van een minimaal-invasieve methode.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/mL voor werkmedia</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 verdunning</td></tr><tr><td>LIF Protein, Recom. Hum. (10 &micro;g/mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/mL voor werkmedia</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Glass</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylbenzenesulfonate</td><td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>Bescherm pyrrole-oplossing tegen licht en kamertemperatuur</td></tr><tr><td>8 well glass slide chambers</td><td>Thermo Sci Nuc&nbsp;</td><td>125658</td><td>Los de celkamer los en bewaar deze onder gesteriliseerde omstandigheden</td></tr><tr><td>Flat-Surface Bracket, 3"x1"</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>TWO PART SILVER PAINT 14G</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>1264214</td><td>Meng twee delen (1:1) in een plastic plaat</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td><td>Genesse&nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td><td>Aruna Biomedical&nbsp;</td><td>&nbsp;hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Keysight&nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>Wavefoam generator</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Pt meshes</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>Referentie-elektrode met afmetingen, 1x1 cm</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Hs02718934_s1</td><td></td></tr><tr><td>THBS1</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Hs00962908_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &micro;L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>4369510</td><td></td></tr><tr><td>7-8 Week Old, male, RNU Rats</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon Silk Suture</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Absorbable Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Drape</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Frazier Micro Dissecting Hook</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Stamcel therapie heeft ontpopt als een spannende lijn therapeutische, maar de optimale leveringsmethode blijft onduidelijk. Terwijl de techniek van microinjection hanteert voor het leveren van stamcellen in lijn modellen decennialang, wordt deze techniek beperkt door het gebrek aan vermogen om te manipuleren van de stamcellen vóór injectie. Deze paper detailleert een methode van het gebruik van een elektrisch geleidend polymeer steiger voor levering van de cel van de stam. Elektrische stimulatie van cellen van de stam met behulp van een geleidend polymeer steiger verandert de cel van de stam van genen die betrokken zijn in de overleving van de cel, inflammatoire respons en synaptische remodelleren. Na elektrische voorbehandeling, worden de cellen van de stam op de steiger intracranially in een distale middelste cerebrale slagader occlusie rat model getransplanteerd. Dit protocol beschrijft een krachtige techniek om te manipuleren stamcellen via een geleidend polymeer steiger en maakt een nieuwe tool om de verdere ontwikkeling van stamcel gebaseerde therapie.

Het schema in Figuur 1 afgebeeld vertegenwoordigt de algemene workflow van de elektrische stimulatie van hNPCs en mogelijke downstream toepassingen. Een huidige beperking in stamcel therapie is dat stamcellen worden blootgesteld aan een harde na transplantatie milieu met inbegrip van ontsteking en ischemische voorwaarden. Deze moeilijke omstandigheden waarschijnlijk beperken hun therapeutische werking14,15<...

Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.

Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

Het algemene doel van deze procedure is om een platform te creëren voor in vitro elektrische stimulatie van stamcellen op een geleidend polymeerscaffold, met daaropvolgende in vivo implantatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de beroerte-onderzoek en stamcelbiologie door een middel te bieden om stamcellen te moduleren. Het belangrijkste voordeel is dat de stamcellen in vitro kunnen worden geoptimaliseerd en vervolgens kunnen worden geïmplanteerd.Hoewel deze methode een inzicht kan bieden in beroerteherstel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen als een nieuwe celbezorgmethode. Over het algemeen zullen gebruikers die nieuw zijn met deze techniek worstelen vanwege de precisie die vereist is voor de montage van de celkamer en de techniek die betrokken is bij de craniectomie. Ter voorbereiding, autoclaveer de 2,5 bij 12,5 centimeter metalen platen en de stroomkleppen.Gebruik vervolgens een kamerslide als sjabloon om twee stukken PDMS uit te snijden. Eén stuk dient als omtrek van de perimeter van de kamer. Op het tweede stuk snijdt u twee aangrenzende stukken uit van binnenuit de kamerslide.Beide stukken moeten rechthoekig zijn en overee

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Menselijke perivasculaire stamcellen (PSC's) zijn een nieuwe stamcel klasse voor het skelet weefselregeneratie vergelijkbaar met mesenchymale stamcellen (MSC's). PSC's kunnen worden geïsoleerd door FACS (fluorescentie geactiveerde cel sortering) uit vetweefsel verkregen tijdens standaard liposuctie procedures, dan gecombineerd met een osteoinductief steiger om botvorming te...

Gebruik van de Mens Perivasculaire stamcellen voor botregeneratie

This video demonstrates the procedure of extracellular matrix-derived microcarrier fabrication by electrospraying. These microcarriers simulate the native tissue-specific microenvironment and are stable in long-term 3D in vitro cell culture models.

Bioscaffold Fabrication by Electrospraying: A Technique to Generate Microcarrier Scaffolds Derived from Extracellular Matrix of Decellularized Tissue

Voor het creëren van hoog georganiseerde structuren van complex weefsel, moet men meerdere materiaal- en celtypen samenvoegen tot een geïntegreerd composiet. Dit combinatoire ontwerp bevat orgaanspecifieke gelaagde cellagen met twee verschillende biologisch afgeleide materialen die een sterke vezelachtige matrixbasis bevatten, en endotheelcellen voor het bevorderen van de vorming van nieuwe bloedvaten.

Tissue engineering: Bouw van een Meercellige 3D Steiger voor de levering van Layered Cell Sheets

Dit artikel beschrijft een reeks configuraties voor het zaaien van menselijke mesenchymale stamcellen op materialen, in dit geval geëlektrospunnen garens, die de basis van standaard kweekputjes niet bedekken om het aantal cellen dat aanvankelijk hecht te maximaliseren en te kwantificeren in vergelijking met de bekende zaaidichtheid.

Het optimaliseren van Bevestiging van menselijke mesenchymale stamcellen op Poly (ε-caprolacton) elektrogesponnen Yarns

Hier presenteren we een protocol om elektrogesponnen nanovezel steigers met gradated organisatie van vezels fabriceren en hun toepassingen verkennen in het reguleren van de cel morfologie / oriëntatie. Verlopen met betrekking tot fysische en chemische eigenschappen van de nanovezel scaffolds biedt een grote verscheidenheid aan toepassingen op biomedisch gebied.

Electrospun Nanovezel Steigers met gradaties in Fiber Organisatie

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

Dit artikel presenteert een strategie voor het bouwen van eindige-elementenmodellen van vezelige geleidende materialen die zijn blootgesteld aan een elektrisch veld (EF). De modellen kunnen worden gebruikt om de elektrische input te schatten die cellen die in dergelijke materialen zijn gezaaid, te schatten en de impact te beoordelen van het veranderen van de materiaaleigenschappen, structuur of oriëntatie van de steiger.

Eindige element modellering van een cellulair elektrisch micromilieu

Deze studie presenteert een protocol voor het vervaardigen van 3D-biogeprinte steigers voor chronische wondgenezing. Extracellulaire blaasjes worden geïsoleerd uit mesenchymale stamcellen en in de kern (alginaat) geladen met het omhulsel gemaakt van carboxymethylcellulose en alginaatlyase. Dit ontwerp maakt gecontroleerde degradatie van steigers en efficiënte vrijlating van EV's mogelijk.

Optimalisatie van de afgifte van extracellulaire blaasjes met behulp van een 3D-gebioprinte steiger met kernomhulsel voor chronische wondbehandeling

Leer hoe u stamcellen zaait op een geleidend polymeersteiger voor in vitro elektrische stimulatie en minimaal invasieve in vivo-implantatie. Deze methode optimaliseert stamcelgedrag voor beroerteonderzoek.

Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Meer video's verkennen