Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen
13 april 2018
Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.
Het algemene doel van deze procedure is om een platform te creëren voor in vitro elektrische stimulatie van stamcellen op een geleidend polymeerscaffold, met daaropvolgende in vivo implantatie. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de beroerte-onderzoek en stamcelbiologie door een middel te bieden om stamcellen te moduleren. Het belangrijkste voordeel is dat de stamcellen in vitro kunnen worden geoptimaliseerd en vervolgens kunnen worden geïmplanteerd.
Hoewel deze methode een inzicht kan bieden in beroerteherstel, kan deze ook worden toegepast op andere systemen als een nieuwe celbezorgmethode. Over het algemeen zullen gebruikers die nieuw zijn met deze techniek worstelen vanwege de precisie die vereist is voor de montage van de celkamer en de techniek die betrokken is bij de craniectomie. Ter voorbereiding, autoclaveer de 2,5 bij 12,5 centimeter metalen platen en de stroomkleppen.
Gebruik vervolgens een kamerslide als sjabloon om twee stukken PDMS uit te snijden. Eén stuk dient als omtrek van de perimeter van de kamer. Op het tweede stuk snijdt u twee aangrenzende stukken uit van binnenuit de kamerslide.
Beide stukken moeten rechthoekig zijn en overeenkomen met de kamerslide. Nu, stapelen de materialen. Begin met de metalen plaat, vervolgens de ongesneden PDMS, vervolgens de polypyrrole plaat, loodrecht georiënteerd, vervolgens de PDMS met uitsparingen en ten slotte de celkamer.
Lign de lagen zorgvuldig en klem het apparaat samen. Snijd vervolgens twee stukken metaaldraad om het apparaat tot aan de buitenkant van de incubator te laten reiken die het zal bevatten. Lengtes van 60 centimeter zijn meestal lang genoeg.
Gebruik vervolgens zilverpasta om een draad aan elk uiteinde van de polypyrrole plaat te bevestigen die uit de buitenkant van de kamer steekt. Zodra de zilverpasta is uitgehard, versterk en verzegel de verbindingen met epoxy. Noteer nu de weerstand over de assemblage met een multimeter.
Het toegepaste veld moet in elke kamer hetzelfde zijn. Plateer vervolgens de cellen op de assemblage en stimuleer ze elektrisch zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder voorafgaand aan het implanteren van de cellen de draden van de assemblage.
Ontgrendel vervolgens de celkamers en scheid de PDMS van het geleidende scaffold. Het scaffold is nu klaar voor implantatie. Eén dag voorafgaand aan de operatie, geef het dier ampicillien in zijn drinkwater.
Op de dag van de operatie, verdoof de rat met isofluraan en bevestig de anesthesie met een teenprik. Breng nu kunstmatige tranen aan in de ogen van de rat om ze vochtig te houden. Na het scheren van de schedel, draag het dier en zet op voor een steriele operatie.
Draag beschermende kleding, pak de gesteriliseerde gereedschappen uit en steriliseer de hoofdhuid. Voor de craniectomie, boor een gat boven de linkercortex tot aan de hersenvlies. Maak de opening iets groter dan 1 bij 3 millimeter, de grootte van het implantaat.
Open vervolgens het duur en verwijder het hersenvlies van de hersenen met behulp van een microdun chirurgisch naald. Verwijder de rig uit de TC-cultuur incubator en schakel de rigs uit. Implanteer vervolgens voorzichtig het geleidende scaffold van het in vitro systeem op de rat cortex.
Bedek vervolgens het implantaat met Surgicel om het te beveiligen, anders kan het tijdens het sluiten van de huid bewegen. Naai nu de wond dicht met 4-0 zijden draad. Na het voltooien van de hechtingen, injecteer de ratten subcutaan met buprenorfine SR. Plaats vervolgens de rat in een herstelkooi totdat het bij bewustzijn komt.
De postoperatieve procedure is gedetailleerd in het tekstprotocol. Menselijke neurale progenitorcellen werden blootgesteld aan elektrische stimulatie en vervolgens gekleurd met celviabiliteitsassays. De groene kleur is kenmerkend voor een levende cel.
De cellen waren duidelijk in staat om de elektrische stimulatie te overleven. Factoren die vrijkomen van de neuro-progenitorcellen die belangrijk zijn bij herstel na een beroerte werden geëvalueerd uit een microgram totaal RNA met behulp van kwantitatieve RTPCR. Na het normaliseren van de resultaten met behulp van de delta delta cyclusdrempelmethode, blijkt dan dat de blootstelling aan elektrische stimulatie de BDNF en THBS1 expressie up-reguleerd.
Na het bekijken van deze procedure, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een celcultuursysteem kunt creëren voor elektrisch geleidende stamcellen en de daaropvolgende implantatie van die stamcellen in een rattenmodel. Zodra het is beheerst, kan de procedure in 45 minuten worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Terwijl u deze procedure probeert, is het belangrijk om altijd de dieren te controleren op een goed ademhalingspatroon en membraankleur, om een goede anesthesie te garanderen.
Vergeet niet dat het werken met ratten en stamcellen gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van de juiste PPE, moeten altijd worden genomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de vervaardiging van een celkweeksyteem voor het zaaien van stamcellen op een geleidend polymeer steigerwerk. Het maakt in vitro elektrische stimulatie en daaropvolgende in vivo implantatie mogelijk met behulp van een minimaal invasieve techniek.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelbiologie
- Elektrische stimulatietechnieken
Achtergrond
- De methode is erop gericht stamcellen te optimaliseren voor onderzoek naar herstel na een beroerte.
- Het biedt een nieuwe benadering om het gedrag van stamcellen te moduleren.
- Precisie is cruciaal voor een succesvolle assemblage van de celkamer.
- Omvat een minimaal invasieve craniectomie-techniek voor implantatie.
Doel van de studie
- Om een platform te creëren voor in vitro elektrische stimulatie van stamcellen.
- Om de implantatie van geoptimaliseerde stamcellen in vivo te faciliteren.
- Om toepassingen in stroke-onderzoek en andere systemen te verkennen.
Gebruikte methoden
- Fabricage van een geleidend polymeer steigerwerk.
- Uitzaaien van stamcellen op het steigerwerk.
- In vitro elektrische stimulatie van de stamcellen.
- Minimaal invasieve implantatietechniek.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle optimalisatie van stamcellen voor implantatie.
- Inzichten in de modulatie van het gedrag van stamcellen.
- Potentiële toepassingen bij herstel na een beroerte en methoden voor celtoediening.
- Geïdentificeerde uitdagingen voor nieuwe gebruikers met betrekking tot precisie en techniek.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol instrument voor stamcelonderzoek.
- Het vergroot het begrip van de mechanismen achter herstel na een beroerte.
- Verdere exploratie zou kunnen leiden tot vooruitgang in de celtherapie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Elektrisch geleidende scaffolds voor de aflevering van stamcellen bieden een novum platform om het cel-fenotype vóór transplantatie te moduleren, wat een cruciale uitdaging in de regeneratieve geneeskunde en neurologische ziektemodellering aanpakt. Deze aanpak maakt in vitro optimalisatie van stamcelegenschappen mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van daaropvolgende in vivo studies en een risico-geoptimaliseerde voortgang in preklinische trajecten faciliteert. De modulariteit van de methode maakt deze bruikbaar als een herbruikbare capaciteit voor diverse toepassingen binnen de celtherapie en weefseltechnologie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de reactie van stamcellen op elektrische signalen, waardoor mechanistische routes die relevant zijn voor celoverleving en neuroregeneratie worden verduidelijkt.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door pre-implantatie modulatie en beoordeling van genexpressie die gekoppeld is aan therapeutische uitkomsten mogelijk te maken.
- Faciliteert functionele validatie van targets door in vitro preconditioning te correleren met in vivo prestaties in ziektemodellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gestandaardiseerde, elektrisch geconditioneerde stamcelpopulaties voor voor reproduceerbare downstream-assays.
- Maakt kwantitatieve beoordeling van genexpressie en cellevensvatbaarheid na stimulatie mogelijk, ter ondersteuning van assayontwikkeling.
- Biedt een platform voor schaalbare evaluatie van scaffold- en stimulatieparameters over verschillende celtypen heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro celmodulatie aan ziekte-relevante in vivo modellen, wat de ontdekking van translationele biomarkers ondersteunt.
- Maakt continuïteit mogelijk van celoptimalisatie in de ontdekkingsfase tot preklinische validatie in modellen van neurologisch letsel.
- Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen door preconditioning-effecten te koppelen aan functionele resultaten na implantatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door in vitro stemcelmodulatie mogelijk te maken, gevolgd door in vivo testen in ziektemodellen zoals een beroerte. Het ondersteunt iteratieve optimalisatie en vergelijkende analyses over verschillende experimentele condities.
- Discovery Biology: Biedt een platform voor hypothesetoetsing naar de impact van elektrische stimulatie op het fenotype en de genexpressie van stamcellen.
- Screening: Levert reproduceerbare, geconditioneerde celpopulaties voor downstream functionele assays.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van genexpressie en viabiliteit mogelijk, ter ondersteuning van datagestuurde besluitvorming.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro optimalisatie en in vivo efficiëntiestudies in relevante diermodellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een modulaire workflow die aanpasbaar is aan diverse celtypen en therapeutische contexten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de resultaten van celtherapie door pre-implantatiemodulatie en -beoordeling mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Standaardiseert protocollen voor celpreparatie en stimulatie, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid worden verbeterd.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen door in vitro optimalisatie te koppelen aan in vivo prestaties.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van celtherapiemodellen en toedieningsmodaliteiten.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in celkweek, elektrische stimulatie en chirurgie bij kleine dieren.
- Vereist nauwkeurige assemblage van meerlaagse celkamers en geleidende steunstructuren.
- Vereist gevalideerde instrumentatie voor elektrische stimulatie en kwantitatieve analyse van genexpressie.
- Standaardisatie tussen teams is essentieel voor reproduceerbaarheid over experimenten en locaties heen.
- Aanpassing aan andere celtypen of ziektegetrouwe modellen kan protocoloptimalisatie en validatie vereisen.
