Name: De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van humane epicardiale cellen voor hartonderzoek. Deze methode onderzoekt epitheliaal-mesenchymale transitie en celgedrag tijdens cardiale ontwikkeling en ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (VENI 016.146.079) en een onderzoek van het LUMC fellowship zowel AMS en LUMC Bontius Stichting (MJG).

Alle experimenten met menselijke weefsels exemplaren werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Leids Universitair Medisch centrum en voldoet aan de verklaring van Helsinki. Alle stappen worden uitgevoerd met steriel injectiemateriaal in een cel cultuur stroom kabinet.
1. voorbereiding
<ol><li>Bereid EPDC medium door het mengen van Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM low-glucose) en Medium 199 (M199) in een 1:1 verhouding. Voeg 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS, warmte geïnactiveerd gedurende 25 minuten op 56 ° C) en aan te vullen met 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine. Vooraf warm het medium van de EPDC in een waterbad 37 ° C.</li>
	<li>Vooraf warm trypsine 0.25%/EDTA (1:1) in een waterbad 37 ° C.</li>
	<li>Jas putjes met gelatine. 0,1% gelatine/PBS toevoegen aan elk putje en Incubeer de platen gedurende ten minste 15 minuten bij 37 ° C. Richtsnoeren voor de vereiste cel cultuur plaat zijn samengevat in tabel 1. Verwijder voorzichtig alle vloeistof voordat plating cellen.</li>
	<li>Voorbereiden van een stamoplossing van 10 mM SB431542 (SB), verdund in DMSO (voorzichtig). Breng 50 µL aliquots in conische bodem polypropyleen centrifuge buizen, zoals Eppendorf buizen, en bewaar ze bij-20 ° C. Merk op dat de SB aliquots slechts eenmaal kunnen worden ontdooid.</li>
</ol>2. ophalen en opslag van volwassen en foetale hart Specimens
<ol><li>Opslaan van menselijke volwassen auricles direct na verwijdering tijdens de operatie in een tube van 50 mL met 15 mL high-glucose DMEM met 10% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine bij 4 ° C. Monsters zijn over het algemeen 3-5 cm groot en kan worden opgeslagen tot 48u na dissectie.</li>
	<li>Opslaan van foetale hart verkregen electieve abortus materiaal in EPDC medium bij 4 ° C tot 24 h na isolatie. Voor dit protocol, door monsters te gebruiken met een zwangerschapsduur tussen 12-22 weken. Merk op dat het hele hart kan worden gebruikt voor isolatie van de Epicard.</li>
</ol>3. isolatie van de Epicardial laag
<ol><li>In de laminaire flow kabinet, bereiden een 100-mm-celkweek schotel met PBS en plaats een aparte droplet (~ 200 µL) van PBS in het deksel. Vul een buis 15 mL met 5 mL voorverwarmde EPDC medium.</li>
	<li>Plaats het weefsel in de cultuur van de cel schotel gevuld met PBS. Zorg ervoor dat het weefsel wordt bevochtigd vaak tijdens de procedure.</li>
	<li>Met behulp van een stereomicroscoop, Verwijder zo veel van de epicardial laag uit het weefsel monster mogelijk door peeling het uitschakelen met behulp van de verlostang. Opmerking: De Epicard kan worden herkend als een zeer dunne, transparante laag strak aan de buitenkant van het hart (figuur 1A vastgehouden). Probeer te voorkomen dat besmetting met epicardial adipeus weefsel en bloedvaten aangezien dit het isolement belemmeren zal.</li>
	<li>Het verzamelen van stukken van epicardial weefsel in de druppel van PBS op de deksel.</li>
	<li>Snijd het epicardial weefsel in kleine stukjes (0,5 mm3) met behulp van een scalpel (figuur 1B), of het gebruik van de scherpe toppen van kleine pincet. Merk op dat de stukken moeten kunnen passeren een P1, 000 Pipetteer tip (stap 3.6).</li>
	<li>Voeg 1 mL trypsine aan het epicardial weefsel en het verzamelen van de stukken en trypsine met een P1, 000 Pipetteer tip. Breng het weefsel in een 1.5-mL conische centrifugebuis (Figuur 1 c).</li>
	<li>Incubeer de buis in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten, terwijl het schudden bij een ~ 60 rpm.</li>
	<li>De buis te verwijderen uit het waterbad en reinig de buitenkant van de buis met 70% ethanol.</li>
	<li>Het toestaan van het weefsel te zinken naar de bodem van de buis (Figuur 1 d) zorgvuldig het supernatant met epicardial cellen die de 15 mL tube met 5 mL EPDC medium om de inactivering van de trypsine.</li>
	<li>Aanvullen van het resterende weefsel in de conische centrifugebuis met 1 mL trypsine en meng door zachtjes op en neer pipetteren.</li>
	<li>Herhaal stap 3,7 tot en met 3.10 twee keer. Bij de laatste stap, na een totaal van 30 min van trypsine incubatie, overdracht van zowel het supernatant en het resterende epicardial weefsel in de buis met EPDC medium.</li>
	<li>Wanneer alle cellen zijn verzameld in EPDC medium, voorzichtig passeren de opschorting een 10 mL spuit met een 19-gauge naald in een nieuwe 15 mL-buis aan de cellen (figuur 1E) mechanisch te distantiëren. Opmerking: Zorg ervoor dat de schorsing Meng door pipetteren op en neer voordat dit wordt doorgegeven van de oplossing door de naald om te voorkomen dat de naald steeds belemmerd.</li>
	<li>Als u wilt verder distantiëren van de cellen, herhaalt u stap 3.12 met een naald 21-gauge.</li>
	<li>Plaats een 100-µm cel zeef boven op een buis van 50 mL en breng het medium met de epicardial cellen op de zeef met behulp van een pipet 10 mL voor het verwijderen van alle resterende klontjes (figuur 1F).</li>
	<li>Wassen van de zeef voor het verzamelen van de resterende cellen door pipetteren 5 mL EPDC medium naar de zeef.</li>
	<li>Pipetteer de celsuspensie uit de buis 50 mL in een buis 15 mL. Aangezien cellen naar de bodem van de buis zinken, schud de oplossing voorzichtig voordat pipetteren. Opmerking: Hoewel deze stap niet nodig is, helpt een kleinere buis visualisatie van de pellet na het centrifugeren.</li>
	<li>Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (figuur 1G).</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel (Figuur 1 H) in de vereiste hoeveelheid EPDC medium (tabel 1). Opmerking: Voor foetale EPDCs, direct EPDC medium met 10 µM van het ALK5 kinase inhibitor van de omwenteling (EPDC + SB) gebruiken. Volwassen cellen kunnen verguld worden zonder SB tijdens de eerste passage.</li>
	<li>Plaat van de celsuspensie op de gelatine gecoat cultuur platen (figuur 1I). De grootte van de put is afhankelijk van de grootte van de steekproef van epicardial weefsel (tabel 1). Merk op dat een lage confluentie het vóórkomen van EMT zal veroorzaken.</li>
	<li>De cellen in de incubator voor ten minste 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2 om de cellen te hechten aan de cultuur plaat plaatsen.</li>
</ol>4. cultuur van EPDCs
<ol><li>Vullen het EPDC + SB medium minstens om de 3 dagen.</li>
	<li>Inspecteer de cellen minstens om de 3 dagen met behulp van de Microscoop. Wanneer de cellen bereiken confluentie, passage dat wil zeggen, wanneer de cultuur plaat is volledig bedekt met cellen, de cellen in een oppervlakte verhouding van 1:2. Confluentie bereiken kunt ~ 5-10 dagen duren.<ol>
<li>Het medium met een pipet of een aspiratie systeem, bijvoorbeeldeen glazen pipet gecombineerd.</li>
		<li>De cellen zorgvuldig wassen door PBS toe te voegen aan de cellen. Zachtjes swirl van de plaat en de PBS gecombineerd.</li>
		<li>Trypsine toevoegen aan de plaat. Zachtjes draaien de plaat om te dekken alle cellen met trypsine en Incubeer de plaat voor 1 min bij 37 ° C. Opmerking: Gebruik als weinig trypsine mogelijk (indicatie: 200 µL per putje van een 6 goed plaat)</li>
		<li>Tik op de plaat om mechanisch loskoppelen van de cellen vanaf de onderkant van de plaat. Gebruik de Microscoop visueel controleren als cellen hebben losgemaakt. Als dat niet het geval is, wordt de cel cultuur plaat Incubeer gedurende een minuut extra.</li>
		<li>De vereiste hoeveelheid EPDC + SB medium aan de cellen toevoegen, resuspendeer door pipetteren op en neer en de celsuspensie overbrengen in een nieuwe gelatine gecoat cultuur plaat. Opmerking: In het algemeen, cellen kunnen worden bewaard in een geplaveide morfologie tot passage 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. de inductie van EMT in EPDCs
<ol><li>Om te induceren EMT, de cellen met trypsine en de overdracht de cellen die moeten nieuwe gelatine gecoat putten in een verhouding 1:2 oppervlakte in EPDC + SB medium, als omschreven in 4, en incubeer gedurende ten minste 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2te distantiëren.</li>
	<li>Selectievakje is als confluency 50-70% en als EPDCs een geplaveide morfologie hebben. Opmerking: Confluentie heeft invloed op het vermogen van EPDCs om het ondergaan van de EMT.</li>
	<li>Het medium van de cellen gecombineerd en wassen van de cellen zorgvuldig met PBS (zie stap 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stimuleren van de cellen met 1 ng/mL TGFβ3 in EPDC medium en plaats ze in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 voor 5 dagen. Merk op dat tijdens de stimulatie, het medium van de EPDC met TGFβ3 niet hoeft te worden aangevuld.</li>
	<li>De cellen dagelijks controleren. Na 5 dagen, worden cellen die onderging EMT herkend door een spindel-vormig morfologie (figuur 2A).</li>
	<li>Cultuur spindel-vormig EPDCs volgens de methode beschreven in 4 zonder toevoeging van SB of TGFβ aan het EPDC medium. Merk op dat in het algemeen, spindel-vormig EPDCs kan worden gekweekt tot passage 20.</li>
	<li>Het vóórkomen van EMT met immunefluorescentie kleuring valideren met behulp van antilichamen tegen de mesenchymale markeringen αSMA of Vimentin of door phalloidin de vorming van F-actine stress vezels (figuur 2B), of met behulp van qRT-PCR voor EMT-gerelateerde genen ( bijvoorbeeld, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-cadherine, MMP3, slak, Slug) (2C van de figuur en tabel 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
<li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Heart+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li>
<li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li>
<li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor%2C+FGFR-1%2C+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li>
<li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li>
<li>Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li>
<li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation%2C+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li>
<li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li>
<li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li>
<li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
<li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li>
<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
<li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF%CE%B2-signaling+and+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li>
<li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+Supplements%22%5BJournal%5D)">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te isoleren en cultuur primaire epicardial cellen afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart. Uitgebreide karakterisering van deze cellen geweest eerder gepubliceerde17. We hebben aangetoond dat beide celtypes kunnen worden gehandhaafd als epitheliale cellen van de kasseien-achtige wanneer gekweekt met het ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT is een integraal onderdeel van het epicardial activatie in vivo tijdens zowel de ontwikkeling a...

De Epicard, een eencellige epitheliale laag dat enveloppen het hart, is van vitaal belang voor de ontwikkeling van de cardiale en reparatie (herzien in Smits et al. 1). ontwikkelingsachterstand, de Epicard vloeit voort uit de proepicardial-orgel, een kleine structuur gelegen aan de voet van het ontwikkelende hart. Rond ontwikkelings dag E9.5 in muis en 4 weken na conceptie in mens beginnen cellen om te migreren van deze structuur van bloemkool en dekken de ontwikkelende myocard-2. Zodra een eencellige epitheliale laag wordt gevormd, ondergaat een deel van de epicardial cellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT). Tijdens de EMT, cellen verliezen hun epitheliale kenmerken, zoals de cel verklevingen, en krijgen een mesenchymale fenotype die geeft hen de capaciteit om te migreren naar de ontwikkelingslanden myocard. De gevormde epicardial afgeleide cellen (EPDCs) kunnen onderscheiden in verschillende cardiale celtypen, met inbegrip van de fibroblasten, zachte spiercellen, en potentieel cardiomyocytes en endotheliale cellen3, hoewel de differentiatie van de laatste twee cell bevolking blijft onderhevig aan debat (herzien in Smits et al. 4). bovendien de Epicard biedt leerzame paracrine signalen naar het myocardium te reguleren zijn groei en vascularisatie5,6,7,8. Meerdere studies hebben aangetoond dat verminderde epicardial formatie tot ontwikkelingsstoornissen gebreken in de hartspier9,10, therapieën11en geleiding systeem12 leidt, nadruk op de essentiële bijdrage van de Epicard tot de vorming van het hart.
Hoewel in het volwassen hart de Epicard aanwezig als een slapende laag is, wordt het geactiveerd op ischemie13. Epicardial reactivering na letsel recapituleert verscheidene van de processen beschreven voor cardiale ontwikkeling, met inbegrip van proliferatie en EMT14, zij het minder efficiënt. Interessant, hoewel het exacte mechanisme niet volledig begrepen is, de bijdrage van de epicardial te repareren kan worden verbeterd door behandeling met, bijvoorbeeld, Thymosin β415 of wijziging van VEGF-A mRNA16, wat resulteert in verbeterd cardiale functie na een myocardinfarct. De Epicard wordt derhalve geacht voor een interessante bron van de cel om endogene reparatie van de gewonde hart.
Mechanismen van de cardiale ontwikkeling zijn het vaak gerecapituleerd tijdens letsel, hoewel op een minder efficiënte wijze. Op zoek naar epicardial activators is het primordiaal dat wij kunnen bepalen en vergelijken van de volledige capaciteit van de foetale en volwassen Epicard. Bovendien, van een therapeutisch oogpunt, het is belangrijk dat we naast dierproeven, kennis over de reactie van de menselijke Epicard uitbreiden. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur van de menselijke volwassen en foetale epicardial afgeleide cellen (EPDCs) in een epitheliale-cel-achtige morfologie en voor het opwekken van de EMT. Met dit model willen we verkennen en vergelijken volwassen en foetale epicardial cel gedrag.
Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van menselijke epicardial materiaal, dat is niet grondig onderzocht. Nog belangrijker is, biedt het beschreven isolatie en cel cultuur-protocol één uniforme methode om beide foetale en volwassen kasseistrook EPDCs, waardoor een directe vergelijking tussen deze twee mobiele bronnen worden afgeleid. Bovendien, aangezien de Epicard geïsoleerd op basis van de locatie is, het is ervoor gezorgd dat de cellen eigenlijk epicardially afgeleide17.
Menselijke EPDC isolatie methoden zijn eerder vastgesteld, afhankelijk deze meestal van uitgroei protocollen waar stukken van cardiale of epicardial weefsel zijn verzinkt op een cel cultuur schotel18,19. Deze aanpak kiest waardoor specifiek voor cellen die gedeeltelijk verliezen hun epitheliale fenotype om te migreren, en die zijn meer vatbaar voor spontane EMT ondergaan. In het huidige protocol, wordt eerst de Epicard verwerkt tot een enkele cel-oplossing waarmee de geïsoleerde EPDCs hun epitheliale toestand te handhaven. Deze methode biedt daarom een solide in vitro model voor het bestuderen van epicardial EMT.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&micro;L Filtered Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Of zelfgemaakte en gesteriliseerde</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Needles 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieves, 100 &micro;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;3&nbsp;</td><td>R&amp;D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma</td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

de isolatie en de cultuur van de primaire epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart specimens

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

De Epicard, een epitheliale cellaag die betrekking hebben op het myocardium, heeft een essentiële rol tijdens de ontwikkeling van de cardiale, alsmede in het antwoord van de reparatie van het hart na ischemische schade. Wanneer geactiveerd, ondergaan epicardial cellen een proces dat bekend staat als epitheliale mesenchymale overgang (EMT) om cellen aan de regeneratie myocard. Bovendien draagt de Epicard via secretie van essentiële paracrine factoren. Om ten volle waarderen de regeneratieve potentieel van de Epicard, is een menselijke cel model vereist. Hier duidelijk naar voren komt een nieuwe cel cultuur model voor het primaire epicardial afgeleide cellen (EPDCs) ontlenen menselijke volwassen en foetale cardiale weefsel. Isoleren EPDCs, is de Epicard ontleed aan de buitenkant van het hart model en verwerkt tot een enkele celsuspensie. Vervolgens zijn EPDCs verzinkt en gekweekt in EPDC medium met de ALK 5-kinase inhibitor SB431542 om hun epitheliale fenotype. EMT wordt geïnduceerd door stimulatie met TGFβ. Deze methode activeert, voor de eerste keer, de studie van het proces van menselijke epicardial EMT in een gecontroleerde omgeving, en vergemakkelijkt meer inzicht verwerven in de secretome van EPDCs die kan steun hart regeneratie. Bovendien voorziet deze uniforme aanpak in directe vergelijking van menselijke volwassen en foetale epicardial gedrag.

We schetsen hier, een eenvoudig protocol om EPDCs isoleren van menselijke volwassen en foetale cardiale weefsel (Figuur 1). Dit protocol maakt gebruik van de gemakkelijk toegankelijke locatie van de Epicard aan de buitenkant van het hart (figuur 1A). Kleuring van de oorschelp hart na dissectie toont aan dat de WT1 + Epicard wordt verwijderd terwijl de onderliggende subepicardial extracellulaire matrix en myocard weefsel intact (<...

De Epicard speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en het herstel van het hart door het verstrekken van cellen en de groei factoren op de myocardiale wand. Hier beschrijven we een methode om cultuur menselijke primaire epicardial cellen, die het mogelijk de studie en vergelijking van de kenmerken van hun ontwikkelings- en volwassen maakt.

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Het algemene doel van deze procedure is om humane epicard-afgeleide cellen te isoleren en te kweken om epicard-celgedrag te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van hartonderzoek, zoals hoe het epicard wordt geactiveerd tijdens hartontwikkeling en -ziekte. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden toegepast op humane hartweefselmonsters, wat kan helpen bij het vertalen van resultaten naar een klinische setting.Ons protocol beschrijft de onderzoek van epitheliale naar mesenchymale overgang van epicard-afgeleide cellen. Het kan echter ook worden gebruikt om proliferatie of secretie van factoren te bestuderen. Om te beginnen, vul een 100-millimeter celkweekschotel met PBS in de laminaire stroomkast.Plaats ongeveer 200 microliter PBS in het deksel en voeg vervolgens 5 milliliter voorverwarmd EPDC-medium toe aan een 15-milliliterbuis. Plaats het hartweefsel, geïsoleerd uit een volwassen menselijk hart, in de schaal. Gebruik onder een stereomicroscoop een pincet om voorzichtig de epicardiale laag te verwijderen.Verzamel vervolgens de stukken epicardiale weefsel in het deksel en gebruik een scalpel om ze in stukken

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.

Isoleren Primaire Melanocyte-achtige cellen van de Muis van het Hart

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Hier beschrijven we methoden voor het isoleren van primaire muis epicardiale cellen door middel van een uitgroei-kweektest en het beoordelen van de functionele migratie van epicardiale-afgeleide cellen (EPDC) met behulp van een ex vivo hartkweeksysteem. Deze protocollen zijn geschikt voor het identificeren van genetische en chemische modulatoren van epicardiale epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) en mobiliteit.

Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie

Het epicardium is een essentiële bron van multipotente cardiovasculaire stamcellen en paracriene factoren die nodig zijn voor cardiovasculaire ontwikkeling en regeneratie. We beschrijven hier een methode om muis embryonale epicardiale cellen te kweken.

In Vitro Cultuur van epicardiale cellen uit muis embryonale Heart

Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 - pericyten en CD34 + CD146 - adventitia-cellen van de menselijke hartspier.

Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Het doel van dit werk is het ontwikkelen van een methode om cardiomyocyten reproduceerbaar te isoleren van het volwassen hart en het DNA-gehalte en nucleatie te meten.

Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

We presenteren een protocol voor de isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen uit rattenharten door sequentiële weefselvertering in een spijsverteringsbuffer, celverzameling uit terugkerende centrifugecycli en celzuivering met behulp van antiratten-CD31 microbeads.

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Leer de isolatie en cultuur van humane epicardiale cellen voor hartonderzoek. Deze methode onderzoekt epitheliaal-mesenchymale transitie en celgedrag tijdens cardiale ontwikkeling en ziekte.

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

Meer video's verkennen