Name: Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer een eenvoudige stroomcytometrie-gebaseerde methode om antilichaamafhankelijke versterking van Dengue-virusinfectie te meten met Zika-virusherstelserum. Dit protocol helpt bij het onderzoek naar kruisreactieve antilichamen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het beschreven project werd gesteund door fondsen van de Uniformed Services University van de gezondheidswetenschappen aan JJM. De adviezen of beweringen hierin zijn de privé van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of reflecterende de standpunten van het Department of Defense, de Uniformed Services University van de Health Sciences of enige andere instantie van de VS Regering.
WGV alle experimenten uitgevoerd en analyseren van de gegevens; JJM ontworpen en begeleid de studie; WGW en JJM schreef het papier.

De serummonsters gebruikt om aan te tonen van het protocol die hier beschreven werden verkregen rhesus makaken die gehuisvest en verzorgd volgens lokale, staat en federale beleid in een vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care waren International (AAALAC)-geaccrediteerde faciliteit. Alle dierproeven zijn gecontroleerd en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité en monsters werden verworven door middel van een weefsel protocol voor het delen.
1. dag 1
Opmerking: Alle hieronder beschreven in een steriele laminaire flow bioveiligheid kabinet gebruikt voor weefselkweek in het laboratorium van een BSL-2 stappen uitgevoerd.
<ol><li>Ontdooi de serummonsters bij kamertemperatuur en breng 100 µL van elke serummonster aan een steriele buis. Warmte inactivering gedurende 30 minuten op 56° C in een waterbad of een temperatuur-verstelbare thermomixer. Maken 10-fold seriële verdunningen van het serummonster variërend van 1:1 tot 1:1,000 met behulp van koude RPMI-10 (RPMI met 10% foetale runderserum).</li>
	<li>Breng 10 µL van serieel verdunde serummonster aan elk putje van een steriele 96-Wells-V-bodemplaat. Twee reeksen controleputjes, RPMI-10 met RVP bevatten alleen en zonder serummonster, en RPMI-10 alleen zonder RVP en zonder serummonster. Elke serummonster en RPMI-10 controles in triplicates instellen.</li>
	<li>Verwijderen van de Dengue-1, 2, 3 en 4 RVP uit de diepvries-80 ° C en de dooi hen in een waterbad 37 ° C. Overdracht van de ontdooide RVP onmiddellijk aan het ijs. Verkrijgen van ongeveer 170 µL RVP voor elke serummonster (10 µL van RVP x 3 putten voor elke serumverdunning (1:1, 1:10, 1:100, 1:1, 000) en 10 µL van RVP x 3 putten voor elk van de RPMI-10 met RVP controle alleen wells).</li>
	<li>Pipetteer 10 µL van RVP in elk van de 96-Wells V-bodemplaat met het serummonster en met de RPMI-10 met de RVP (geen serum)-controleputjes. Voeg geen RVP aan de RPMI-10 alleen (geen serummonster en geen RVP) wells. Meng grondig door omhoog en omlaag pipetteren 5 tot 10 keer. Voeg 10 µL koude RPMI-10 in plaats van de RVP aan elke koude RPMI-10 slechts (geen serummonster en geen RVP) controle putten.</li>
	<li>De 96-Wells-V-bodemplaat overbrengen in een incubator en de plaat Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2. Terwijl de 96-Wells-V-bodemplaat is aan het broeden, het reinigen van het oppervlak van het biosafety kabinet met 70% ethanol en uitvoeren van het UV-licht gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Een volledig confluente T75 kolf van K562 cellen verwijderen uit de incubator, meng de cellen goed met behulp van een steriele 5 mL-pipet en 5 mL van cellen overbrengen in een steriele 15 mL conische buis. Opmerking: De K562 cellen zijn onderhouden in RPMI-10 en overgeënt op 1 x 106/mL.</li>
	<li>Het aantal cellen tellen 10 µL cellen verwijderen uit de conische buis van steriele 15 mL en meng met 10 µL tryphan blauw. Met behulp van een hemocytometer om te bepalen van het totale aantal cellen in de conische tube van 15 mL cellen tellen.</li>
	<li>De 15 mL kegelvormig met cellen bij ~ 1.200 x g gedurende 10 minuten centrifugeren, decanteren van het supernatant en resuspendeer de cellen in de warme RPMI-10 bij een concentratie van 80.000 cellen/30 µL van media (2,66 x 106 cellen /mL).</li>
	<li>De 96-Wells-V-bodemplaat verwijderen uit de incubator (stap 1.6), breng 30 µL van K562 cellen aan elk putje van de 96-Wells-V-bodemplaat en meng door omhoog en omlaag pipetteren 5 tot 10 keer. De 96-Wells-V-bodemplaat overbrengen in een incubator en de plaat Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2.</li>
	<li>Na incubatie gedurende 1 uur, door de 96-Wells-V-bodemplaat van de incubator en centrifuge op ~ 1.200 x g gedurende 5 minuten te verwijderen. Na het centrifugeren, decanteren in de media van de putten door te draaien aan de plaat ondersteboven in een container met 10% bleekwater.</li>
	<li>Wassen van de cellen in elk putje door resuspending hen in 125 µL van warme RPMI-10, meng met een pipet en centrifugeer de plaat bij ~ 1.200 x g gedurende 5 min. Decant de media door te draaien aan de plaat ondersteboven in een container met 10% bleekwater. Herhaal deze stap was twee keer.</li>
	<li>Na het wassen, voeg 100 µL van warme RPMI-10 tot elk meng goed, omhoog en omlaag met de pipet en Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2.</li>
</ol>2. dag 3
<ol><li>Verwijderen van de 96-Wells V-bodemplaat met 100 µL van cellen en media/putje van de incubator en verplaats het naar een kabinet bioveiligheid. Met behulp van een meerkanaalspipet, mix de inhoud van elk goed en overdracht van de cellen en media op een 96 goed U-bodem plaat of aan het label vooraf polypropyleen buizen van 5 mL.</li>
	<li>Spoel na elk putje in de 96-Wells V-bodemplaat met 100 µL van 1% Paraformaldehyde (PFA) in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en overdracht aan de respectieve putjes in de 96 goed U-bodemplaat of gelabelde 5 mL polypropyleen buizen uit stap 2.1 opleveren een definitieve concentratie van 0,5% PFA/putje of buis. Meng grondig met behulp van een meerkanaalspipet, de afdekplaat met aluminiumfolie en laat het zitten in de incubator voor 30 minuten om te lossen van de cellen.</li>
	<li>De stroom cytometer bereiden (Zie Tabel van materialen bijvoorbeeld) door onbevlekt K562 cellen als u wilt kalibreren van de kant en de voorwaartse scatter samen met de fluorescentie-instellingen uit te voeren. Het enige fluorescentie-kanaal vereist is FL1, zoals GFP de enige fluorescentie uitgestoten uit de cellen is. Verwerven van ~ 30, 000-50.000 cellen van elk monster. Opmerking: Elke staat van het lezen van een enkele fluorescentie stroom-cytometer kan worden gebruikt voor het verkrijgen van de gegevens, zoals cellen geïnfecteerd met RVP zal alleen groene fluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van GFP uitstoten, en geen andere fluorescentie-kanaal nodig zijn.</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
<ol><li>
Verkregen op de cytometer van de stroom met behulp van een software van de analyse van de cytometry van de stroom gegevens analyseren (zie tabel van materialen).
	<ol>
<li>Set de eerste poort gebaseerd op FSC-A (forward scatter-gebied) vs FSC-H (forward scatter-hoogte) aan afzonderlijke cellen te nemen en exclusief auto-belichting fluorescerende paren van analyse12. Vervolgens gate singlet-gated cellen op basis van SSC-A (kant scatter-gebied) vs FSC-A uit te sluiten van het puin van een autofluorescent.</li>
		<li>Analyseren van SSC-A vs FSC-A gated cellen voor de expressie van GFP gebaseerd op WS-A vs GFP-A. Bepaal het percentage GFP + cellen voor elke verdunning van het serum en controle monsters door een hek rond GFP + cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaal het gemiddelde percentage van GFP + cellen voor elk serum monsterverdunning en controleputjes door het verdelen van het totale percentage aan GFP + cellen in de drievoudige putten door 3.</li>
	<li>Berekenen vouw-verbetering van infectie door te delen het gemiddelde percentage van GFP + cellen in het serummonsters voor elke verdunning gedeeld door het gemiddelde percentage van GFP + cellen in de RPMI-10 met de RVP (geen serummonster)-controleputjes.</li>
	<li>Grafiek vouw-toebehoren (y-as) versus verdunning (x-as), en het uitvoeren van statistische analyse met ANOVA gevolgd door de Tukey post hoc test voor meerdere vergelijkingen.</li>
</ol>

<ol><li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity%2C+cross-reactivity%2C+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li>
<li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252(2011).</li>
<li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li>
<li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+K562+cell+line%2C+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li>
<li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li>
<li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li>
<li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive%2C+memory-derived+plasmablasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Flavivirussen zoals DENV en ZIKV delen significante aanwijzingen dat de homologie in beide hun structurele en niet-structurele eiwitten die het genereren van antilichamen die met elkaar13,14 cross-react. Deze antwoorden cross-reactive antilichaam is aangetoond dat het verbeteren van besmetting zowel in vivo en in vitro met een heteroloog serotype of een andere gerelateerde flavivirussen1,2</su...

Antilichaam afhankelijk verhoging (ADE) van de infecties is een proces waarbij gedeeltelijk cross-reactive antilichaam reacties veroorzaakt door een serotype van het virus verbetert de opname van een ander serotype van het virus, wat leidt tot meer virale replicatie en voorjaarsviremie. ADE is uitgebreid gedocumenteerd in Dengue virus (DENV) infecties waar vier belangrijke serotypen heersen. ADE is een subset van patiënten, gekoppeld aan Dengue hemorragische koorts (DHF). We hebben onlangs aangetoond dat Zika virus (ZIKV) infectie veroorzaakt aanzienlijk hoge niveaus van DENV cross-reactive antilichaam reacties die veroorzaakt ADE van DENV in vitro en waarschijnlijk bijgedragen aan de verhoging van de DENV voorjaarsviremie in vivo1 , 2. antilichaam-afhankelijke versterking testen zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de capaciteit van antilichamen te versterken van secundaire infectie met verwante virussen en bieden waardevolle inzichten in de pathogenese van flavivirus infecties en informeren de ontwikkeling van vaccins.
De assay beschreven gebruikt hier DENV RVP samen met K562 cellen, die normaliter ontoelaatbaar om infectie zijn. RVP zijn structureel intact replicatie incompetent DENV virale deeltjes die coderen van een sub-genomic groen fluorescente proteïne (GFP) replicon die na een ronde van replicatie3wordt uitgedrukt. Als zodanig, cellen die geïnfecteerd raken met RVP lichten groen op en kunnen gemakkelijk worden opgespoord met behulp van stroom cytometry of microscopie. De RVP gebruikt in deze test werden verkregen uit commerciële bronnen. Ze kunnen echter tegen andere virussen gegenereerd en gebruikt in de test die wordt beschreven in dit manuscript. K562 cellen zijn ondertussen een FcγIII-receptor-uiting geven aan leukemie cellijn die binden aan de Fc-regio van antilichamen en in het bijzijn van de concentraties van antilichaam4,5sub te neutraliseren besmet raken.
ADE testen zijn uitgebreid gebruikt in studies die onderzoeken de risicofactoren voor ernstige dengue en af te bakenen de mechanismen van in vitro ADE6,7,8. De bepaling van de ADE beschreven hier snel en eenvoudig inzetbaar om te bepalen van de capaciteit van het serum te versterken in vitro infectie met behulp van de RVP en stroom cytometry, in vergelijking met andere testen momenteel gebruikt waarvoor hetzij de bepaling van de vorming van tandplak eenheden (FPU) in Vero-cellen of het antilichaam kleuring van geïnfecteerde cellen6,7,8,9,10,11, die beide tijdrovend en arbeid zijn intensieve.

<table><tbody><tr><td>DENV 1-4 RVP</td><td>Integral Molecular</td><td>RVP-501</td><td></td></tr><tr><td>K562 cellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE lifesceinces</td><td>SH 30910.03</td><td>10% FBS in RPMI-10</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP biomedicals</td><td>1670049</td><td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellegro</td><td>25-060-Cl</td><td>0.025M in RPMI-10</td></tr><tr><td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>1x in RPMI-10</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Cellegro</td><td>25-000-Cl</td><td>1mM in RPMI-10</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Steriele V-bodemplaten</td><td>Thomas Scientific</td><td>333-8001-01V</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Polypropyleen 5 ml FACS buizen</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Niet-steriele U-bodemplaten</td><td>Falcon</td><td>Ref 353910</td><td>Een high throughput alternatief voor FACS buizen</td></tr><tr><td>5mL, steriele, serologische pipet</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>200uL steriele pipettips</td><td>Denville</td><td>P3020 CPS</td><td></td></tr><tr><td>20uL steriele pipettips</td><td>Denville</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>50-200uL multikanaals pipet</td><td>Denville</td><td>P3975-8-B</td><td></td></tr><tr><td>5-50uL multikanaals pipet</td><td>Denville</td><td>P3975-9-B</td><td></td></tr><tr><td>20% formaldehyde</td><td>Tousimis</td><td>&nbsp;#1008B</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>ThermoFisher</td><td>TSCOL35</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>2231000387</td><td>Een alternatief voor een waterbad voor hitte-inactivatie</td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>ThermoFisher</td><td>13-998-213</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare bleek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 9.8</td><td>TreeStar, Inc.</td><td></td><td>Flow cytometrie analyse software</td></tr><tr><td>BD FACSDiva 6.1.2</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II flow cytometer</td><td>Becton Dikinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vloeibare bleek</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9724348</td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudige stroom cytometry gebaseerd assay om te bepalen in vitro antilichaam afhankelijk verbetering van dengue virus met behulp van de herstellende serum zika-virus

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antilichaam afhankelijk verhoging van de infectie is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in Dengue virale pathogenese. Traditionele tests die meten van de capaciteit van antilichamen of serum om infectie in ontoelaatbaar cellijnen hebben vertrouwd op met behulp van virale uitvoer in de media gevolgd door plaque testen te kwantificeren van de infectie. Meer recentelijk hebben deze gehaltebepalingen Dengue virus (DENV) infectie in de cellijnen met behulp van fluorescently gelabelde antilichamen onderzocht. Deze beide benaderingen hebben beperkingen die het wijdverspreide gebruik van deze technieken beperken. Hier beschrijven we een eenvoudige in vitro -assay met Dengue virus verslaggever virale deeltjes (RVP) die uitdrukking geven aan groen fluorescent proteïne en K562 cellen te onderzoeken van antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van DENV-infectie met behulp van serum dat werd verkregen van rhesus Makaken 16 weken na infectie met Zika-virus (ZIKV). Deze techniek is betrouwbaar, minimale manipulatie van cellen gaat, gaat niet over het gebruik van live replicatie bevoegde virus en kan worden uitgevoerd in een hoge doorvoersnelheid formaat om een kwantitatieve uitlezing met behulp van stroom cytometry. Bovendien, kan deze bepaling gemakkelijk aangepast worden onderzoeken antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van andere flavivirus infecties zoals gele koorts-virus (YFV), Japanse Equine encefalitis virus (JEEV), West-Nijlvirus (WNV) etc. waar RVP beschikbaar zijn. Het gemak van het opzetten van de bepaling, de gegevens analyseren en interpreteren van de resultaten maakt het zeer vatbaar is voor de meeste instellingen van het laboratorium.

Sera van 4 rhesus makaken waren verzameld 16 weken na infectie met ZIKV en getest op hun potentieel om te verbeteren DENV-1, 2, 3 en 4 infecties in K562 cellen. De dieren had piek voorjaarsviremie van ~ 1 x 105 exemplaren ZIKV RNA/ml plasma door dag 3 na infectie die gedaald tot een niveau dat onder de limiet van detectie door 7 dagen na infectie. Geen voorjaarsviremie werd ontdekt in het plasma op 16 weken na infectie. Vervolgens de RVP assay werd uitgevoerd en de verzamelde g...

Beschrijven we een eenvoudig en gemakkelijk protocol voor het meten van antilichaam afhankelijk verbetering van infectie door Zika virus herstellende serum met Dengue virus verslaggever virale deeltjes.

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van sera verzameld uit Zika-virus geïnfecteerde rhesus makaken te bepalen om antilichaam-afhankelijke verbetering van dengue-virusinfectie in vitro te mediëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot antilichaam-afhankelijke verbetering van infectie van dengue veroorzaakt door Zika-virus geïnduceerde kruisreactieve antilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze hoog troper, eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is.Demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door William Valiant, een afgestudeerde student in opkomende infectieziekten, in mijn laboratorium. Begin met het ontdooien van de serummonsters op kamertemperatuur. Wanneer ontdooid, breng 100 microliter van elk serummonster over in een steriele buis en verhit en activeer gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius.Maak vervolgens 10-voudige seriële verdunningen van het serummonster variërend van een-op-een tot een-op-duizend in koude RPMI 10. Breng vervolgens 10 microliter van elk verdund serummonster over in de putjes van een steriele 96-well V-bodem plaat. Ontdooi vervolgens dengue één, t

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

Bron: Contreras, D., et al. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (2016)De video demonstreert de detectie van Zika-virale dsRNA-intermediairen in geïnfecteerde epitheelcellen met behulp van immunocytochemie. Geïnfecteerde cellen worden gefixeerd en vervolgens geblokkeerd met een blokkeeroplossing. De primaire en secundaire antilichamen worden toegevoegd. De kernen worden gekleurd met een fluorescerende kleurstof. Het...

Detectie van Zika-virale dsRNA-replicatie-intermediaten met behulp van immunocytochemie

This video demonstrates an assay to measure antibody-dependent enhancement (ADE) of Dengue virus infection using Zika Virus Convalescent Serum. The assay uses Dengue reporter viral particles (RVPs) encoding a green fluorescent protein. Serum antibodies against the Zika Virus cross-react with RVPs to form a complex. The bound antibodies enhance RVP uptake by cells expressing the Fc receptor, which is detected using flow cytometry.

An In Vitro Assay to Examine the Antibody-Dependent Enhancement of Viral Infection

The video demonstrates an in vitro assay for screening interferons with antiviral activity against the Zika virus, a human pathogen. Within the host cell, the Zika virus undergoes multiplication upon internalization, infecting neighboring cells and creating distinct zones or viral plaques. Type I interferon, acting as an antiviral agent, hinders virus multiplication, thereby preventing the formation of viral plaques in the host cell monolayer.

An In Vitro Assay for Screening Interferons as Potent Inhibitors of Zika Virus Growth

Zika Virus (ZIKV), een opkomend pathogeen, wordt in verband gebracht met foetale ontwikkelingsstoornissen en microcefalie. De oprichting van een effectief infectieus celkweeksysteem is cruciaal voor studies naar ZIKV-replicatie evenals voor de ontwikkeling van vaccins en geneesmiddelen. In deze studie worden verschillende virologische tests met betrekking tot ZIKV geïllustreerd en besproken.

Zika Virus Besmettelijke celcultuur en de<em&gt; In Vitro</em&gt; Profylactisch effect van interferonen

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Een protocol bij het evalueren van antigeen-specifieke T-cel-reacties in de organen van de immunoprivileged van het Ifnar1- / - lymfkliertest model voor de Zika-virus (ZIKV)-infectie wordt beschreven. Deze methode is cruciaal voor het onderzoeken van de cellulaire mechanismen voor de bescherming en immunopathogenese van ZIKV vaccins en is ook waardevol voor de evaluatie van hun doeltreffendheid.

Evaluatie van Zika Virus-specifieke T-cel reacties in Immunoprivileged organen van besmette Ifnar1- / - muizen

Beschrijven we een methode om te evalueren van het effect van reeds bestaande immuniteit tegen dengue virus op de Zika-virus-infectie met behulp van menselijk serum, primaire menselijke cellen en kwantificering van de infectie door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie.

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).

Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.

Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

Leer een eenvoudige stroomcytometrie-gebaseerde methode om antilichaamafhankelijke versterking van Dengue-virusinfectie te meten met Zika-virusherstelserum. Dit protocol helpt bij het onderzoek naar kruisreactieve antilichamen.

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Meer video's verkennen