Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van sera verzameld uit Zika-virus geïnfecteerde rhesus makaken te bepalen om antilichaam-afhankelijke verbetering van dengue-virusinfectie in vitro te mediëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot antilichaam-afhankelijke verbetering van infectie van dengue veroorzaakt door Zika-virus geïnduceerde kruisreactieve antilichamen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze hoog troper, eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren is.

Demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door William Valiant, een afgestudeerde student in opkomende infectieziekten, in mijn laboratorium. Begin met het ontdooien van de serummonsters op kamertemperatuur. Wanneer ontdooid, breng 100 microliter van elk serummonster over in een steriele buis en verhit en activeer gedurende 30 minuten bij 56 graden Celsius.

Maak vervolgens 10-voudige seriële verdunningen van het serummonster variërend van een-op-een tot een-op-duizend in koude RPMI 10. Breng vervolgens 10 microliter van elk verdund serummonster over in de putjes van een steriele 96-well V-bodem plaat. Ontdooi vervolgens dengue één, twee, drie en vier proporter virale deeltjes in een 37 graden Celsius waterbad, waarbij een volume van ongeveer 170 microliter van elk RVP per serummonster wordt gewaarborgd.

Zodra ontdooid, breng de buizen met RVP's onmiddellijk naar ijs. Pipet vervolgens 10 microliter van RVP's in de putjes met serummonster verdunningen in de controleputjes zonder serum. Meng grondig door vijf tot tien keer op en neer te pipetten.

Breng de 96-well V-bodem plaat over naar een incubator en incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius, in aanwezigheid van 5% koolstofdioxide. Terwijl de 96-well V-bodem plaat incubeert, maak de oppervlakte van de bio-veiligheidskast schoon met 70% ethanol en laat de UV-lamp 15 minuten branden. Verwijder vervolgens een volledig confluente T-75 fles K562 cellen uit de incubator.

Meng de cellen goed met een steriele vijf millimeter pipet en breng vijf milliliter over naar een steriele 15 milliliter conische buis. Verwijder vervolgens 10 microliter cellen uit de buis, meng met 10 microliter trypan blauw en laad in een hemocytometer. Tel de cellen en bereken het totale aantal cellen.

Na centrifugering van de cellen bij 12 duizend keer G gedurende 10 minuten, decanteer het supernatant en re-suspendeer de cellen in warme RPMI 10 bij een concentratie van 80 duizend cellen per 30 microliter media. Nadat de 96-well V-bodem plaat uit de incubator is verwijderd, breng 30 microliter K562 cellen over naar elke wand van de 96-well V-bodem plaat. En meng grondig door vijf tot tien keer op en neer te pipetten.

Breng vervolgens de plaat terug naar de incubator voor een uur. Na de incubatie, centrifugeer de plaat bij 12 duizend keer G gedurende vijf minuten. Na centrifugatie, decanteer het media uit de putjes door de plaat ondersteboven in een container met 10% bleekmiddel te draaien.

Was vervolgens de cellen in elke wand door ze opnieuw op te schorsen in 125 microliter warme RPMI 10 en centrifugeer zoals eerder. Na het decanteren van de laatste wassing, voeg 100 microliter warme RPMI 10 toe aan elke put. Meng op en neer met de pipet en incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in aanwezigheid van 5% koolstofdioxide.

Twee dagen later, verwijder de plaat uit de incubator en breng over naar een bio-veiligheidskast. Meng de inhoud van elke put met een multikanaals pipet en breng over naar een 96-well U-bodem plaat. Spoel elke put van de 96-well V-bodem plaat af met 100 microliter 1% paraformaldehyde en PBS en breng de resterende cellen en PBS over naar de respectieve putten in de 96-well U-bodem plaat.

Meng grondig met een multikanaals pipet. Bedek de plaat met aluminiumfolie en laat het 30 minuten in de incubator zitten om de cellen te fixeren. Bereid de flow cytometer voor door ongekleurde K562 cellen te gebruiken om de side en forward scatter instellingen te kalibreren met behulp van het ethyl-een kanaal voor GFP fluoresceren.

Vervolgens verwerf 30 duizend tot 50 duizend cellen van elk monster. Gebruik flow cytometrie analyse software om de eerste poort in te stellen op basis van de forward scatter gebied versus forward scatter hoogte om enkele cellen te includeren en autofluorescerende dublets uit de analyse te sluiten. Bereken het gemiddelde percentage GFP positieve cellen voor elke conditie en bereken vervolgens de voudige verbetering van infectie voor elke serum verdunning.

Grafiek voudige verbetering op de y-as versus verdunning op de x-as en voer statistische analyse uit met behulp van ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoc test voor meerdere vergelijkingen. Gegevens van een representatief dier met behulp van dengue-virus een reporter virusdeeltjes zijn hier getoond. Het percentage GFP positieve cellen voor het controlemonster zonder serum was 0,253%. Het onverdunde serummonster was 2,58% GFP positief.

Het percentage GFP positieve cellen bereikte een hoogte van 12,8% bij de een-op-tien serum verdunning, gevolgd door 0,735% bij een een-op-honderd verdunning en 0,022% bij een een-op-duizend verdunning. Antilichaam-afhankelijke verbetering van dengue-infectie werd onderzocht voor de vier dengue-virus serum typen. De gegevens laten zien dat het serum dat 16 weken na infectie werd verzameld, de infectie van K562 cellen door alle dengue-virus serum typen bij een verdunning van een-op-tien significant verbeterde.

Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 48 uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de gegevens binnen één tot twee uur na voltooiing van de laatste fixatiestap van 30 minuten moeten worden verkregen. Vergeet niet dat het werken met geïnfecteerd serum uiterst gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals PBL en BSL2 Niveau praktijken moeten altijd