Name: High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 20 s
Description: Leer high throughput siRNA-screening voor hoornvliesepitheelcellen na blootstelling aan waterstoffluoride en chloorpikrine. Deze methode helpt onderzoekers om celreacties op toxische stoffen te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid tegengaan programma Interagency overeenkomst # AOD13015-001. Wij wil Stephanie Froberg en Peter Hurst bedanken voor hun inspanningen en expertise op videoproductie.

<ol><li>Randleman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRandleman%2C+B+%22Drugs%2C+Diseases+and+Procedures%22">Drugs, Diseases and Procedures</a>. Hampton, R. , Medscape. (2011).</li>
<li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries%2C+including+amniotic+membrane+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li>
<li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+toxicology%3A+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).</li>
<li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3100848/">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li>
<li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li>
<li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li>
<li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li>
<li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+JA+%22Chemical+Terrorism+Risk+Assessment%3B+CSAC+12-006%22">Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006</a>. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).</li>
<li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/267200748_Cell-Based_Assays_in_High-Throughput_Screening_for_Drug_Discovery">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li>
<li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li>
<li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death%3A+investigating+the+potential+roles+of+the+p38%2C+p53%2C+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li>
<li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxnet%22">Toxnet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016).</li>
<li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBancroft%2C+WD+%22The+Medical+Department+of+the+United+States+Army+in+the+World+War%22">The Medical Department of the United States Army in the World War</a>. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chloropicrin+Risk+Characterization+Document%22">Chloropicrin Risk Characterization Document</a>. , California Environmental Protection Agency. (2012).</li>
<li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/14356007.a11_307">Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry</a>. , Wiley-VCH. (2000).</li>
<li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/corneajrnl/Abstract/2000/11003/Second_Injury_in_the_Cornea__The_Role_of.4.aspx">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+and+Recommendations+for+Dharmacon+siRNA+Libraries%22">Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf">http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf</a> (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+RNAiMAX+Reagent%22">Lipofectamine RNAiMAX Reagent</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf
</a> (2017).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IL-8+%28human%29+AlphaLISA+Detection+Kit%2C+5%2C000+Assay+Points%22">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points</a>. , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3">http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3</a> (2016).</li>
<li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
<li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cutaneous+and+Ocular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneTitan+MC+Instrument+North+America%2FJapan+%28110V%29%22">GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V)</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372</a> (2018).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li>
<li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Trace+Element+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li>
<li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li>
<li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li>
<li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SN+%22Fumigants%3A+Environmental+Fate%2C+Exposure%2C+and+Analysis%22">Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis</a>. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).</li>
<li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+Academiae+Medicae+Stetinensis%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li>
<li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology%3A+Clinical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin%3A+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li>
<li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li>
<li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1421657/">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li>
<li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li>
<li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li>
<li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li>
<li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394(2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ATCC+Animal+Cell+Culture+Guide%22">ATCC Animal Cell Culture Guide</a>. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).</li>
<li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li>
<li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li>
<li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustration+of+SSMD%2C+z+score%2C+SSMD%2A%2C+z%2A+score%2C+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.
DISCLAIMER: de meningen uitgedrukt in dit artikel zijn die van de auteur (s) en komen niet overeen met het officiële beleid van de afdeling van het leger, ministerie van defensie en de Amerikaanse regering. Dit onderzoek werd ondersteund door een interdepartementale overeenkomst tussen NIH/NIAID en de USAMRICD, en gedeeltelijk door een afspraak aan de Postgraduate onderzoeksprogramma voor deelname aan het Amerikaanse leger medisch onderzoek instituut van chemische defensie wordt beheerd door de eik Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs door een interdepartementale overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en USAMRMC.

Hierin beschrijven we onze methoden en de resultaten op de ontwikkeling van een hoge doorvoersnelheid hoornvlies epitheliale cel screening model voor de studie van HF en CP verwondingen. Ook presenteren we de resultaten van het scherm van de primaire siRNA voor HF letsel. Er waren veel uitdagingen aan de ontwikkeling van HTS modellen voor de studie van TIC verwondingen. Methoden die we in de literatuur aan de studie van HF, HFA of CP in cel cultuur modellen gerelateerde vinden konden waren weinig hulp. Meeste in vitr...

Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn helaas alleen in het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. De huidige strategie van de behandeling is niet-specifieke en hoofdzakelijk bevat actuele therapeutische behandelingen zoals smeermiddelen, antibiotica, en cycloplegics gevolgd door ontstekingsremmers (bijv., steroïden) eenmaal het hoornvlies heeft opnieuw epithelialized1 ,2. Ondanks de beste huidige therapeutische behandelingsopties beschikbaar is op lange termijn prognose over het algemeen slecht als gevolg van progressieve hoornvlies vertroebelt en neovascularization2,3.
Dierlijke modellen hebben van oudsher gebruikt chemische toxiciteit onderzoeken en begrijpen van de mechanismen van de schade. Dierproeven zijn echter tijdrovend en duur. Er zijn ook inspanningen ter vermindering van dierproeven. REACH-wetgeving (EG 1907/2006) in de Europese Unie heeft bijvoorbeeld bepalingen ter verminderen van dierproeven. De voorschriften omvatten een eis dat bedrijven gegevens delen teneinde dierproeven en goedkeuring van het Europees Chemicaliënagentschap voorafgaand aan het verrichten van voorgestelde proeven op dieren. Krachtens de bepalingen van REACH moeten de dierproeven een laatste redmiddel. Er is ook de Europese cosmetica-verordening (EG 1223/2009), die geleidelijk het testen van cosmetica op dieren. Wanneer dierproeven zijn uitgevoerd, zij worden geleid door de beginselen van 3V (verfijning, vermindering en vervanging), die een kader bieden voor het uitvoeren van meer humane dierlijk onderzoek, vermindering van het aantal proefdieren en het gebruik van proefdiervrije alternatieven waar mogelijk. Om deze redenen heeft het gebied van toxicologie willen aannemen in vitro testen die kunnen inzicht geven in de moleculaire mechanismen van toxiciteit en kunnen worden gedaan in de hogere doorvoer4. Dit is een functionele toxicologie benadering waar toxische stoffen worden gedefinieerd door hun functie in plaats van uitsluitend door hun chemie. Een stapje verder, functionele toxicogenomics proberen te begrijpen van de rol(len) die specifieke genen in de werking van toxische stoffen5 spelen. Met de toepassing van siRNA technologie, kunnen schermen te onderzoeken van de genfunctie in de moleculaire en cellulaire reacties op toxische stoffen worden gedaan met hoge doorvoersnelheid. siRNA zijn dubbele gestrande molecules van RNA die 19-25 nucleotiden lang die profiteren van de post transcriptionele gene silencing pathway aanwezig in alle cellen van zoogdieren6. Dit zijn synthetisch gemaakt en ontworpen om te richten van een specifiek gen. Wanneer een cel binnengebracht, siRNA wordt verwerkt en een strand, het strand van de gids, wordt geladen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). SiRNA stuurt de RISC naar een aanvullend gebied in een mRNA-molecuul en de RISC degradeert de mRNA. Dit resulteert in het terugdringen van de expressie van de specifiek gen. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. Een dergelijke aanpak is verder inzicht in de mechanismen van ricine gevoeligheid en de AHR-afhankelijke inductie van CYP1A17,8gebruikt.
De lijst van chemische terrorisme Risk Assessment (CTRA) en de toxische industriële chemische stoffen (TIC) aanbiedingen hebben gespecificeerde select chemicaliën op basis van hun toxiciteit en potentieel tijdens een terrorist, oorlogvoering of arbeidsongeval gebeurtenis9worden vrijgegeven. We passen een siRNA hoge throughput screening (HTS) toxicogenomic benadering van de studie van CTRA lijst toxische stoffen, die zijn geïdentificeerd als hoog risico van gebruik in een terroristisch incident. Traditionele toxicologie tracht te begrijpen van de schadelijke effecten die chemicaliën op levende organismen hebben; we hebben echter een verdere verlangen om te begrijpen van de mechanismen van letsel met het oog op de ontwikkeling van therapeutics en therapeutische benaderingen, en eventueel ook te informeren ontdekken van moleculen die voor therapeutische ontwikkeling kunnen worden gericht. Deze inspanning in sommige opzichten kan vergelijkbaar met het gebruik van hoge-doorvoer siRNA screening en cellen gebaseerde testen in de drug discovery proces10worden beschouwd. Een groot verschil zou zijn dat drugontdekking meestal tot doel heeft een enkelvoud doel voor therapeutische ontdekking overwegende dat in onze aanpak is het enigszins onwaarschijnlijk dat er zou een enkelvoud doel met hoge therapeutische waarde voor de behandeling van toxische blootstelling. Wij verwachten dat elke effectieve behandeling paradigma voor toxische blootstelling zou vereisen een veelzijdige aanpak om te bereiken hoge therapeutische waarde, en toxicogenomic gegevens kan een effectieve behandeling paradigma vitaal in kennis stellen.
Benchtop automatisering brengt hoge doorvoer methodologie aan laboratoria buiten de farmaceutische of de biotech-industrie. De in vitro studies aan ons instituut geweest historisch traditionele testen die lage doorvoersnelheid11,12,13. Ons laboratorium heeft in de afgelopen jaren overgestapt naar het gebruik van benchtop robotica tot hoge doorvoer siRNA screening uit te voeren. Hierin presenteren we de verfijning van oogbeschadigingen en/of cel modellen en de ontwikkeling van in vitro blootstelling methoden voor waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine (CP) geschikt voor hoge doorvoer siRNA screening. Ons doel is het identificeren van moleculen die regulering van cellulaire schade naar aanleiding van deze toxische stoffen. De doelstellingen van de bibliotheek van de siRNA die wij geselecteerd zijn G eiwit-gekoppelde receptoren, eiwit kinases, proteasen, fosfatasen genaamd, ionenkanalen en andere potentieel druggable doelen. HF en CP werden geselecteerd voor studie door kruisverwijzingen CTRA lijst agenten met de verslagen van de ToxNet van industriële ongevallen te vinden die het grootste risico van oogbeschadigingen en/of letsel via damp blootstelling9,14te presenteren. CP (chemische formule Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) werd oorspronkelijk gebruikt als een traangas in WWI15. Het wordt momenteel gebruikt als een agrarische fumigatiemiddel en functies als een insecticide, fungicide en nematicide16. Waterstoffluoride (HF) wordt gebruikt in processen zoals alkylatie in olieraffinaderijen en elektrochemische fluorering van organische stoffen17. HF (chemische formule HF, CAS-nummer 62778-11-4) is een gas, maar in de waterige vorm is fluorwaterstofzuur (HFA, CAS number 7664-39-3). Dus wij gekozen om HFA gebruiken in onze in cel blootstelling modellen. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de inflammatoire IL-8-markering werden geselecteerd als de eindpunten omdat doelstellingen die bij cellulaire schade betrokken zijn moeten worden weerspiegeld in de dood van de cel en de ontstekingsreactie. In het bijzonder als een doelwit waren een beschermende rol te spelen in toxische blootstelling, moet celdood en/of inflammatoire cytokine productie verhogen wanneer de target-expressie door siRNA wordt geremd. Het omgekeerde zou gelden voor doelstellingen die een negatieve rol spelen. Ook lijkt chronische ontsteking een rol te spelen in de cornea pathologie na blootstelling, en de interventie in de cel dood wegen kan verbetering van klinische resultaten2,18.

```html
<table><tbody><tr><td>Bravo liquid handing platform</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>G5409A</td><td></td></tr><tr><td>Bravo plate shaker</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>Optie 159</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 96LT disposable tip head</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>Optie 178</td><td>96-kanaals grote tip pipetteringseenheid</td></tr><tr><td>Bravo 96ST disposable tip head</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>Optie 177</td><td>96-kanaals kleine tip pipetteringseenheid</td></tr><tr><td>Bravo 384ST disposable tip head</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>Optie 179</td><td>384-kanaals kleine tip pipetteringseenheid</td></tr><tr><td>Bravo 96 250 &mu;L steriele barrière tips</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>19477-022</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 30 &mu;L steriele barrière tips</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>Bravo 384 70 &mu;L steriele barrière tips</td><td>Agilent of gelijkwaardig</td><td>19133-212</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire multimode plate reader</td><td>Perkin Elmer of gelijkwaardig</td><td>2300-0000</td><td>AlphaLISA assay detector met hoge vermogenslaserexcitatie</td></tr><tr><td>IL-8 (mens) AlphaLISA Detection Kit&nbsp;</td><td>Perkin Elmer of gelijkwaardig</td><td>AL224F</td><td>geen-wash bead-based assay</td></tr><tr><td>ProxiPlate-384 Plus witte 384-shallow well microplates</td><td>Perkin Elmer of gelijkwaardig</td><td>6008359</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>13778500</td><td>Transfectie reagens</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco of gelijkwaardig</td><td>12605010</td><td>Celdetacheringsoplossing</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen Instruments of gelijkwaardig</td><td>ESSEN BIOSCI 4473</td><td>Incubator-gehuiste geautomatiseerde microscoop</td></tr><tr><td>Chloropicrine</td><td>Trinity Manufacturing of gelijkwaardig</td><td>N/A</td><td>Acute toxiciteit en irriterend</td></tr><tr><td>DMEM-F12 celcultuurmedium</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>11330-057</td><td>Bevat HEPES</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>1891471</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke epidermale groeifactor (celcultuurkwaliteit)</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant menselijk insuline (celcultuurkwaliteit)</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine oplossing (celcultuurkwaliteit)</td><td>Invitrogen of gelijkwaardig</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison (celcultuurkwaliteit)</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>H0888-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose&nbsp; (celcultuurkwaliteit)</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp; (celcultuurkwaliteit)</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon of gelijkwaardig</td><td>diverse</td><td></td></tr><tr><td>Thiazolyl blauw tetrazoliumboormide</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>M5655</td><td>MTT assay substraat</td></tr><tr><td>siRNA buffer</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>B002000</td><td></td></tr><tr><td>96-well celcultuur platen</td><td>Corning of gelijkwaardig</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>T150 celcultuur flasken</td><td>Corning of gelijkwaardig</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 celcultuur kap</td><td>Nuaire of gelijkwaardig</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>300 mL robotische reservoirs</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>12-565-572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 baffled automatiseringsreservoirs</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>1064-15-8</td><td></td></tr><tr><td>500 mL steriele wegwerp opslagflessen</td><td>Corning of gelijkwaardig</td><td>CLS430282</td><td></td></tr><tr><td>Microplate warmtesealer</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>AB-1443A</td><td></td></tr><tr><td>Microplate warmtesealing folie</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>AB-0475</td><td></td></tr><tr><td>Cardamonine</td><td>Tocris of gelijkwaardig</td><td>2509</td><td>Anti-inflammatoire, gebruikt als positieve controle</td></tr><tr><td>SKF 86002&nbsp;</td><td>Tocris of gelijkwaardig</td><td>2008</td><td>Anti-inflammatoire, gebruikt als positieve controle</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>48% fluorwaterstoffzuur</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>339261</td><td>Corrosief en acute toxiciteit</td></tr><tr><td>1000 &mu;L Enkelkanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L Enkelkanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L Enkelkanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>1000 &mu;L 12-kanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17014497</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;L 12-kanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17013810</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;L 12-kanaals pipetters</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17013808</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 1000 &mu;L</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17002920</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 200 &mu;L</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17014294</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor tips 20 &mu;L</td><td>Rainin of gelijkwaardig</td><td>17002928</td><td></td></tr><tr><td>Chemische afzuigkap</td><td>Jamestown Metal Products</td><td>MHCO_229</td><td></td></tr><tr><td>384-well monsteropslag platen</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>262261</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma of gelijkwaardig</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>50 mL kegelbuizen</td><td>Thermo of gelijkwaardig</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten 50 mL</td><td>Corning of gelijkwaardig</td><td>07-200-576</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipetten 25 mL</td><td>Corning of gelijkwaardig</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr>

high throughput sirna screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn over het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. In de inspanningen voor de ontwikkeling van behandelingen en therapeutics zorg voor blootstelling, kan het belangrijk om te begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van deze verwondingen. Wij stellen voor dat gebruik van hoge-doorvoer kleine remmende RNA (siRNA) screening kan een belangrijke tool die bijdragen kan aan het sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. siRNA zijn dubbele gestrande RNA molecules die 19-25 nucleotiden lang zijn en gebruik maken van het post-transcriptional gen silencing traject om te degraderen van mRNA die homologie aan siRNA hebben. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. De ontwikkeling en validering van in vitro blootstelling modellen en methoden mbt de hoge throughput screening (HTS) van waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine-(CP) geïnduceerde oogbeschadigingen en/of blessure worden gepresenteerd in dit artikel. Hoewel wij deze twee toxische stoffen geselecteerd, zijn onze methoden van toepassing tot de studie van andere toxische stoffen met kleine wijzigingen in het protocol van toxische blootstelling. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de productie van IL-8 werden geselecteerd als de eindpunten in het protocol van de screening. Verschillende uitdagingen in verband met de ontwikkeling van toxische blootstelling en cel cultuur methoden geschikt voor HTS studies worden gepresenteerd. De oprichting van HTS modellen voor deze toxische stoffen voorziet in verdere studies om het mechanisme van letsel en scherm voor potentiële therapeutics voor chemische oogbeschadigingen en/of schade beter te begrijpen.

Het ontwikkelen van de methoden van blootstelling
We verfijnd en de geschiktheid van de menselijke hoornvlies epitheliale cellijn SV40-HCEC voor gebruik in HTS studies geëvalueerd. SV40-HCEC zijn vereeuwigd met behulp van het SV-40 grote T antigeen en waren een geschenk van Dhanajay Pal23. Er waren te veel variabelen onderzocht in het blootstelling Methodiekontwikkeling bondig hierin pres...

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

Deze video toont onze methoden voor high throughput siRNA screening in een model van het hoornvlies epitheel voor toxicologische schade. Dit werk is belangrijk, omdat high throughput siRNA screening een kosten- en tijdefficiënte methode is om de paden en regulatoren van de cellulaire reactie op toxicanten te verduidelijken. Dit werk kan helpen ons begrip van hoe het hoornvlies reageert op toxicologische aanvallen te verbeteren.Maak een suspensie van hoornvlies epitheel cellen in voorverwarmd medium dat 0,5 microgram per milliliter Hydrocortison bevat in een wegwerp mediumfles. Draai de fles rond om de cellen gelijkmatig te suspenderen en giet het in een reservoir op het orbitale shaker nest van een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule. Houd de celsuspensie op een verwarmingsplaat van 37 graden tijdens het celplateringsproces.Gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om cellen toe te voegen aan platen met een dichtheid van duizend cellen per put in 70 microliter medium per put op een 96-puts plaat. Zaai minimaal 14 96-puts platen met cellen voor elke siRNA bibliotheekplaat die bestudeerd zal worden. Laat de orbitale shaker constant tijdens het zaaienproces draaien met 100 cycli per minuut en gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen.Meng de celsuspensie met de geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule voordat de eerste plaat wordt gezaaid. Amputeer 140 microliter van de celsuspensie en doseer 70 microliter in elke put van twee celcultuur platen. Herhaal het mengen en doseren totdat alle platen met cellen zijn gezaaid.Vul het celsuspensie reservoir bij als dat nodig is. Nadat de platen zijn gezaaid, verwijder ze uit de vloeistofbewakingsmodule en incubeer ze 30 minuten op kamertemperatuur. Breng ze vervolgens over naar een celcultuur incubator.Evalueer de celdichtheid van alle platen de volgende ochtend met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, dat zich in de celcultuur incubator bevindt. Sluit platen uit van het onderzoek die binnenputten hebben die niet tussen 15 procent en 22 procent confluent zijn. Transfecteer de cellen 24 uur na het zaaien met vier picomol per put van siRNA en 0,3 microliter per put van transfectiereagens, als volgt.Verkrijg siRNA bibliotheek platen van de leverancier, geconfigureerd om 80 siRNA doelwitten per plaat te bevatten met kolommen een en twaalf leeg gelaten. Herstel de siRNA bibliotheekplaat met siRNA buffer volgens de instructies van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van twee picomol per microliter voor elke put van siRNA. Voer alle transfecties uit met behulp van een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule en een pipetsnelheid van 25 microliter per seconde voor alle stappen.Gebruik voorgeconfigureerde tipdozen om alleen de putten aan te spreken die getransfecteerd zullen worden. Gebruik de bovenste helft van de bibliotheekplaat om een set van zes replicaat platen te transfecteren, aangeduid als de "Top Plate Set". Gebruik de onderste helft van de bibliotheekplaat om een andere set van zes replicaat platen te transfecteren, aangeduid als de "Bottom Plate Set". Samen omvatten de twaalf platen een volledige plaatset, en elke celplaat bevat dezelfde set controles. Transfecteer putten B2 tot B6 van alle platen met negatief pool siRNA nadat alle top en onderste plaat sets zijn getransfecteerd met bibliotheek siRNA.Transfecteer ook putten B2 tot B6 van nog twee platen die geen bibliotheek siRNA ontvangen met negatief pool siRNA. Deze zullen dienen als niet-blootgestelde controles. Incubeer alle celplaten in een celcultuur incubator gedurende vier uur na toevoeging van de transfectiemixen, en meng door voorzichtig te tikken om de 1 uur.Gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om de platen twee keer te wassen met voorverwarmd medium, verdund één op vijf in PBS en opnieuw te voeden met 100 microliter per put voorverwarmd medium. Gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen. Gebruik putten C2 tot C6 als niet-getransfecteerde controles.Houd putten B7 tot B11 en C7 tot C11 niet-getransfecteerd, om te gebruiken als drug en voertuig controles voor toxicologische blootstelling. 24 uur na transfectie, gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om de platen opnieuw te voeden. Gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen.Amputeer 100 microliter van elke put en gooi het weg in een afvalinische reservoir. Voed elke put opnieuw met 100 microliter per put voorverwarmd H-Cort.medium. Leeg het afvalinische reservoir indien nodig.Vul het reservoir met medium bij zoals nodig. Twee dagen na transfectie en twee uur voorafgaand aan blootstelling, bereid een 62,5 micromolair oplossing van de positieve controle Cardamonin in H-Cort. medium voor en voeg toe aan rij B van de 8-rijen verdunningsreservoir.Bereid een 06,25 procent oplossing van DMSO in H-Cort. medium voor en voeg toe aan rij C van hetzelfde reservoir. DMSO wordt gebruikt als de voertuigcontrole.Gebruik de geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om 10 microliter medium te verwijderen uit putten B7 tot B11 en C7 tot C11 van elke celplaat en gooi het weg in rijen G en H van het reservoir. Zorg ervoor dat je voorgeconfigureerde tipdozen gebruikt om alleen die putten aan te spreken die de positieve en voertuig controles zullen ontvangen, en gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen. Breng 10 microliter van de positieve en voertuig controles over naar die putten en meng drie keer.Breng deze celplaten terug naar de incubator. Herhaal deze stappen voor alle extra celplaten. Voer alle chemische blootstellingsoperaties uit in een chemische afzuigkap, terwijl je dubbele nitril handschoenen, een laboratoriumjas, wegwerpbare polyethyleen beschermers en veiligheidsbril draagt.Decontaminiseer pipettenpunten en reservoirs die in contact zijn geweest met de fluorwaterstofzuur, en enig vloeibaar fluorwaterstofzuur met 2,5 procent calciumgluconaat voorafgaand aan wegwerp in de gevaarlijke afvalstroom. Bereid voor elke onderzochte bibliothe

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes an in vitro fluorometric assay to assess the effects of artificial tear formulations on the cellular metabolic activity of corneal epithelial cells using resazurin-based Alamar blue solution. A non-toxic formulation maintains the cells in a healthy, metabolically active state, facilitating the reduction of resazurin into a highly fluorescent resorufin.

alamarBlue Assay: A Sensitive Fluorometric Method to Screen the Cytotoxic Effects of Artificial Tear Formulations on Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Het doel van het onderzoek was om de biologische impact van 15 bestanddelen van sigarettenrook te beoordelen door middel van een combinatie van een impedantie-gebaseerde real-time celanalysator en een op hoogwaardige inhoud gebaseerde (HCS)-platform voor toxicologische beoordeling in vitro. Dit onderzoek biedt informatie over effectieve doseringen, toxiciteit en werkingsmechanismen van de geteste verbindingen.

High Content Screening Analyse van de toxicologische effecten van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen Evalueren (HPHC)

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van heat shock protein 27 (HSP27)-specifiek klein interfererend RNA om de functie van HSP27 te beoordelen tijdens wondgenezing van het hoornvliesepitheel. RNA-interferentie is de beste methode om effectief genexpressie te onderdrukken om de eiwitfunctie in verschillende celtypen te onderzoeken.

RNA-interferentie op basis van onderzoek naar de functie van heat shock protein 27 tijdens cornea epitheliale wondheling

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.

Het bepalen van de toxiciteit van UV-straling en chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke hoornvliesepitheelcellen

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren met behulp van dihydroethidium (DHE) als fluorescentiekleurstofsonde met behulp van een high-throughput screeningbenadering. Het protocol beschrijft de methoden voor kwantitatieve beoordeling van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de drie verschillende hepatocellulaire carcinoomcellijnen.

High Throughput Screening Assessment van het genereren van reactieve zuurstofsoorten (ROS) met behulp van dihydroethidium (DHE) fluorescentiekleurstof

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Leer high throughput siRNA-screening voor hoornvliesepitheelcellen na blootstelling aan waterstoffluoride en chloorpikrine. Deze methode helpt onderzoekers om celreacties op toxische stoffen te analyseren.

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Meer video's verkennen