High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

Deze video toont onze methoden voor high throughput siRNA screening in een model van het hoornvlies epitheel voor toxicologische schade. Dit werk is belangrijk, omdat high throughput siRNA screening een kosten- en tijdefficiënte methode is om de paden en regulatoren van de cellulaire reactie op toxicanten te verduidelijken. Dit werk kan helpen ons begrip van hoe het hoornvlies reageert op toxicologische aanvallen te verbeteren.

Maak een suspensie van hoornvlies epitheel cellen in voorverwarmd medium dat 0,5 microgram per milliliter Hydrocortison bevat in een wegwerp mediumfles. Draai de fles rond om de cellen gelijkmatig te suspenderen en giet het in een reservoir op het orbitale shaker nest van een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule. Houd de celsuspensie op een verwarmingsplaat van 37 graden tijdens het celplateringsproces.

Gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om cellen toe te voegen aan platen met een dichtheid van duizend cellen per put in 70 microliter medium per put op een 96-puts plaat. Zaai minimaal 14 96-puts platen met cellen voor elke siRNA bibliotheekplaat die bestudeerd zal worden. Laat de orbitale shaker constant tijdens het zaaienproces draaien met 100 cycli per minuut en gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen.

Meng de celsuspensie met de geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule voordat de eerste plaat wordt gezaaid. Amputeer 140 microliter van de celsuspensie en doseer 70 microliter in elke put van twee celcultuur platen. Herhaal het mengen en doseren totdat alle platen met cellen zijn gezaaid.

Vul het celsuspensie reservoir bij als dat nodig is. Nadat de platen zijn gezaaid, verwijder ze uit de vloeistofbewakingsmodule en incubeer ze 30 minuten op kamertemperatuur. Breng ze vervolgens over naar een celcultuur incubator.

Evalueer de celdichtheid van alle platen de volgende ochtend met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem, dat zich in de celcultuur incubator bevindt. Sluit platen uit van het onderzoek die binnenputten hebben die niet tussen 15 procent en 22 procent confluent zijn. Transfecteer de cellen 24 uur na het zaaien met vier picomol per put van siRNA en 0,3 microliter per put van transfectiereagens, als volgt.

Verkrijg siRNA bibliotheek platen van de leverancier, geconfigureerd om 80 siRNA doelwitten per plaat te bevatten met kolommen een en twaalf leeg gelaten. Herstel de siRNA bibliotheekplaat met siRNA buffer volgens de instructies van de fabrikant tot een uiteindelijke concentratie van twee picomol per microliter voor elke put van siRNA. Voer alle transfecties uit met behulp van een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule en een pipetsnelheid van 25 microliter per seconde voor alle stappen.

Gebruik voorgeconfigureerde tipdozen om alleen de putten aan te spreken die getransfecteerd zullen worden. Gebruik de bovenste helft van de bibliotheekplaat om een set van zes replicaat platen te transfecteren, aangeduid als de "Top Plate Set". Gebruik de onderste helft van de bibliotheekplaat om een andere set van zes replicaat platen te transfecteren, aangeduid als de "Bottom Plate Set". Samen omvatten de twaalf platen een volledige plaatset, en elke celplaat bevat dezelfde set controles. Transfecteer putten B2 tot B6 van alle platen met negatief pool siRNA nadat alle top en onderste plaat sets zijn getransfecteerd met bibliotheek siRNA.

Transfecteer ook putten B2 tot B6 van nog twee platen die geen bibliotheek siRNA ontvangen met negatief pool siRNA. Deze zullen dienen als niet-blootgestelde controles. Incubeer alle celplaten in een celcultuur incubator gedurende vier uur na toevoeging van de transfectiemixen, en meng door voorzichtig te tikken om de 1 uur.

Gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om de platen twee keer te wassen met voorverwarmd medium, verdund één op vijf in PBS en opnieuw te voeden met 100 microliter per put voorverwarmd medium. Gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen. Gebruik putten C2 tot C6 als niet-getransfecteerde controles.

Houd putten B7 tot B11 en C7 tot C11 niet-getransfecteerd, om te gebruiken als drug en voertuig controles voor toxicologische blootstelling. 24 uur na transfectie, gebruik een geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om de platen opnieuw te voeden. Gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen.

Amputeer 100 microliter van elke put en gooi het weg in een afvalinische reservoir. Voed elke put opnieuw met 100 microliter per put voorverwarmd H-Cort.medium. Leeg het afvalinische reservoir indien nodig.

Vul het reservoir met medium bij zoals nodig. Twee dagen na transfectie en twee uur voorafgaand aan blootstelling, bereid een 62,5 micromolair oplossing van de positieve controle Cardamonin in H-Cort. medium voor en voeg toe aan rij B van de 8-rijen verdunningsreservoir.

Bereid een 06,25 procent oplossing van DMSO in H-Cort. medium voor en voeg toe aan rij C van hetzelfde reservoir. DMSO wordt gebruikt als de voertuigcontrole.

Gebruik de geautomatiseerde vloeistofbewakingsmodule om 10 microliter medium te verwijderen uit putten B7 tot B11 en C7 tot C11 van elke celplaat en gooi het weg in rijen G en H van het reservoir. Zorg ervoor dat je voorgeconfigureerde tipdozen gebruikt om alleen die putten aan te spreken die de positieve en voertuig controles zullen ontvangen, en gebruik een pipetsnelheid van 50 microliter per seconde voor alle stappen. Breng 10 microliter van de positieve en voertuig controles over naar die putten en meng drie keer.

Breng deze celplaten terug naar de incubator. Herhaal deze stappen voor alle extra celplaten. Voer alle chemische blootstellingsoperaties uit in een chemische afzuigkap, terwijl je dubbele nitril handschoenen, een laboratoriumjas, wegwerpbare polyethyleen beschermers en veiligheidsbril draagt.

Decontaminiseer pipettenpunten en reservoirs die in contact zijn geweest met de fluorwaterstofzuur, en enig vloeibaar fluorwaterstofzuur met 2,5 procent calciumgluconaat voorafgaand aan wegwerp in de gevaarlijke afvalstroom. Bereid voor elke onderzochte bibliothe