Name: Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer hoe u GFP-lentivirale transductie toepast op patiënt-afgeleide dikke darmkankerorganoids voor hooggevoelige detectie van micrometastasen in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en verspreiding van darmkanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Juntendo Universiteit Young Investigator Award (2013, 2014 en 2015) Y.O., het gezamenlijke Project Award (2013 en 2014) naar K. M., en verleent in-steun voor wetenschappelijkonderzoek van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en Technologie-, Japan (16K 15625 aan Y. K. en 16K 15598 aan M.G.). Wij zijn vooral dankbaar voor alle leden van de fac. van de chirurgie van de Coloproctological en moleculaire pathologie voor nuttige discussies en technische ondersteuning. Wij danken ook Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Universiteit Schoolof geneeskunde) en Dr Hideki Kitajima (Internationale Universiteit van gezondheid en welzijn) voor gulle technische begeleiding in de chirurgische procedures voor orthotopic implantatie in muizen en Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) voor technisch advies over het uitvoeren van de tumor organoid cultuur.

<ol><li>Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer+statistics%2C+2014%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer statistics, 2014.</a> CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+the+utility+of+patient-derived+xenograft+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models.</a> Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).</li>
<li>Puig, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+preclinical+model+to+evaluate+the+metastatic+potential+of+patient-derived+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells.</a> Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Colorectal+tumor+organoid+library+demonstrates+progressive+loss+of+niche+factor+requirements+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).</li>
<li>Fumagalli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+colorectal+cancer+progression+by+orthotopic+transplantation+of+engineered+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).</li>
<li>O'Rourke, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+engineered+organoids+enables+rapid+generation+of+metastatic+mouse+models+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer.</a> Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).</li>
<li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome+editing+and+organoid+transplantation+models+of+colorectal+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis.</a> Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).</li>
<li>Kuo, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+colonization+competence+governs+colon+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Liver colonization competence governs colon cancer metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).</li>
<li>Onuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+reconstitution+of+tumorigenesis+in+primary+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).</li>
<li>Onder, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Fujii, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-related+lymphoproliferative+lesions+arising+in+donor+lymphocytes+of+transplanted+human+tumor+tissues+in+the+NOG+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse.</a> Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen potentiële conflicten van belang om te vermelden.

Hoewel de CRC PDX-model heeft wijd uitgeoefend te bestuderen van de groei van de primaire tumor, of dit model is ook van toepassing op het onderzoek naar uitzaaiing van de tumor is niet nog is volledig opgehelderd. Spontane uitzaaiingen waren ook nauwelijks waarneembaar in de lever en longen van verschillende gerapporteerde dubbelpunt PDX modellen4,10. U wilt opsporen micrometastasen met hoge gevoeligheid, ontwikkelden we een protocol voor transducing van GFP len...

Colorectal kanker (CRC) is de tweede belangrijkste oorzaak van kanker doden wereldwijd1. De ontoereikende reactie op conventionele therapieën voor patiënten met de ziekte gevorderd stadium geeft aan de ondoeltreffendheid van de pogingen om de CRC's radicaal te genezen. Ontwikkeling van meer effectieve therapeutische benaderingen, zijn verschillende preklinische Muismodellen van kanker die de kenmerken van de CRC's na te bootsen vastgesteld. Verschillende CRC cellijnen zijn wijd gebruikt voor het genereren van tumor xenografts als gevolg van hun gebruiksgemak en manipulatie. Langetermijnkweek van kanker cellijnen, veroorzaakt echter vaak selectie van unieke cel populaties die heel proliferatieve onder de voorwaarde van een bepaalde cultuur, daardoor resulterend in onbetrouwbare resultaten en cruciale beperkingen in preklinische drug ontwikkeling.
Zonder gekweekt in vitro, zijn patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) ook gegenereerd door implantatie in diermodellen van menselijke CRC weefsels die operatief ontleed van patiënten2,3,4. PDXs op brede schaal erkend als de belangrijkste histopathologische kenmerken Recapitulerend en genetische wijzigingen oorspronkelijk in tumoren van de patiënten waarvan ze zijn afgeleid. Bovendien, patiënt-afgeleide tumor organoids samengesteld van tumor cel clusters werden opgericht door cultuur onder 3D omstandigheden dat nauw deed de biologische eigenschappen van de originele tumoren5,6. Deze tumor organoids werden ook toegepast voor high-throughput drug screening, waardoor gepersonaliseerde therapieën ontworpen5. Echter sterk heterogene CRC populaties wordt verondersteld dat zijn aanwezig in een tumor massa. Bijzondere CRC populaties kunnen selectief vermenigvuldigen en uit te breiden tijdens de in vivo en in vitro series van passages van PDX en tumor organoids, respectievelijk. Dit kan ook toestaan de algehele gene expressieprofielen en epi/genetische status van de getroffen CRC's te veranderen, daardoor resulterend in minimale gelijkenis met de ouderlijke CRC.
Patiënt afkomstige CRC organoids en die geëxtraheerd uit noncancerous menselijke Colón ontworpen naar harbor combinaties van oncogene mutaties ook gewerkt hebben aan het onderzoeken van de kenmerken van menselijke tumorcellen wordt geïllustreerd door tumor invasie en metastase 6,7,8,9. Echter, de zeer lage incidentie van spontane uitzaaiing als gevolg van orthotopic implantatie van patiënt-afgeleide CRC naar immunodeficiëntie muizen, heeft het moeilijk gemaakt om te studeren het meerstaps proces van de invasie-metastase cascade waarin lokale invasie, intravasation, vervoer in de bloedbaan, de extravasation en de kolonisatie van verre organen4,10. Micrometastasis als vertegenwoordigd door tumor cel afzetting van ≤2 mm, gevormd door de patiënt afkomstige CRC organoids, heeft vaak over het hoofd gezien op histopathologisch analyse van secties van aangetaste verre organen in experimentele Muismodellen. Visualisatie van spontane micrometastasen geweest ook minimale in-vivo als gevolg van de moeilijkheid van de efficiënt invoering fluorescente markeringen in organoid tumorcellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen. In deze studie, ontwikkelden we een protocol kunnen efficiënt transduce GFP lentivirus in PDX-afgeleide CRC organoid cellen in 3D cultuur vóór injectie in ontvangende muizen en kunnen zeer gevoelige detectie, stereo-fluorescentie microscopie, in dienst van hun kolonisatie van de verschillende organen te formulier micrometastasen.

<table><tbody><tr><td>NOD/Shi-scid IL2R&gamma; null (NOG) mice</td><td>The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan</td><td></td><td>Fokken 6 weken oude mannelijke muizen onder kiemvrije en specifiek pathogeen-vrije omstandigheden</td></tr><tr><td>wound clips 2&times;10mm</td><td>Natsume manufacturing, Japan</td><td>#C-21-S</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Hamilton-spuit naaldmaat:22 gauge</td><td>Tokyo Science, Japan</td><td></td><td>Desinfect met 70% alcohol en steriel PBS.</td></tr><tr><td>6-wells plaat</td><td>BMBio</td><td>#92006</td><td></td></tr><tr><td>12-wells plaat</td><td>BMBio</td><td>#92412</td><td></td></tr><tr><td>15ml conische buis</td><td>Sumitono Bakelite</td><td>MS-57150</td><td></td></tr><tr><td>50ml conische buis</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-57500</td><td></td></tr><tr><td>microbuisje</td><td>Eppendorf</td><td>#0030120086</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Erma</td><td>#03-202-1</td><td></td></tr><tr><td>40&mu;m celstrainer</td><td>Corning</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel basaal membraan matrix</td><td>Corning</td><td>#354234</td><td>Bewaar aliquots op -20&deg;C. Plaats op ijs tot gebruik</td></tr><tr><td>Collageenase type 1</td><td>Sigma</td><td>#C1030</td><td>150 mg/ml collageenase type1 in 1&times;PBS. Bewaar aliquots op -20&deg;C gedurende maximaal 1 jaar</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovate Cell Technologies</td><td>#5V2623A</td><td>Bewaar op 4&deg;C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 met GlutaMAX&trade;</td><td>Gibco</td><td>#10565018</td><td>Bewaar op 4&deg;C. Verwarm op 37&deg;C voor gebruik</td></tr><tr><td>Cell banker 1plus</td><td>ZENOAQ</td><td>#628</td><td>Bewaar op 4&deg;C. Gebruik binnen 1 maand</td></tr><tr><td>Penicilline</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>Bewaar op 4&deg;C. Gebruik binnen 1 maand</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>#15140122</td><td>Bewaar op 4&deg;C. Gebruik binnen 1 maand</td></tr><tr><td>hEGF</td><td>PEPROTECH</td><td>#AF-100-15</td><td>Bewaar op -20&deg;C. Voeg toe aan medium op dezelfde dag als gebruik</td></tr><tr><td>Y27632, een ROCK-remmer</td><td>Wako</td><td>#253-00591</td><td>Bewaar op -20&deg;C. Voeg toe aan medium op dezelfde dag als gebruik</td></tr><tr><td>Kweekmedium</td><td>Gibco</td><td></td><td>DMEM/F-12 met GlutaMAX&trade; supplement aangevuld met 5% FBS, 100 U/ml penicilline en 100 &micro;g/ml streptomycine. Bewaar op 4&deg;C. Gebruik binnen 1 maand.</td></tr><tr><td>CRC organoïd kweekmedium met 1% of 5% FCS</td><td></td><td></td><td>DMEM/F-12 met GlutaMAX&trade; supplement (Gibco #10565018) aangevuld met 1% of 5% FCS, 100 U/ml penicilline, 100 &micro;g/ml streptomycine, 2 ng/ml hEGF en 10 &micro;M Y27632, een ROCK-remmer. Bewaar op 4&deg;C. Gebruik binnen 1 maand.</td></tr><tr><td>the FuGENE 6 transfectie reagens</td><td>Roche</td><td>11814 443001</td><td></td></tr><tr><td>Minisart 0.45 &micro;m filter</td><td>Sartorius stedim</td><td>17598-K</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropyleen centrifugeerbuisjes</td><td>Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>PRRL-GFP vector</td><td>Gift van Dr. Robert A. Weinberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Gift van Dr. Robert A. Weinberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2 dvpr</td><td>Gift van Dr. Robert A. Weinberg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>the SW55Ti zwaaiende emmer rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescentiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door gfp lentivirus-getransduceerde organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm tumor

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Ondanks de huidige vooruitgang in de behandeling van menselijke colorectal kanker (CRC) zijn paar radicale therapieën effectief voor de late stadia van CRC. Te overwinnen deze klinische uitdaging, tumor xenograft Muismodellen met behulp van reeds lang gevestigde cellijnen van menselijke carcinoom en vele transgene muismodellen met tumoren zijn ontwikkeld als preklinische modellen. Ze gedeeltelijk na te bootsen de kenmerken van menselijke carcinomen, maar vaak niet de belangrijkste aspecten van menselijke maligniteiten waaronder invasie en metastase recapituleren. Alternatieve modellen die beter de kwaadaardige progressie in menselijke CRC vertegenwoordigen hebben zo lang gewacht.
Hierin laten we generatie van patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) door onderhuidse implantatie van kleine CRC fragmenten operatief ontleed van een patiënt. De dikke darm-PDXs ontwikkelen en histopathologically lijken op de CRC in de patiënt. Echter, een paar spontane micrometastasen aantoonbaar in conventionele dwarsdoorsneden van aangetaste verre organen in het PDX-model. Ter vergemakkelijking van de opsporing van metastatische verspreiding in verre organen, we gewonnen van de tumorcellen organoid uit de PDXs van de dikke darm in cultuur en besmet ze met GFP lentivirus vóór injectie in zeer immunodeficiëntie knik/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) muizen. Orthotopically geïnjecteerd PDX-afgeleide CRC organoid cellen consequent formulier primaire tumoren positief voor GFP in ontvangende muizen. Bovendien ontwikkelen spontaan micrometastatic kolonies GFP uitdrukken met name in de longen van deze muizen met fluorescentie microscopie worden gesignaleerd. Intrasplenic injectie van CRC organoids produceert bovendien vaak hepatische kolonisatie. Samen genomen, deze bevindingen wijzen erop GFP-gelabelde PDX-afgeleide CRC organoid cellen zijn visueel detecteerbaar een meerstaps tijdens de invasie-metastase cascade genoemd. De beschreven protocollen omvatten de oprichting van PDXs van menselijke CRC en 3D cultuur van de corresponderende CRC organoid cellen getransduceerde door GFP lentivirale deeltjes.

Een primair colorectaal adenocarcinoom gediagnosticeerd als matig gedifferentieerd had operatief zijn gereseceerd van een 76-jarige vrouw met TNM classificatie, fase IIIa, gevolgd door postoperatieve chemotherapie. De primaire CRC cellen immunohistochemisch gekleurd positief voor carcino-antigeen, Ki-67, pan-cytokeratin en E-cadherine. Stukken van de resected tumor waren ook subcutaan ingeplant NOG muizen voor het genereren van de dikke darm PDX-model. CRC organoid cellen werden vervolgen...

Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van tumorbiologie over de micrometastasen die worden gevonden bij patiënten met darmkanker. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een zeer gevoelige detectie mogelijk maakt van micrometastasen geïnduceerd door GFP-gelabelde, patiënt-afgeleide darmkanker organoïden in de muizen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het moeilijk kan zijn om door darmtumor organoïden afkomstige micrometastasen te detecteren in verre organen bij muizen.De procedure zal worden gedemonstreerd door Yu Okazawa, Kosuke Mizukoshi en Yu Koyama, allebei promovendi en chirurgen uit mijn groep. Om humane colorectale kankercel organoïden te genereren, voegt u eerst 150 microliter kunstmatige extracellulaire matrix per put toe aan een 12-putsplaat op ijs. Wanneer alle putten zijn gecoat, incubeer de plaat gedurende 30 tot 60 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en 5%CO2 om de gels te laten stollen.Vervolgens resuspendeert u een patiënt-afgeleide tumor xenograaf cellenpellet in vers colorectal kanker organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 5% foetaal runder serum, of FCS, om een concentratie van drie keer 10 tot vijf cellen per milliliter te bereiken, en zaait u één milliliter cellen op elke kunstmatige extracellulaire matrix. Breng de cellen vervolgens terug naar de celkweek incubator. De volgende ochtend, draagt u voorzichtig de kweek supernatants, inclusief de zwevende cellen, over in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor hun centrifugatie, en resuspendeert u de pellets in 70 microliter vers kunstmatig extracellulair matrix op ijs.Om de levensvatbaarheid van colorectale kankercellen te verhogen, legt u de zwevende tumorcel bevattende kunstmatige extracellulaire matrix weer op de met kunstmatige extracellulaire matrix gecoate putten, en incubeer de tumorcel culturen gedurende 30 minuten in de celkweek incubator. Wanneer de nieuwe extracellulaire matrix gel is gestold, voedt u de culturen met één milliliter vers colorectal kanker organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 1%FCS, en brengt u de cellen terug naar de celkweek incubator. Na zeven tot tien dagen kweek, los de organoïden mechanisch los met een steriele celschraper en breng de organoïden over in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor hun centrifugatie.Resuspendeert u vervolgens de pellets in 500 microliter PBS met zachtjes tikken voor een andere centrifugatie. Om de colorectale kanker organoïden te dissociëren, voegt u 500 microliter proteolytische en collagenolytische enzymoplossing toe aan de buizen, en mengt met zachtjes tikken. Na 10 minuten op kamertemperatuur, voegt u 500 microliter medium gesupplementeerd met 1%FBS toe aan de cellen, en pipetteert u de celsuspensie zeer voorzichtig meerdere keren om de organoïden te breken.Zachtjes pipetteren van humane CRC organoïden tijdens verwerking is cruciaal om een intacte sferoïde vorming in cultuur te behouden. Centrifugeer de cellen opnieuw, en resuspendeer de pellets in 100 microliter 5X GFP lentivirus stock en 400 microliter vers colorectal kanker organoïden kweekmedium. Het is essentieel om de humane CRC organoïden te infecteren met een hoge hoeveelheid GFP lentivirus, met name om een bijna 100% infectie van CRC te bereiken.Pas het volume in elke buis aan om een concentratie van vijf keer 10 tot vijf gedissocieerde tumorcellen per 500 microliter medium te bereiken, en zet 500 microliter cellen in elke put van een met kunstmatige extracellulaire matrix gecoate 12-putsplaat zoals gedemonstreerd. Na 18 uur in de celkweek incubator, draagt u de zwevende, celbevattende supernatanten over in afzonderlijke 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor centrifugatie, gevolgd door resuspendering van de pellets in 70 microliter kunstmatig extracellulair matrix per buis op ijs. Om de levensvatbaarheid van colorectale kankercellen te verbeteren, legt u de tumorcelbevattende kunstmatige extracellulaire matrix op de tumor organoïden in de 12-putsplaat en plaatst u de plaat in de celkweek incubator gedurende 30 minuten.Wanneer de kunstmatige extracellulaire matrix coating is gestold, voedt u de culturen met één milliliter vers CRC organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 1%FCS, en brengt u de cellen terug naar de celkweek incubator gedurende drie dagen. Observeer vervolgens de geïnfecteerde cellen door middel van fluorescentiemicroscopie om een bijna 100%GFP positiviteit te bevestigen, en brengt u de cellen terug naar de incubator voor nog eens vier tot zes dagen. Om een spontaan metastase muismodel van CRC patiënt-afgeleide tumor xenografts te vestigen, dissocieert u de GFP-gelabelde organoïden zoals gedemonstreerd, en verdunt u de enkele tumorcel suspensies bij een vijf keer 10 tot vijf tumorcellen per 50 microliter PBS gesupplementeerd met 50% kunstmatige extracellulaire matrix concentratie.Laad 50 microliter cellen per muis in een spuit uitgerust met een 22-gauge naald, en plaats de tumorcellen op ijs. Bevestig vervolgens het ontbreken van reactie op teenknijpen, en plaats de eerste anesthetiseerde NOG muis in de rugligging op de laboratoriumbank. Trek met steriele pincetten voorzichtig de rectale mucosa uit de anus en injecteert u de tumorcellen onmiddellijk in de rectale submucosa.Om een experimenteel metastase model van CRC patiënt-afgeleide tumor xenografts te vestigen, verdunt u de enkele tumorcel suspensies bij een vier keer 10 tot vier cellen per 50 microliter concentratie, en laad 50 microliter cellen per muis in een spuit uitgerust met een 22-gauge naald. Plaats de eerste anesthetiseerde NOG muis in een buikligging op de bank en maakt u een kleine insnijding in de onderste regio van de linkerflank. Gebruik steriele schaar en pincetten om voorzichtig het peritoneum te snijden en de milt bloot te leggen, en gebruik de pincetten om het vet vast te grijpen dat aan de milt is gehecht.Injecteer vervolgens langzaam 50 microliter van de tumorcel suspensie in de milt, en zorg ervoor dat er geen lekkage wordt waargenomen. Nadat alle muizen zijn geïnjecteerd en indien nodig zijn genaaid, brengt u de dieren terug naar hun thuiscassen en controleert u op lekkage van de hechtingen en levensvatbaarheid één dag na de lever

high-sensitivity-detection-micrometastases-generated-gfp-lentivirus

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De nieuwe protocol gerapporteerd in deze studie kan selectieve detectie van longmetastasen in cel resolutie in muizen door...

Verbeterde visualisatie van longmetastasen bij Single Cell resolutie in Muizen van de gecombineerde<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusie van het longweefsel en X-gal kleuring van<em&gt; LacZ</em&gt;-Label tumorcellen

This video describes the detailed protocol for generating 3D organoids from murine-model derived colorectal cancer cells by propagating them on artificial extracellular matrix coated plates. These CRC organoids can be used as a model to study the primary growth of human tumor cells and metastasis.

CRC Organoid Culture: A Method to Obtain 3D Organoids from Colorectal Cancer Cells

This video describes the technique of generating CRC organoids transduced by GFP lentiviral particles for enabling fluorescent imaging. These GFP labeled organoids, when placed in animal models, help to study tumor invasion and metastasis.

CRC Organoid Cell Labeling: A Method to Generate GFP Lentivirus-transduced Colorectal Cancer Organoid Cells

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

This video describes the protocol for generating metastases by the PDX derived CRC organoids labeled with GFP lentivirus into the spleen of an immunodeficient mouse. Cancer micrometastases colonizing other organs can be detected using a fluorescence microscope to assess the GFP expression.

Establishing Experimental Metastases Mouse Model: Implanting GFP Expressing CRC Organoid Cells in PDX Model to Detect Micrometastases

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

De beschreven aanpak combineert experimentele staart ader metastase assays met in vivo levende dierlijke beeldvorming zodat real-time monitoring van borstkanker metastase vorming en groei in aanvulling op de kwantificering van metastasen aantal en grootte in de longen.

Gecombineerd gebruik van staart ader metastase assays en real-time in vivo beeldvorming om borstkanker te kwantificeren gemetastaseerde kolonisatie en last in de longen

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Leer hoe u GFP-lentivirale transductie toepast op patiënt-afgeleide dikke darmkankerorganoids voor hooggevoelige detectie van micrometastasen in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorbiologie en verspreiding van darmkanker.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor (Video) | JoVE Journal

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Meer video's verkennen