Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van tumorbiologie over de micrometastasen die worden gevonden bij patiënten met darmkanker. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een zeer gevoelige detectie mogelijk maakt van micrometastasen geïnduceerd door GFP-gelabelde, patiënt-afgeleide darmkanker organoïden in de muizen. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het moeilijk kan zijn om door darmtumor organoïden afkomstige micrometastasen te detecteren in verre organen bij muizen.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Yu Okazawa, Kosuke Mizukoshi en Yu Koyama, allebei promovendi en chirurgen uit mijn groep. Om humane colorectale kankercel organoïden te genereren, voegt u eerst 150 microliter kunstmatige extracellulaire matrix per put toe aan een 12-putsplaat op ijs. Wanneer alle putten zijn gecoat, incubeer de plaat gedurende 30 tot 60 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en 5%CO2 om de gels te laten stollen.

Vervolgens resuspendeert u een patiënt-afgeleide tumor xenograaf cellenpellet in vers colorectal kanker organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 5% foetaal runder serum, of FCS, om een concentratie van drie keer 10 tot vijf cellen per milliliter te bereiken, en zaait u één milliliter cellen op elke kunstmatige extracellulaire matrix. Breng de cellen vervolgens terug naar de celkweek incubator. De volgende ochtend, draagt u voorzichtig de kweek supernatants, inclusief de zwevende cellen, over in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor hun centrifugatie, en resuspendeert u de pellets in 70 microliter vers kunstmatig extracellulair matrix op ijs.

Om de levensvatbaarheid van colorectale kankercellen te verhogen, legt u de zwevende tumorcel bevattende kunstmatige extracellulaire matrix weer op de met kunstmatige extracellulaire matrix gecoate putten, en incubeer de tumorcel culturen gedurende 30 minuten in de celkweek incubator. Wanneer de nieuwe extracellulaire matrix gel is gestold, voedt u de culturen met één milliliter vers colorectal kanker organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 1%FCS, en brengt u de cellen terug naar de celkweek incubator. Na zeven tot tien dagen kweek, los de organoïden mechanisch los met een steriele celschraper en breng de organoïden over in 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor hun centrifugatie.

Resuspendeert u vervolgens de pellets in 500 microliter PBS met zachtjes tikken voor een andere centrifugatie. Om de colorectale kanker organoïden te dissociëren, voegt u 500 microliter proteolytische en collagenolytische enzymoplossing toe aan de buizen, en mengt met zachtjes tikken. Na 10 minuten op kamertemperatuur, voegt u 500 microliter medium gesupplementeerd met 1%FBS toe aan de cellen, en pipetteert u de celsuspensie zeer voorzichtig meerdere keren om de organoïden te breken.

Zachtjes pipetteren van humane CRC organoïden tijdens verwerking is cruciaal om een intacte sferoïde vorming in cultuur te behouden. Centrifugeer de cellen opnieuw, en resuspendeer de pellets in 100 microliter 5X GFP lentivirus stock en 400 microliter vers colorectal kanker organoïden kweekmedium. Het is essentieel om de humane CRC organoïden te infecteren met een hoge hoeveelheid GFP lentivirus, met name om een bijna 100% infectie van CRC te bereiken.

Pas het volume in elke buis aan om een concentratie van vijf keer 10 tot vijf gedissocieerde tumorcellen per 500 microliter medium te bereiken, en zet 500 microliter cellen in elke put van een met kunstmatige extracellulaire matrix gecoate 12-putsplaat zoals gedemonstreerd. Na 18 uur in de celkweek incubator, draagt u de zwevende, celbevattende supernatanten over in afzonderlijke 1,5-milliliter microcentrifugebuizen voor centrifugatie, gevolgd door resuspendering van de pellets in 70 microliter kunstmatig extracellulair matrix per buis op ijs. Om de levensvatbaarheid van colorectale kankercellen te verbeteren, legt u de tumorcelbevattende kunstmatige extracellulaire matrix op de tumor organoïden in de 12-putsplaat en plaatst u de plaat in de celkweek incubator gedurende 30 minuten.

Wanneer de kunstmatige extracellulaire matrix coating is gestold, voedt u de culturen met één milliliter vers CRC organoïden kweekmedium gesupplementeerd met 1%FCS, en brengt u de cellen terug naar de celkweek incubator gedurende drie dagen. Observeer vervolgens de geïnfecteerde cellen door middel van fluorescentiemicroscopie om een bijna 100%GFP positiviteit te bevestigen, en brengt u de cellen terug naar de incubator voor nog eens vier tot zes dagen. Om een spontaan metastase muismodel van CRC patiënt-afgeleide tumor xenografts te vestigen, dissocieert u de GFP-gelabelde organoïden zoals gedemonstreerd, en verdunt u de enkele tumorcel suspensies bij een vijf keer 10 tot vijf tumorcellen per 50 microliter PBS gesupplementeerd met 50% kunstmatige extracellulaire matrix concentratie.

Laad 50 microliter cellen per muis in een spuit uitgerust met een 22-gauge naald, en plaats de tumorcellen op ijs. Bevestig vervolgens het ontbreken van reactie op teenknijpen, en plaats de eerste anesthetiseerde NOG muis in de rugligging op de laboratoriumbank. Trek met steriele pincetten voorzichtig de rectale mucosa uit de anus en injecteert u de tumorcellen onmiddellijk in de rectale submucosa.

Om een experimenteel metastase model van CRC patiënt-afgeleide tumor xenografts te vestigen, verdunt u de enkele tumorcel suspensies bij een vier keer 10 tot vier cellen per 50 microliter concentratie, en laad 50 microliter cellen per muis in een spuit uitgerust met een 22-gauge naald. Plaats de eerste anesthetiseerde NOG muis in een buikligging op de bank en maakt u een kleine insnijding in de onderste regio van de linkerflank. Gebruik steriele schaar en pincetten om voorzichtig het peritoneum te snijden en de milt bloot te leggen, en gebruik de pincetten om het vet vast te grijpen dat aan de milt is gehecht.

Injecteer vervolgens langzaam 50 microliter van de tumorcel suspensie in de milt, en zorg ervoor dat er geen lekkage wordt waargenomen. Nadat alle muizen zijn geïnjecteerd en indien nodig zijn genaaid, brengt u de dieren terug naar hun thuiscassen en controleert u op lekkage van de hechtingen en levensvatbaarheid één dag na de lever