Name: Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Leer hoe je mitochondriale zuurstofverbruik meet in permeabel thoraxweefsel van Drosophila met hoogresolutie-respirometrie. Deze methode vereist minimale weefselhoeveelheden en levert fysiologisch relevantere resultaten op.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd gefinancierd door subsidies van de National Sciences, de Engineering Research Council (NSERC, ontdekking subsidie) en de Université de Moncton aan NP. LHB wil de financiële steun van het Canadees Instituut voor gezondheid onderzoek (CIHR), de Stichting van de innovatie van New Brunswick (NBIF) en de Université de Moncton erkennen. Het werk van EHC wordt ondersteund door de Alzheimer Society of Canada, hersenen Canada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick innovatie Foundation, New Brunswick Health Research Foundation en de Université de Moncton.

1. reagentia voorbereiding
<ol><li>De volgende oplossingen voorbereiden op dissectie en permeabilization van het weefsel.<ol>
<li>Bereiden van behoud oplossing: 2,77 CaK2EGTA, 7.23 mM K2EGTA, 5.77 mM nb2ATP, 6.56 mM MgCl2, taurine, 20 mM 15 mM nb2phosphocreatine, 20 mM imidazool, 0.5 mM dithiothreitol, en 50 mM K-MES, pH 7.1 (kan worden opgeslagen bij-20 ° C).</li>
		<li>Bereid saponine oplossing: 5 mg saponine in 1 mL behoud oplossing (bereiden verse dagelijks).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de volgende oplossingen voor het meten van de ademhaling.<ol>
<li>Bereiden van ademhaling medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2en 0,2% BSA (w/v), pH 7,2.</li>
		<li>Bereiden substraten, uncoupler, remmers. Los van alle substraten in H2O en los van de uncoupler FCCP, alsmede de remmers in ethanol absolute (behalve malonaat die is verdund in H2O). Allermeest naar de substraten, evenals malonaat (Zie Tabel van materialen) te neutraliseren. Alle concentraties die in het protocol zijn eindconcentraties binnen 2 mL kamers.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding en kalibratie van de hoge-resolutie Respirometer.
<ol><li>Het wassen van de kamers, caps en stoppen van de respirometer drie keer met 70% ethanol en driemaal met gedestilleerd water.</li>
	<li>Kalibreren op nul zuurstofconcentratie: Pipetteer 2,3 mL voor ademhaling medium in de kamers en 10 mg natrium dithioniet toe te voegen. Hoewel het maximale volume van de kamer is 2 mL, worden 2,3 mL toegevoegd om ervoor te zorgen dat geen luchtbel blijft onder de stop bij het sluiten van de kamers. Sluit de kamers met de stoppers en meten van de zuurstofconcentratie voor 10-20 min. kalibreren de elektroden op nul zuurstofconcentratie met de resulterende zuurstof verbruik tarief.</li>
	<li>De kamers met distillated water wassen, incubeer in absolute ethanol gedurende 10 minuten en spoel na met gedestilleerd water.</li>
	<li>Kalibreren op lucht verzadiging: Pipetteer 2,3 mL voor ademhaling medium in de kamers, de stoppers invoegen, gecombineerd het overtollige medium op de top van de stoppers en til de stoppen met het tussenstuk. Overtollige ademhaling medium is afgepipetteerde in de kamers (volume van 2 mL totaal) om te voorkomen dat de aanwezigheid van luchtbellen na het sluiten van de kamers.</li>
	<li>Controleren van het zuurstofverbruik gedurende 45 minuten tot een uur, totdat de zuurstofconcentratie (blauwe trace) stabiel rond 250 is nM bij 24 ° C.</li>
</ol>3. dissectie van vliegen en Permeabilization van weefsel
<ol><li>Zorg ervoor dat alle maatregelen worden uitgevoerd op het ijs.</li>
	<li>Anaesthetize zes mannelijke vliegen van dezelfde stam, hetzelfde leeftijd en getogen op hetzelfde dieet op ijs ter vergemakkelijking van de dissectie van de vliegen (wild-type w1118, 15 dagen oud, gevoed op de drager van maïsmeel).</li>
	<li>Met behulp van een scalpel en pincet boete-tipped, ontleden de vliegen (Verwijder de hoofden en de buikjes) om te houden alleen de thoraxes met de vlucht spieren. Deze stap kan worden gedaan met het blote oog. De resulterende thoraxes behandelen met een boete-tipped Tang.</li>
	<li>Overdracht drie ontleed thoraxes in een 25 mm petrischaal met 2 mL ijskoud behoud oplossing met behulp van de verlostang.</li>
	<li>Met de fine-tipped Tang, mechanisch permeabilize de thoraxes door het invoegen van het uiteinde van de verlostang in de thoraxes en herhaaldelijk scheuren het weefsel om te verkrijgen van een losjes verbonden netwerk.</li>
	<li>In een 24-well plaat, door twee putten te vullen met 12,5 µL van het Zeepkruid oplossing en 1 mL behoud oplossing om een eindconcentratie van 62,5 µg/mL saponine. Vul de twee aangrenzende putten met 1 mL van ademhaling medium.</li>
	<li>Met de fine-tipped Tang, drie permeabel thoraxes Pipetteer in de oplossing van verdunde saponine en incubeer met milde agitatie op een rondschudapparaat, op ijs, voor 20 min.</li>
	<li>Na de laatste incubatie, overdracht van de vezels in de aangrenzende putten gevuld met het medium van de ademhaling met milde agitatie, op ijs, voor 5 min te spoelen uit de saponine.</li>
</ol>4. bepaling van het droog gewicht
<ol><li>De permeabilized thoraxes op een absorberend oppervlak droog en flip 3 - 4 keer met behulp van de verlostang boete getipt om ervoor te zorgen dat alle vocht wordt verwijderd.</li>
	<li>De drie thoraxes samen op een microbalans wegen. Opmerking het verkregen gewicht zoals het zal worden gebruikt om te normaliseren van de mitochondriale zuurstof verbruik.</li>
	<li>Het weefsel onmiddellijk in een daling van ademhaling medium overbrengen op het ijs.</li>
</ol>5. zuurstof verbruik tarieven bepaling
<ol><li>Openen van de kamers van de respirometer (Verwijder de stoppen) en voeg van 10 mM van pyruvaat en 2 mM malate in elke kamer.</li>
	<li>Voeg de permeabilized weefsels direct in de kamers gevuld met het medium van de ademhaling.</li>
	<li>Vervang de stoppen met behulp van het tussenstuk.</li>
	<li>Met een injectiespuit 60 mL zuurstof rechtstreeks ophalen in een zuurstoftank en injecteren van 2-5 mL zuurstof via de capillaire stop van elke kamer om ervoor te zorgen dat er zuurstof verspreiding via het weefsel zuurstofverbruik niet zal verkleinen.</li>
	<li>Plaats een Hamilton injectiespuit in het capillair van elke Stop om ervoor te zorgen dat de thoraxes in de bedwelmingsruimte blijven.</li>
	<li>De kamers volledig afsluiten wanneer de zuurstofconcentratie ongeveer 400 is nM, zuurstofniveaus boven lucht verzadiging bereiken (ongeveer 160% verzadiging lucht) binnen de kamers.</li>
	<li>Stoppen en herstarten van de stirrers om te controleren op luchtbellen in de kamers.</li>
	<li>Voer de massa van weefsel woog eerder om het normaliseren van de tarieven van de ademhaling door de massa van weefsel (mg), massa-specifieke zuurstofverbruik (pmol O2 consumed.s-1.mg-1 van weefsel) weer te geven.</li>
	<li>Zodra het zuurstofverbruik is gestabiliseerd (rode trace), voeg 5 mM ADP met een spuit van Hamilton.</li>
	<li>Na iedere injectie, spoel het spuiten met gedestilleerd water, 70% ethanol, en gedestilleerd water weer.</li>
	<li>Zodra het zuurstofverbruik stabiel weer is, injecteren 5 µL van een 4 mM van cytochroom c.</li>
	<li>Overgaan tot de sequentiële injecties van de volgende substraten te evalueren van de mitochondriale zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS:<ol>
<li>Voeg 5 µL van een Proline 2 M.</li>
		<li>Voeg 10 µL van een 1 M-succinaat.</li>
		<li>Voeg 30 µL van een 1 M glycerol-3-fosfaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injecteren van de uncoupler FCCP in een titratie wijze door stappen van 0,5-1 µM (2 µL van een oplossing van 1 mM) totdat de optimale concentratie is bereikt, dat wil zeggen, de concentratie te bereiken van de hoogste mogelijke zonder remming zuurstofverbruik (Let op: Zie tabel van materialen).</li>
	<li>Injecteer de volgende remmers opeenvolgend om de flux van het elektron in de ETS volledig te remmen om te meten de residuele zuurstofverbruik (ROX) dat wil zeggen niet-respiratoire reacties zoals oxygenase reacties onder andere:<ol>
<li>Voeg 1 µL van een 1 mM rotenon (Let op: Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Voeg 5 µL van een 2 M malonaat (Let op: Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Voeg 1 µL van een 5 mM antimycin A (Let op: Zie Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.2 mM ascorbaat en 0,5 mM TMPD achter elkaar naar de kamers, beginnend met de ascorbaat voor het meten van het zuurstofverbruik door complexe IV toevoegen.</li>
	<li>Toevoegen van 20 mM van natriumazide voor de remming van complexe IV (Let op: Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Zodra het signaal stabiel is, openen de kamers met de spacer opnieuw de kamers zuurstof door het injecteren van 2 mL zuivere zuurstof en de kamers sluiten wanneer de concentratie ongeveer is 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Het signaal voor 10-15 min te meten en berekenen van de chemische achtergrond, dat wil zeggen, het zuurstofverbruik als gevolg van autoxidation van TMPD.</li>
</ol>6. het reinigen van de Respirometer
<ol><li>Na de metingen, eenmaal spoelen van de kamers met gedestilleerd water en spoel de kamers driemaal in 70% ethanol.</li>
	<li>Incubeer in absolute ethanol voor 10 min naar de inactivering van de remmers.</li>
	<li>Spoel driemaal met gedestilleerd water, vul de kamers met 70% ethanol en vervangen de stoppers en de doppen tot volgend gebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+fly+through+its+history+and+current+use%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+the+Royal+College+of+Physicians+of+Edinburgh%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1400110404/abstract">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li>
<li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li>
<li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Neuronal+Cell+Fate%3A+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li>
<li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li>
<li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22251459">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li>
<li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li>
<li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage%3A+importance+in+non-SOD1+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li>
<li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li>
<li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inflexibility%3A+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li>
<li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li>
<li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li>
<li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BAlternative%26%2334%3B+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport%3A+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">&#34;Alternative&#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti%3A+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).</li>
<li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/phen.12127/abstract">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li>
<li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+as+a+fuel+for+insect+flight%3A+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).</li>
<li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li>
<li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+isolation%2C+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences%3A+insight+into+functional+properties+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li>
<li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li>
<li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation%3A+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+proline%2C+a+stress+substrate%2C+modulates+carcinogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li>
<li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease%3A+To+carry+or+not+to+carry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit onderzoek is een methode voor de bereiding van de monsters vóór de meting van de mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila beschreven. Deze methode werd ontwikkeld om te overwinnen van de verschillende problemen in verband met de protocollen die met behulp van mitochondriale isolatie, met name wat betreft de duur en aantal personen vereist. In plaats van het werken met mitochondriale isolatie meestal vereisen grote hoeveelheid weefsels verkregen uit meerdere personen, wordt dit experiment uitgevoerd op permeab...

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, is gebruikt als een modelorganisme voor genetisch onderzoek voor meer dan een eeuw1. De studie van dit organisme heeft niet alleen geleid tot belangrijke fundamentele kennis over geslachtsgebonden overerving2, mutatie tarief3, de ontwikkeling van neurale systeem en de cel lot bepaling4, maar ook onlangs heeft ontpopt als een waardevol instrument te bestuderen van de mechanismen die inherent zijn aan verschillende ziekten zoals Alzheimer en Parkinson5,6. Bovendien is het een populair model te bestuderen van het verouderingsproces, zoals ze in groot aantal over een korte periode van tijd kunnen worden verhoogd en een korte levensduur hebben. Zij bezitten ook homologe structuren aan menselijke organen, zoals een hart oenocytes (hepatocyte-achtige cellen), fat organen (functioneren op dezelfde manier als de lever en wit vetweefsel), de insuline producerende cellen (equivalent aan β-pancreatic cellen), evenals de Hemolymfe transport van metabolieten (analoog aan het bloed van gewervelde dieren)7. Bovendien is de centrale trajecten van intermediaire metabolisme (met inbegrip van de insuline/insuline-achtige groeifactor-achtige signalering traject en doel van Rapamycin-TOR trajecten) zijn ook zeer geconserveerde7. Om deze redenen hebben onlangs Drosophila benut om te beschrijven de fundamentele mechanismen waarmee metabolisme, vooral in pathologische omstandigheden die inherent zijn aan menselijke metabole ziekten zoals diabetes,8. Een belangrijk onderdeel van het metabolisme is het mitochondrion die integreert meerdere trajecten en voert een van life's meest belangrijke biologische functies, productie van ATP, via de oxidatieve fosforylatie proces (OXPHOS). Gezien hun centrale rol in het metabolisme van het organisme is het niet verwonderlijk dat mitochondriale stoornissen zijn betrokken in vele ziekten zoals Parkinson,9 en10ziekten van Alzheimer, evenals in Amyotrofische laterale sclerose 11 , 12. ze zijn ook fundamentele determinanten van het verouderingsproces. Inderdaad, ze zijn de belangrijkste producenten van reactieve zuurstof soorten (ROS) in de cel, die schadelijk voor de cel in hoge concentraties t/m11van de oxidatieve schade zijn kan. Veroudering is ook gekoppeld aan de accumulatie van beschadigde of gemuteerde mitochondriaal DNA-13, mitophagy disfuncties14,15 , alsmede bijzondere waardevermindering van mitochondriale biogenese16geweest. Mitochondriën zijn ook belangrijke determinanten van de cel van de homeostase als ze kunnen gebruik maken van verschillende substraten om aan te passen van de verschillende cellulaire functies aanroept volgens de overvloed of schaarste van macronutriënten17,18.
Inderdaad, de verschillende voedingsstoffen in de voeding (koolhydraten, lipiden en eiwitten) zijn verteerd, geabsorbeerd en vervoerd in de cellen. Ze worden vervolgens getransformeerd in het cytosol en de afgeleide substraten worden getransporteerd naar de mitochondriale matrix waar ze verminderen equivalenten, zoals NADH en FADH2-19 produceren. Deze vermindering equivalenten zijn vervolgens geoxideerd door verschillende enzymatische complexen van het elektronentransport systeem (ETS). Deze complexen zijn ingebed in de mitochondriale binnenste membraan, zoals Complex I en complexe II. Bovendien vertegenwoordigen andere enzymatische complexen zoals de mitochondriale glycerol-3-fosfaat dehydrogenase en de proline dehydrogenase alternatieve routes voor de toetreding van de elektronen in de ETS20,21. Deze 'alternatieve' complexen zijn met name belangrijk bij insecten, als gelang van de diersoort, zij kunnen actief deelnemen te verhogen van de ademhaling20,22,23,21. Elektronen uit deze ETS Voersystemen worden overgebracht naar de ubiquinone en vervolgens complexe III, en vervolgens naar complexe IV, tot de definitieve acceptor, moleculaire zuurstof. Deze elektronen overdracht genereert een proton-stuwende kracht over de innerlijke mitochondriale membraan de fosforylatie van ADP rijden naar ATP bij complexe V (Figuur 1). Gezien de centrale rol van mitochondria in cel homeostase, bestuderen van mitochondriale metabolisme met behulp van het relevante model D. melanogaster vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel om af te bakenen de onderliggende mechanismen van diverse pathofysiologische voorwaarden of onder cellulaire en milieu benadrukt. Verrassend echter slechts een handvol studies gemeten eigenlijk mitochondriale ademhaling in Drosophila24,25,26. Inderdaad, moeten experimenten gericht op het beoordelen van de mitochondriale zuurstofverbruik het isolement van de mitochondriën. Hoewel voordelig voor het meten van verschillende mitochondriale functies (zoals ROS productie of P/O verhouding als markering van mitochondriale efficiëntie27,28), vereisen deze isolatie in het algemeen liever grote hoeveelheden van weefsel van verschillende individuen24,29. Deze eis voor grote hoeveelheden weefsel en individuen is een belangrijke beperkende factor, vooral gezien het feit dat alle individuen dezelfde leeftijd moeten worden en bij voorkeur van hetzelfde geslacht voor de experimenten, waardoor de maatregel van de ademhaling op verschillende tijden moeizame wijst op zijn best. Bovendien, terwijl mitochondriale isolatie significante inzicht in de fundamentele mechanismen bestuur mitochondriale metabolisme bieden kunnen, de gebruikte methoden voor het isoleren van de mitochondriën hebben enkele nadelen zoals de moeilijkheid om repliceerbaar resultaten te verkrijgen , verstoring van de mitochondriale netwerk, en wijziging van mitochondriale structuur en functie29,30,31.
Het doel van deze studie is te presenteren van een robuust protocol voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik in Drosophila met behulp van slechts een minimale hoeveelheid weefsel van zeer weinig individuen. Dit protocol bestaat uit het meten van mitochondriale zuurstof verbruik in situ spiervezels permeabel29 van Drosophila thoraxes gebruiken in combinatie met hoge resolutie respirometrie32,33, 34 , 35. deze methode heeft ook extra voordelen in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-methode omdat de interacties met de andere componenten van de cel als goed als mitochondriale structuur en functie worden meer bewaard in permeabel vezels29,31,36, waardoor deze aanpak meer fysiologisch relevante. Met dit protocol, kunnen mitochondriale functies nauwkeurig getoetst met behulp van hoge-resolutie respirometrie in slechts drie thoraxes van Drosophila, met substraten toestaan van de bepaling van zuurstofverbruik in verschillende stappen van de ETS. Daarom kon dit protocol helpen beantwoorden van belangrijke vragen over de fundamentele mechanismen waarmee de stofwisseling in het kader van vele milieu- of pathofysiologische omstandigheden door te profiteren van de Drosophila model.
Meten van het zuurstofverbruik in verscheidene verschillende stappen van de ETS en evalueren van hoe verschillende substraten bijdragen aan de ademhaling, de verschillende substraten (Figuur 1), de uncoupler, en remmers zijn gebruikte30 na permeabilization van de weefsel. Specifiek, worden opeenvolgende toevoegingen van verschillende substraten uitgevoerd om het stimuleren van de toetreding van elektronen door verschillende complexen van de ETS. Een uncoupler, carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), wordt vervolgens toegevoegd aan de optimale concentratie voor het meten van de ademhaling niet-gekoppeld, dat wil zeggen, de niet-phosphorylating ademhaling gestimuleerd om maximaal zuurstofverbruik. Opeenvolgende remmingen van complexen die i, II en III worden vervolgens uitgevoerd om te controleren de residuele zuurstofverbruik thats als gevolg van de niet-ETS oxidatiereacties. Ten slotte, complexe IV maximale ademhaling capaciteit kan worden geëvalueerd door de injectie van N, N, N', N, - Tetramethyl - p-fenyleendiamine (TMPD), een kunstmatige elektron provider, en ascorbaat. Het is belangrijk op te merken dat de experimenten zijn uitgevoerd op 24 °C omdat het de temperatuur waarop de vliegen zijn gerezen.

<table><tbody><tr><td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>10022-02</td><td>Startup O2K respirometer kit &nbsp;</td></tr><tr><td>O2K-Titration Set&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>20820-03</td><td>Hamilton-spuitpompjes met verschillende volumes &nbsp;</td></tr><tr><td>Datlab software</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Oostenrijk</td><td>20700</td><td>Software voor data-acquisitie en analyse &nbsp;</td></tr><tr><td>Fijne antimagnetische pincet</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Goettingen, Duitsland</td><td></td><td>Semi-micro balans (verspreid door verschillende bedrijven)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><td> Opslagconditie: 24 &deg;C</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>VOORZICHTIG: corrosief voor metalen, acute toxiciteit, huidcorrosie, ernstige oogbeschadiging, acute aquatische toxiciteit. Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> Opslagconditie: -20 &deg;C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> Opslagconditie: -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> Opslagconditie: 2-8 &deg;C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Saponine uit quillaja-bast</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponine Opslagconditie: RT Oplossingsvoorbereiding: 5 mg in 1 mL conserveringsoplossing. Dagelijks vers bereiden.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> Opslagconditie: 2-8 &deg;C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Natriumdithioniet. VOORZICHTIG: zelfverwarmende stoffen en mengsels, acute toxiciteit, acute aquatische toxiciteit, chronische aquatische toxiciteit. Opslagconditie: RT</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pyrovaat Opslagconditie: 2-8 &deg;C Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Dagelijks vers bereiden.</td></tr><tr><td>L-(-)-Appelzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malaat Opslagconditie: RT Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Neutraliseren met KOH en bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Adenosine 5'-difosfaat monokaliumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Opslagconditie: -20 &deg;C Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Neutraliseren met KOH en bewaren bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cytochroom c uit paardenhart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochroom c Opslagconditie: -20 &deg;C Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline Opslagconditie: RT Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Natriumsuccinaat dibasisch hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Succinaat Opslagconditie: RT Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Neutraliseren met HCl en bewaren bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>sn-Glycerol 3-fosfaat bis(cyclohexylammonium) zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glycerol-3-fosfaat Opslagconditie: -20 &deg;C Oplossingsvoorbereiding: In MilliQ-water. Neutraliseren met HCl en bewaren bij -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. VOORZICHTIG: acute toxiciteit, huidsensibilisatie, chronische aquatische toxiciteit. Opslagconditie: RT Oplossingsvoorbereiding: In absoluut ethanol. Bewaren in glazen flesjes bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>VOORZICHTIG: acute toxiciteit, huidirritatie, oogirritatie, specifieke doelorgaantoxiciteit (ademhalingssysteem), acute aquatische toxiciteit, chronische aquatische toxiciteit. Oplossingsvoorbereiding: In absoluut ethanol. Bewaren in donkere flesjes bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Malonzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonaat. VOORZICHTIG: acute toxiciteit, ernstige oogbeschadiging. Opslagconditie

meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

De fruitvlieg, Drosophila melanogaster, vertegenwoordigt een opkomende model voor de studie van het metabolisme. Inderdaad, drosophila structuren homoloog aan menselijke organen hebben, beschikken over zeer geconserveerde stofwisselingsroutes en hebben een relatief korte levensduur waarmee de studie van verschillende fundamentele mechanismen in een korte periode van tijd. Het is echter verrassend dat een van de mechanismen die essentieel zijn voor cellulaire metabolisme, de mitochondriale ademhaling, niet grondig in dit model onderzocht is. Het is waarschijnlijk omdat de maatregel van de mitochondriale ademhaling in Drosophila meestal een zeer groot aantal personen vereist en de resultaten niet zeer reproduceerbaar zijn. Hier, wordt een methode waardoor de nauwkeurige meting van mitochondriale zuurstofverbruik met minimale hoeveelheden weefsel van Drosophila beschreven. Bij deze methode worden de thoraxes ontleed en permeabel, zowel mechanisch met scherpe pincet en chemisch saponine, waardoor verschillende verbindingen te steken van het celmembraan en het moduleren van de mitochondriale ademhaling. Na permeabilization, wordt een protocol uitgevoerd om te evalueren van de capaciteit van de verschillende complexen van het elektronentransport systeem (ETS) om te oxideren verschillende substraten, evenals hun reactie op een uncoupler en verschillende remmers. Deze methode biedt veel voordelen ten opzichte van methoden met behulp van mitochondriale isolatie, aangezien er meer fysiologisch relevant omdat de mitochondriën zijn nog steeds interactie met de andere cellulaire componenten en de mitochondriale morfologie is geconserveerd. Bovendien staalvoorbereiding zijn sneller, en de verkregen resultaten zijn zeer reproduceerbaar. Door het combineren van de voordelen van Drosophila als een model voor de studie van het metabolisme met de evaluatie van de mitochondriale ademhaling, belangrijke nieuwe inzichten kunnen worden onthuld, vooral wanneer de vliegen ondervindt verschillende milieu- of pathofysiologische voorwaarden.

Een representatieve spoor van mitochondriale zuurstofverbruik met behulp van het protocol die hierboven beschreven wordt gegeven in Figuur 2. De pyruvaat en malate geïnjecteerd in de kamers samen met de permeabilized spiervezels zijn bedoeld om de CI-lek ademhaling, dat wil zeggen, wanneer het complex I van de ETS wordt gestimuleerd door de NADH geproduceerd door oxidatie van pyruvaat en malate via de tricarboxylic acid cyclus (CI). Tijdens deze adem...

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Het algemene doel van deze procedure is om mitochondriale ademhaling in de gewone fruitvlieg, Drosophila Melanogaster, te evalueren met behulp van hoge resolutie respirometrie. Dit wordt bereikt door eerst de Drosophila te dissecteren om de thorax te verzamelen. De thoraces die de vliegspieren bevatten, worden vervolgens zorgvuldig mechanisch gepermeabiliseerd, met scherpe pincetten, en geïncubeerd met saponine voor verdere permeabilisering. De thoraces worden vervolgens overgebracht naar de kamers van een respirometer en mitochondriale zuurstofconsumptie wordt gemeten met een combinatie van verschillende substraten, ontkoppelers en remmers. Hoi, ik ben Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

Analyse van de structureel-functionele relatie van de mitochondriën is vereist voor een grondig begrip van de regulerende mechanismen van de functionele werking van mitochondriën. Specifieke methoden voor het bestuderen van de structuur en functie van mitochondriën in levende en gefixeerde Drosophila eierstokken worden in dit artikel beschreven en gedemonstreerd.

Het bestuderen van mitochondriale structuur en functie in Drosophila Eierstokken

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Leer hoe je mitochondriale zuurstofverbruik meet in permeabel thoraxweefsel van Drosophila met hoogresolutie-respirometrie. Deze methode vereist minimale weefselhoeveelheden en levert fysiologisch relevantere resultaten op.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Meer video's verkennen